Limosilactobacillus mucosae

npj Biofilms and Microbiomes Band 9, Artikelnummer: 33 (2023) Diesen Artikel zitieren

40 Zugänge

3 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Die Durchfallerkrankung verursacht vor allem bei Kindern und Jungtieren eine hohe Sterblichkeit. Das Darmmikrobiom ist stark mit Durchfallerkrankungen verbunden, und einige spezifische Bakterienstämme haben eine antidiarrhoische Wirkung gezeigt. Allerdings sind die antidiarrhoischen Mechanismen probiotischer Stämme noch nicht aufgeklärt. Hier verwendeten wir neugeborene Ferkel als Translationsmodell und stellten fest, dass die bei Durchfallferkeln beobachtete Darmmikrobiota-Dysbiose hauptsächlich durch einen Mangel an Lactobacillus, eine Fülle von Escherichia coli und eine angereicherte Lipopolysaccharid-Biosynthese gekennzeichnet war. Limosilactobacillus mucosae und Limosilactobacillus reuteri waren ein charakteristisches Bakterium, das gesunde und durchfallkranke Ferkel unterschied. Keimfreie (GF) Mäuse, denen fäkale Mikrobiota von Durchfallferkeln transplantiert wurden, reproduzierten Durchfallsymptome. Die Verabreichung von Limosilactobacillus mucosae, jedoch nicht von Limosilactobacillus reuteri, linderte die Symptome einer Durchfallerkrankung, die durch die fäkale Mikrobiota von Durchfallferkeln und durch die ETEC K88-Provokation hervorgerufen wurden. Insbesondere linderten von Limosilactobacillus mucosae abgeleitete extrazelluläre Vesikel die durch ETEC K88 verursachten Symptome einer Durchfallerkrankung, indem sie die Makrophagen-Phänotypen regulierten. Experimente zur Makrophagen-Eliminierung zeigten, dass die extrazellulären Vesikel die Symptome einer Durchfallerkrankung auf Makrophagen-abhängige Weise linderten. Unsere Ergebnisse liefern Einblicke in die Pathogenese von Durchfallerkrankungen aus der Perspektive der Darmmikrobiota und die Entwicklung probiotikabasierter antidiarrhoischer Therapiestrategien.

Durchfallerkrankungen kommen bei Säuglingen häufig vor. Weltweit werden jedes Jahr mehr als 500.000 Todesfälle aufgrund von Durchfallerkrankungen bei Kindern unter 5 Jahren gemeldet1,2,3. Neben der hohen Sterblichkeit führen Durchfallerkrankungen im frühen Kindesalter zu Mangelernährung und anhaltenden Darmschäden4,5,6. Die Durchfallerkrankung führt zu einer Beeinträchtigung der Barrierefunktion des Darms und einer erhöhten Durchlässigkeit der Darmschleimhaut, was den Beginn einer Darmentzündung und letztendlich eine Wachstumsverzögerung sowie eine verminderte Widerstandsfähigkeit gegen nachfolgende Pathogeninfektionen zur Folge hat7,8. Obwohl die Mechanismen, die zu Durchfall führen, seit Jahrzehnten untersucht werden und die Durchfallsterblichkeit deutlich zurückgegangen ist, verursacht Durchfall weiterhin eine erhebliche Mortalität und Morbidität beim Menschen, vor allem aufgrund seiner komplexen Ursachen9,10. Daher ist die Aufklärung der Pathogenese neonataler Durchfallerkrankungen von großer Bedeutung.

Das frühe Leben ist ein Zeitfenster für die Entwicklung der Darmmikrobiota, der physikalischen Barrierefunktion des Darms und des Immunsystems11. Die Darmmikrobiota des Neugeborenen hat tiefgreifende Auswirkungen auf die Gesundheit des Wirts, indem sie den Nährstoffstoffwechsel im Darm, die Reifung des Immunsystems und die Aufrechterhaltung der Darmbarriere reguliert12,13,14,15. Die Instabilität der Darmmikrobiota und die Unreife des Immunsystems machen Neugeborene besonders anfällig für Krankheitserreger16. Wenn Durchfall auftritt, folgt auf die Störung der Zusammensetzung der Darmmikrobiota ein deutlicher Anstieg der Kolonisierung pathogener Mikroorganismen, was darauf hindeutet, dass Störungen der Mikrobiota die Pathogenität dieser Stämme verstärken17. Eine stabile Darmmikrobiota fördert die Gesundheit des Wirts, indem sie die Widerstandsfähigkeit gegen die Besiedlung durch pathogene Mikroorganismen verbessert18,19.

Kürzlich erzielte die fäkale Mikrobiota-Transplantation (FMT) unerwartet positive Ergebnisse bei der Behandlung von Clostridium-difficile-Infektionen, entzündlichen Darmerkrankungen und Reizdarmsyndrom; Daher ist FMT zu einer Routinetherapie bei komplexen Darmerkrankungen geworden20,21,22,23. Es war jedoch eine Herausforderung zu klären, welche Darmmikroorganismen die therapeutische Wirkung während der FMT-Behandlung verleihen. Es gibt zunehmend Hinweise darauf, dass die Rekonstitution der Darmmikrobiota mit wichtigen probiotischen Stämmen eine wirksame Strategie gegen Magen-Darm-Erkrankungen ist24,25. Daher könnte die Identifizierung potenzieller spezifischer Probiotika mit durchfalllinderndem Potenzial neue Strategien für die präzise Kontrolle neonataler Durchfallerkrankungen und die Prävention von Darmerkrankungen liefern.

Bakterielle extrazelluläre Vesikel (EVs) sind an einer Vielzahl pathophysiologischer Funktionen beteiligt, die interzelluläre Wechselwirkungen beinhalten, wie z. B. Nährstoffaufnahme, Abgabe von Virulenzfaktoren und Immunregulation26,27. Insbesondere wurde gezeigt, dass Elektrofahrzeuge die bakterielle Pathogenese und Invasion durch die Abgabe von Toxinen und Virulenzfaktoren an Wirtszellen vermitteln28. Ein Großteil der frühen Arbeiten zu bakteriellen Elektrofahrzeugen konzentrierte sich auf ihre Rolle bei pathogenen gramnegativen Bakterien, doch in jüngster Zeit wurde gezeigt, dass eine zunehmende Zahl grampositiver Bakterien Elektrofahrzeuge produziert. Zu den EV-produzierenden grampositiven Bakterien gehören beispielsweise Bacillus anthracis29, Streptococcus pneumoniae30, B. subtilis31 und C. perfringens32. Lactobacillus ist das häufigste grampositive Bakterium, und kürzlich wurde festgestellt, dass mehrere Lactobacillus-Arten EVs produzieren, wie z. B. L. casei BL2333, L. plantarum WCFS134 und L. acidophilus35. Die möglichen Rollen und Funktionen dieser von Lactobacillus abgeleiteten EVs wurden jedoch nicht umfassend untersucht, obwohl eine aktuelle Studie gezeigt hat, dass einige Lactobacillus-Stämme eine überlegene Wirksamkeit bei der Vorbeugung von Durchfallerkrankungen bei Säugetieren aufweisen24. Daher bedarf die weitere Untersuchung der Frage, ob Lactobacillus mit antidiarrhoischen Eigenschaften ihre Wirkung über ihre Elektrofahrzeuge entfaltet.

Die Ähnlichkeiten in der Darmstruktur und -entwicklung zwischen Menschen und Schweinen machen Schweine zu einem hervorragenden Tiermodell für die Untersuchung der pathophysiologischen Grundlagen von Magen-Darm-Erkrankungen36,37. Hier werden neugeborene Ferkel, keimfreie (GF) Mäuse und spezifiziert pathogenfreie (SPF) Mäuse als Tiermodelle verwendet und durch die Integration von Multi-Omics, fäkaler mikrobieller Transplantation (FMT), enterotoxigenem Escherichia coli K88 (ETEC K88) induziert Durch entzündliche Darmschäden und Eingriffe mit Limosilactobacillus mucosae (L. mucosae) und seinen abgeleiteten EVs wurde in dieser Studie das Darmmikrobiom neugeborener Durchfallferkel systematisch charakterisiert, der kausale Zusammenhang zwischen Darmmikrobiota und Durchfallerkrankungssymptomen weiter aufgedeckt und der zugrunde liegende Mechanismus aufgeklärt Das aus gesunden Ferkeln gewonnene Lactobacillus reduziert die Symptome einer Durchfallerkrankung. Diese Ergebnisse liefern Erkenntnisse darüber, wie Laktobazillen und die daraus abgeleiteten EVs die Darmgesundheit von Säuglingen beeinflussen, und schlagen Strategien zur Vorbeugung und Behandlung von Durchfallerkrankungen vor.

Um die Merkmale der Zusammensetzung und Funktion der Darmmikrobiota bei gesunden und durchfallkranken neugeborenen Ferkeln aufzudecken, führten wir eine metagenomische Sequenzierung von Stuhlproben von 30 gesunden und 30 neugeborenen Ferkeln mit Durchfall durch (Abb. 1A). Auf Stammebene war der Richness-Index signifikant niedriger (P = 0,035), während die Shannon- (P = 0,043) und Simpson-Indizes (P = 0,022) bei Ferkeln mit Durchfall im Vergleich zu gesunden Ferkeln signifikant höher waren (ergänzende Abbildung 1A). Eine Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) zeigte, dass sich auch die mikrobielle Struktur zwischen den beiden Gruppen unterschied (P = 0, 002; ergänzende Abbildung 1B). Firmicutes, Bacteroidetes und Proteobacteria waren in beiden Gruppen der dominierende Stamm (ergänzende Abbildung 1C). Die Anteile von Firmicutes und Actinobacteria waren bei Durchfallferkeln signifikant geringer, während der Anteil von Fusobacteria signifikant höher war (ergänzende Abbildung 1D).

Eine Auswahl gesunder neugeborener und durchfallkranker Ferkel. B Transplantation fäkaler Mikrobiota von gesunden und durchfallkranken Ferkeln auf GF-Mäuse. C Die schützende Wirkung von L. mucosae und L. reuteri auf Darmschäden, die durch fäkale Mikrobiota bei Ferkeln mit Durchfall verursacht werden. D Die schützende Wirkung von L. mucosae auf durch ETEC K88 verursachte Darmschäden. E Die schützende Wirkung von EVs von L. mucosae auf durch ETEC K88 verursachte Darmschäden. F In-vivo-Eliminierung von Makrophagen bei Mäusen.

Auf Gattungsebene war der Richness-Index bei neugeborenen Ferkeln mit Durchfall signifikant niedriger (P = 0,000) und der Simpson-Index (P = 0,018) signifikant höher (ergänzende Abbildung 2A). Es gab auch signifikante Unterschiede in der Struktur der Mikrobiota auf der Ebene der Gattungen zwischen den beiden Gruppen (P = 0,000; ergänzende Abbildung 2B). Lactobacillus, Escherichia und Bacteroides waren die dominierenden Gattungen bei neugeborenen Ferkeln mit Durchfall, während Lactobacillus, Bacteroides und Prevotella die dominanten Gattungen bei gesunden neugeborenen Ferkeln waren (ergänzende Abbildung 2C). Wir identifizierten 21 unterschiedliche Bakteriengattungen zwischen gesunden und durchfallkranken neugeborenen Ferkeln (ergänzende Abbildung 2D). Im Vergleich zu gesunden neugeborenen Ferkeln zeichneten sich neugeborene Ferkel mit Durchfall durch fünf angereicherte Gattungen (Vagococcus, Sutterella, Megasphaera, Fusobacterium und Allisonella) und durch 16 abgereicherte Gattungen (Streptococcus, Slackia, Ruthenibacterium, Peptostreptococcus, Lactobacillus, Holdemanella, Gemella, Faecalicoccus, Erysipelatoclostridium) aus , Eisenbergiella, Collinsella, Clostridium, Christensenella, Campylobacter, Anaerotruncus und Anaeromassilibacillus).

Auf Artenebene war der Richness-Index bei den Durchfallferkeln signifikant niedriger (P = 0,001) als bei den gesunden Ferkeln (Abb. 2A). Wir fanden auf dieser Ebene signifikante Unterschiede in der mikrobiellen Struktur zwischen den beiden Gruppen mittels PCoA-Analyse (P = 0,001; Abb. 2B). Wir beobachteten, dass die relative Häufigkeit von E. coli bei Durchfallferkeln am höchsten und L. vaginalis bei gesunden Ferkeln am höchsten war (Abb. 2C). Darüber hinaus stellten wir fest, dass die relativen Häufigkeiten von insgesamt 31 Arten zwischen den beiden Gruppen signifikant unterschiedlich waren (Abb. 2D). Zufällige Waldanalysen zeigten, dass mehrere Schlüsselarten, darunter Ruthenibacterium lactatiformans, Limosilactobacillus reuteri (L. reuteri) und L. mucosae, möglicherweise eine wichtige Rolle bei der Vermittlung des Ausbruchs von Durchfall spielen (Abb. 2E). Die Genauigkeit des zufälligen Waldklassifizierungsmodells, das unter Verwendung dieser 20 Bakterien als Variablen erstellt wurde, wurde durch ROC-Analysen (Receiver Operating Characteristic Curve) getestet. Es wurde festgestellt, dass der AUC-Wert 0,967 erreichte, was auf die hohe Genauigkeit unseres Modells hinweist (Abb. 2F).

Ein Vergleich der Alpha-Diversität (Richness, Shannon und Simpson) der Darmmikrobiome auf Artenebene zwischen gesunden und durchfallkranken neugeborenen Ferkeln. B PCoA-Analyse des Darmmikrobioms zwischen gesunden und durchfallkranken neugeborenen Ferkeln auf Artenebene; Die Daten wurden mit PERMANOVA analysiert. C Histogramm der Artenzusammensetzung der Top-20-Bakterienarten. D Unterschiedliche Bakterienarten zwischen den beiden Gruppen. E Schlüsselarten aus zufälligen Waldanalysen. Für das Random-Forest-Modell wurde eine F-ROC-Analyse durchgeführt. G Die 20 wichtigsten KEGG-Pfade, angereichert durch differenzielle KOs. H LPS-Gehalt im Stuhl. n = 30. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM (H) ausgedrückt und eine einfaktorielle ANOVA durchgeführt, gefolgt von einem LSD-Test (H). *P < 0,05, Durchfallgruppe vs. gesunde Gruppe.

Insgesamt wurden 410 Orthologe (KOs) der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) identifiziert, die sich zwischen den beiden Gruppen erheblich unterschieden (Ergänzungstabelle 1). Eine KEGG-Funktionsanalyse ergab außerdem, dass sich die Anreicherung der folgenden Wege zwischen den beiden Gruppen deutlich unterschied: Biosynthese von Cofaktoren, Biosynthese von Aminosäuren, Kohlenstoffstoffwechsel, Aminozucker- und Nukleotidzuckerstoffwechsel, Ribosom, oxidative Phosphorylierung, O-Antigen-Nukleotidzuckerbiosynthese , Cystein- und Methioninstoffwechsel, Glykolyse/Glukoneogenese, Pyruvatstoffwechsel, Flagellenaufbau, Citratzyklus, Aminoacyl-tRNA-Biosynthese, Pentosephosphatweg, homologe Rekombination, Fehlpaarungsreparatur, Lipopolysaccharidbiosynthese, Thiaminstoffwechsel, ein Kohlenstoffpool durch Folat und die Caulobacter-Zelle Zyklus (Abb. 2G). Wir beobachteten außerdem, dass alle im Lipopolysaccharid (LPS)-Biosyntheseweg angereicherten KOs bei neugeborenen Ferkeln mit Durchfall erhöht waren (Ergänzungstabelle 1). Dementsprechend war der LPS-Gehalt im Stuhl bei den Durchfallferkeln im Vergleich zu den gesunden Ferkeln signifikant höher (P < 0,05; Abb. 2H).

Um die Wirkung der Darmmikrobiota von Durchfallferkeln auf das Wirtswachstum und den Entzündungsstatus zu bewerten, führten wir ein FMT-Experiment durch (Abb. 1B). Wir fanden heraus, dass die Wachstumsrate des Körpergewichts der H-FMT-Gruppe ab dem 5. Tag deutlich höher war als die der D-FMT-Gruppe, und dieser Geschwindigkeitsunterschied blieb bis zum Ende des Experiments bestehen (Abb. 3A). Wir haben routinemäßige biochemische Parameter im Blut gemessen (Abb. 3B); Gesamtzahl der weißen Blutkörperchen (WBC) (P = 0,001), Lymphozyten (LYM) (P = 0,049), neutrophile Granulozyten (NEU) (P = 0,041), Monozyten (MON) (P = 0,000) und MON% (P = 0,039) waren in der D-FMT-Gruppe signifikant höher.

A Körpergewichte von Mäusen während des Versuchszeitraums. B-Werte von WBC, LYM, NEU, MON, LYM %, NEU % und MON % im Blut von Versuchsmäusen. C Volcano-Diagramm der Differenzialgene in fünf Darmsegmenten. Blau kennzeichnet Gene, die in der D-FMT-Gruppe deutlich herunterreguliert sind, und Rot kennzeichnet Gene, die in der D-FMT-Gruppe deutlich hochreguliert sind. D KEGG-Signalwege, angereichert mit fünf Differenzialgenen für das Darmsegment. Die Größe der Kreise stellt die Anzahl der im Signalweg angereicherten Gene dar, und die Farbe steht im Zusammenhang mit P_adjust. n = 10 für A, B; n = 4 für C, D. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM (A, B) ausgedrückt und eine einfaktorielle ANOVA durchgeführt, gefolgt von einem LSD-Test (A, B). *P < 0,05: H-FMT-Gruppe vs. D-FMT-Gruppe.

Wir sequenzierten und analysierten die Transkriptome von Wirtszellen aus dem Zwölffingerdarm, Jejunum, Ileum, Blinddarm und Dickdarm beider Mäusegruppen. Die Genprofile in diesen fünf Darmsegmenten zeigten nach FMT unterschiedliche Muster (Abb. 3C). Wir fanden heraus, dass es im Zwölffingerdarm 134 differenzielle Gene gab, von denen in der D-FMT-Gruppe 79 Gene signifikant hochreguliert und 55 Gene signifikant herunterreguliert waren. Es gab 309 differenzielle Gene im Jejunum, wobei in der D-FMT-Gruppe 176 Gene signifikant hochreguliert und 133 Gene signifikant herunterreguliert waren. Es gab 1609 Differenzialgene im Ileum, wobei in der D-FMT-Gruppe 670 Gene signifikant hochreguliert und 939 Gene signifikant herunterreguliert waren. Es gab 204 Differenzialgene im Blinddarm, wobei in der D-FMT-Gruppe 95 Gene signifikant hochreguliert und 109 Gene signifikant herunterreguliert waren. Es gab 812 differenzielle Gene im Dickdarm, wobei in der D-FMT-Gruppe 570 Gene signifikant hochreguliert und 242 Gene signifikant herunterreguliert waren.

Wir haben die Wege kommentiert, an denen diese Differenzgene beteiligt sind (Abb. 3D) und festgestellt, dass mehrere Signalwege in allen fünf Darmsegmenten signifikant angereichert waren, darunter der NF-κB-Signalweg, der Phospholipase-D-Signalweg, Zelladhäsionsmoleküle, B Zellrezeptor-Signalwege, der Fc-epsilon-RI-Signalweg, der Phosphoinositid-3-Kinase/Akt-Signalweg und Kalzium-Signalwege. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die wichtigsten differenziellen Gene, die an den oben genannten Signalwegen beteiligt sind, in allen Darmsegmenten beobachtet wurden (ergänzende Abbildung 3).

Wir fanden heraus, dass die Länge der Ileumzotten bei Mäusen der D-FMT-Gruppe signifikant verkürzt war (P = 0,000) und das Verhältnis von Zotten- zu Kryptalänge in der D-FMT-Gruppe signifikant niedriger war (P = 0,000) als bei Mäusen H-FMT-Gruppe (Abb. 4A und ergänzende Abb. 4A). Der histopathologische Score des Dickdarms war in der D-FMT-Gruppe signifikant höher (P = 0,013; Abb. 4A und ergänzende Abb. 4A), und die Anzahl neutraler Mucine und saurer Mucine war in der D-FMT-Gruppe signifikant niedriger als in der H -FMT-Gruppe sowohl im Ileum (P = 0,013/0,009) als auch im Dickdarm (P = 0,043/0,029) (Abb. 4A und ergänzende Abb. 4A).

A Ileum- und Dickdarmgewebeschnitte von H-FMT- und D-FMT-Mäusen: Die erste Reihe des Bildes zeigt H&E-Färbung, die zweite Reihe zeigt PAS-Färbung und die dritte Reihe zeigt AB-Färbung (Maßstabsbalken, 50 μm). B Die Spiegel von IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, LPS, DAO und D-LA im Serum. C Die Spiegel von IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, LPS, DAO und D-LA im Ileumgewebe. D Die Spiegel von IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, LPS, DAO und D-LA im Dickdarmgewebe. E Spiegel der Proteine ​​ZO-1, Occludin, AKT und NF-κB sowie p-AKT und p-NF-κB im Ileum und Dickdarm. F PCoA-Analyse auf Artenebene: Die Daten wurden mit PERMANOVA analysiert; Histogramm der Artenzusammensetzung der Top-20-Arten; Die 20 wichtigsten KEGG-Pfade, angereichert mit differenziellen KOs; Mikrobielle Blasendiagramme der Unterschiede zwischen H-FMT- und D-FMT-Gruppen auf Artenebene. G PLS-DA-Analyse des Metaboloms; Die Heatmap differenzieller Metaboliten. Die linke Seite des Bildes ist die angereicherte Gruppe von Metaboliten und die rechte Seite ist der Name des Metaboliten und seiner entsprechenden Klasse. n = 10 für A–D, F, G; n = 4 für E. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM (B–D) ausgedrückt und eine einfache ANOVA durchgeführt, gefolgt von einem LSD-Test (B–D). *P < 0,05: H-FMT-Gruppe vs. D-FMT-Gruppe.

Wir haben auch die Indikatoren im Zusammenhang mit Entzündungen und Darmpermeabilität im Serum, Ileum und Dickdarm gemessen. Die Serumspiegel von Interleukin (IL)-1β (P = 0,001), IL-6 (P = 0,041), IL-8 (P = 0,017), Tumornekrosefaktor (TNF)-α (P = 0,045) und LPS ( Die Konzentrationen von Diaminperoxidase (DAO) (P = 0,019) und D-Lactat (d-LA) (P = 0,021) waren in der D-FMT-Gruppe signifikant höher als in der H-FMT-Gruppe (Abb. 4B). Die Spiegel von IL-1β (P = 0,029), IL-6 (P = 0,013) und TNF-α (P = 0,035) waren in der Ilea von Mäusen in der D-FMT-Gruppe signifikant höher als in der H-FMT-Gruppe Gruppe, aber es gab keinen signifikanten Unterschied in den LPS-, IL-8-, DAO- oder D-LA-Spiegeln in der Ilea von GF-Mäusen zwischen den beiden Gruppen (Abb. 4C). Die Konzentrationen von IL-1β (P = 0,041), IL-6 (P = 0,005), IL-8 (P = 0,004), TNF-α (P = 0,039) und LPS (P = 0,037) im Dickdarm waren signifikant in der D-FMT-Gruppe höher als in der H-FMT-Gruppe, während sich DAO und d-LA zwischen den beiden Gruppen nicht signifikant unterschieden (Abb. 4D). Wie in Abb. 4E gezeigt, waren die Expressionsniveaus der ZO-1- und Occludin-Proteine ​​in der D-FMT-Gruppe sowohl im Ileum als auch im Dickdarm signifikant verringert. Darüber hinaus war die Proteinhäufigkeit von Gesamt-AKT und NF-κB zwischen der D-FMT- und der H-FMT-Gruppe ähnlich, die Werte von p-AKT und p-NF-κB in D-FMT waren jedoch in der D-FMT-Gruppe signifikant höher als diejenigen in der H-FMT-Gruppe.

Um die Zusammensetzung und Funktion des Darmmikrobioms bei GF-Mäusen nach FMT zu untersuchen, führten wir metagenomische Sequenzierungsanalysen an Stuhlproben durch. Auf Stammebene gab es einen signifikanten Unterschied im Richness-Index (P = 0,003; ergänzende Abbildung 5A). Zwischen den beiden Gruppen wurde kein Unterschied in der Beta-Diversität auf Phylum-Ebene beobachtet (ergänzende Abbildung 5B). Wir analysierten die Stammzusammensetzung der beiden Gruppen (ergänzende Abbildung 5C) und stellten fest, dass die Mikrobiota beider Gruppen hauptsächlich aus Bacteroidetes und Firmicutes bestand. Eine weitere Analyse der Bakterienunterschiede ergab, dass in der D-FMT-Gruppe eine signifikant geringere relative Häufigkeit von Actinobakterien beobachtet wurde (ergänzende Abbildung 5D).

Auf Gattungsebene hatte die D-FMT-Gruppe einen signifikant niedrigeren Shannon-Index (P = 0,015) und Simpson-Index (P = 0,003) als die H-FMT-Gruppe (ergänzende Abbildung 6A). Wir fanden auch signifikante Unterschiede in der Bakterienzusammensetzung auf Gattungsebene zwischen den beiden Gruppen (P = 0,001; ergänzende Abbildung 6B). Die Mikroben in beiden Gruppen bestanden hauptsächlich aus Bacteroides und Parabacteroides (ergänzende Abbildung 6C), und eine Differenzialanalyse identifizierte 24 Gattungen, darunter Bacteroides, Parabacteroides, Erysipelatoclostridium und mehrere andere (ergänzende Abbildung 6D).

Auf Artenebene gab es signifikante Unterschiede in der Mikrobiota-Struktur zwischen den beiden Gruppen, wie durch PCoA-Analysen bestimmt (P = 0,001; Abb. 4F). Die Ergebnisse der mikrobiellen Zusammensetzung zeigten, dass Bacteroides eggerthii, B. plebeius und B. thetaiotaomicron die dominanten Arten in der D-FMT-Gruppe waren, während B. plebeius, B. thetaiotaomicron und B. intestinalis die dominanten Arten in der H-FMT-Gruppe waren (Abb. 4F). Insgesamt wurden 44 Bakterienarten identifiziert, die sich zwischen den beiden Gruppen deutlich unterschieden (Abb. 4F). Es gab auch 873 KOs, die sich signifikant zwischen den beiden Gruppen unterschieden (Ergänzungstabelle 2). Dreizehn KOs wurden im LPS-Biosyntheseweg angereichert, darunter 10 KOs, die in der D-FMT-Gruppe hochreguliert waren (Abb. 4F und Ergänzungstabelle 2).

Wir untersuchten die Ähnlichkeit der Darmmikrobiome bei GF-Mäusen und Ferkeln (ergänzende Abbildung 7A). Wir fanden heraus, dass die Darmmikroben in den beiden Gruppen auf Stammebene vollständig übereinstimmten. Auf Gattungsebene erreichte die Homologierate 82,71 % in der gesunden Gruppe und 80,67 % in der Durchfallgruppe. Auf Artenebene erreichte die Homologierate 83,61 % in der gesunden Gruppe und 63,67 % in der Durchfallgruppe.

Bei beiden Gruppen von Empfängermäusen wurden auch fäkale Metabolomikanalysen durchgeführt. Die Gesamtverteilung der Metaboliten und die Zusammensetzung der Metaboliten in den beiden Gruppen sind in der ergänzenden Abbildung 7B, C dargestellt. Es gab signifikante Unterschiede bei den Metaboliten zwischen diesen beiden Gruppen (Abb. 4G). Eine weitere Analyse der Daten ergab, dass sich 17 Metaboliten zwischen den beiden Gruppen unterschieden, wobei Arginin, Propionylcarnitin, Picolinsäure und Citraconsäure in der D-FMT-Gruppe höhere Werte aufwiesen und 2-Butensäure, Pentadecansäure, Rhamnose, Ribulose und Xylulose , Alpha-Hydroxyisobuttersäure, Glutarsäure, 3-Hydroxyphenylessigsäure, Homovanillinsäure, Hydroxyphenylmilchsäure, Phenylmilchsäure, 3-(3-Hydroxyphenyl)-3-hydroxypropansäure und 3,4-Dihydroxyhydrozimtsäure mit deutlich höheren Konzentrationen im H -FMT-Gruppe (Abb. 4G). KEGG-Analysen ergaben, dass der Arginin- und Prolin-Metabolismus, Pentose- und Glucuronat-Umwandlungen sowie die Aminoacyl-tRNA-Biosynthese die Wege sind, auf denen die Metaboliten angereichert wurden (ergänzende Abbildung 7D).

Wir isolierten L. reuteri und L. mucosae aus Kotproben gesunder neugeborener Ferkel und untersuchten die Wirkung dieser beiden spezifischen Laktobazillen auf die Durchfallsymptome bei GF-Mäusen, die Durchfall erhielten (Abb. 1C). Bei der Messung des Körpergewichts der GF-Mäuse im Laufe der Zeit stellten wir fest, dass die mit L. mucosae gefütterten GF-Mäuse ab dem 5. Tag eine signifikante Verbesserung der Wachstumsverzögerung zeigten, die durch die Verabreichung der Durchfall-fäkalen Mikrobiota-Suspension während des L. reuteri-Eingriffs verursacht wurde Die Gruppe unterschied sich nicht signifikant von der D-FMT-Gruppe (Abb. 5A).

Während des Versuchszeitraums wurden Körpergewichte von Mäusen bestimmt. B Ileum- und Dickdarmgewebeschnitte von Versuchsmäusen: Die erste Reihe des Bildes zeigt H&E-Färbung, die zweite Reihe zeigt PAS-Färbung und die dritte Reihe zeigt AB-Färbung (Maßstabsbalken, 50 μm). C Spiegel von WBC, LYM, NEU, MON, LYM %, NEU % und MON % im Blut von Versuchsmäusen. D Die Spiegel von IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, LPS, DAO und D-LA im Serum. E Die Spiegel von IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, LPS, DAO und D-LA im Ileumgewebe. F Die Spiegel von IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, LPS, DAO und D-LA im Dickdarmgewebe. G Spiegel von ZO-1, Occludin, AKT und NF-κB-Proteinen sowie p-AKT und p-NF-κB im Ileum und Dickdarm. H Hauptkoordinatenanalyse auf ASV-Ebene; Relative Häufigkeit der bakteriellen Zusammensetzung der fäkalen Mikrobiota von GF-Mäusen auf Stamm- und Gattungsebene; Blasendiagramm für die fäkale mikrobielle Differenzialanalyse auf Gattungsebene. n = 10 für A–F und H; n = 3 für G. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM (A und C–F) ausgedrückt und eine einfaktorielle ANOVA durchgeführt, gefolgt von einem LSD-Test (A und C–F). *P < 0,05.

Durch histologische Beobachtung des Dickdarms und Ileums von Mäusen in den drei Gruppen (Abb. 5B) stellten wir fest, dass die Zottenlänge (P = 0,004), neutrale Muzine (P = 0,028) und saure Muzine (P = 0,003) des Ileums vorhanden waren waren in der L. mucosae-Interventionsgruppe im Vergleich zur D-FMT-Gruppe signifikant erhöht (ergänzende Abbildung 4B). Darüber hinaus war der histopathologische Score des Dickdarms signifikant niedriger (P = 0,002; ergänzende Abbildung 4B). Die neutralen Mucine (P = 0,010) und sauren Mucine (P = 0,003) des Dickdarms waren in der L. mucosae-Interventionsgruppe im Vergleich zur D-FMT-Gruppe signifikant höher (ergänzende Abbildung 4B). Beim Vergleich von Ileum und Dickdarm in der L. reuteri-Interventionsgruppe mit denen der D-FMT-Gruppe erreichten die Unterschiede bei diesen Indikatoren jedoch nicht das Niveau statistischer Signifikanz (ergänzende Abbildung 4B).

Die Ergebnisse der biochemischen Blutindizes zeigten, dass die L. mucosae-Interventionsgruppe im Vergleich zur D-FMT-Gruppe signifikant niedrigere Leukozytenzahl (P = 0,033), LYM (P = 0,022) und LYM % (P = 0,046) aufwies, während die NEU % ( P = 0,019) war in der L. mucosae-Interventionsgruppe deutlich höher (Abb. 5C). Darüber hinaus waren die Serumspiegel von IL-1β (P = 0,002), IL-6 (P = 0,007), TNF-α (P = 0,050), LPS (P = 0,003), DAO (P = 0,002) und d- LA (P = 0,000) in der L. mucosae-Interventionsgruppe war signifikant niedriger als in der D-FMT-Gruppe (Abb. 5D). Wir fanden auch heraus, dass die Konzentrationen von IL-1β (P = 0,012), IL-6 (P = 0,005), IL-8 (P = 0,004), LPS (P = 0,009), DAO (P = 0,029) und d -LA (P = 0,011) im Ileum der L. mucosae-Interventionsgruppe waren signifikant niedriger als in der D-FMT-Gruppe (Abb. 5E).

Im Dickdarm waren die Gehalte an IL-8 (P = 0,000), TNF-α (P = 0,017), LPS (P = 0,036) und D-LA (P = 0,007) bei der L. mucosae-Intervention signifikant niedriger Gruppe als in der D-FMT-Gruppe (Abb. 5F). Wir fanden auch heraus, dass die Expressionsniveaus von ZO-1- und Occludin-Proteinen im Ileum und Dickdarm in der L. mucosae-Interventionsgruppe signifikant höher waren (Abb. 5G). Die Werte von p-AKT und p-NF-κB waren in der L. mucosae-Interventionsgruppe signifikant niedriger (Abb. 5G), und diese Werte unterschieden sich nicht signifikant zwischen der L. reuteri-Interventionsgruppe und der D-FMT-Gruppe (Abb . 5G).

Wir analysierten auch Veränderungen in der Struktur und Zusammensetzung der Darmmikrobiota nach der L. mucosae-Intervention (Abb. 5H). PCoA zeigte, dass sich die Bakteriensignaturen zwischen der D-FMT- und der L. mucosae-Interventionsgruppe auf der Ebene der Amplikonsequenzvariante (ASV) nicht signifikant unterschieden. Auf Stammebene waren Bacteroidota, Firmicutes und Fusobacteriota die vorherrschenden Bakterien im Kot von Mäusen der D-FMT- und L. mucosae-Interventionsgruppen. Auf Gattungsebene waren Bacteroides, Fusobacterium und Bacteroidetes_vadinHA17 die vorherrschenden Bakterien im Kot sowohl von D-FMT-Mäusen als auch von Mäusen, die die L. mucosae-Intervention erhielten. Darüber hinaus identifizierten wir insgesamt acht diskriminierende Bakteriengattungen zwischen der D-FMT-Gruppe und der L. mucosae-Interventionsgruppe. Im Vergleich zur D-FMT-Gruppe war die L. mucosae-Interventionsgruppe durch sechs angereicherte Arten und zwei abgereicherte Arten gekennzeichnet.

Wir untersuchten auch die mildernde Wirkung von L. mucosae auf die durch ETEC K88 hervorgerufenen Durchfallsymptome (Abb. 1D). Bei der Messung des Körpergewichts der Mäuse während des Experiments stellten wir fest, dass die mit L. mucosae gefütterten Mäuse eine signifikante Verbesserung der durch die ETEC K88-Infektion verursachten Wachstumsverzögerung aufwiesen (Abb. 6A). Durch histologische Beobachtung des Dickdarms und des Ileums der drei Mäusegruppen (Abb. 6B) wurde festgestellt, dass die Zottenlänge (P = 0,005) und das Verhältnis der Zotten- zur Kryptalänge (P = 0,024) des Ileums im Ileum signifikant erhöht waren ETEC K88 + L. mucosae-Gruppe im Vergleich zur ETEC K88-Gruppe (Abb. 6B). Darüber hinaus war der histopathologische Score des Dickdarms in der Interventionsgruppe signifikant niedriger (P = 0,000; Abb. 6B). Die Serum-, Ileum- und Dickdarmspiegel von IL-1β (P = 0,004/0,025/0,021), IL-6 (P = 0,022/0,001/0,015), TNF-α (P = 0,002/0,010/0,016), LPS ( P = 0,018/0,001/0,000), DAO (P = 0,003/0,000/0,004) und D-LA (P = 0,003/0,000/0,019) in der ETEC K88 + L. mucosae-Gruppe waren signifikant niedriger als die der ETEC K88-Gruppe (Abb. 6C–E). Die Expressionsniveaus der ZO-1- und Occludin-Proteine ​​im Ileum und Dickdarm waren in der ETEC K88 + L. mucosae-Gruppe signifikant höher als in der ETEC K88-Gruppe, wohingegen die Niveaus von p-AKT und p-NF-κB signifikant höher waren niedriger (Abb. 6F).

Während des Versuchszeitraums wurden Körpergewichte von Mäusen bestimmt. B H&E-Färbung in den Ileum- und Dickdarmgewebeschnitten von Versuchsmäusen; Die Zottenlänge, die Kryptalänge, das Verhältnis der Zottenlänge zur Kryptalänge des Ileums und der histopathologische Score des Dickdarms (Maßstab, 50 μm). C Die Spiegel von IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, LPS, DAO und D-LA im Serum. D Die Spiegel von IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, LPS, DAO und D-LA im Ileumgewebe. E Die Spiegel von IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, LPS, DAO und D-LA im Dickdarmgewebe. F Spiegel von ZO-1, Occludin, AKT und NF-κB-Proteinen sowie p-AKT und p-NF-κB im Ileum und Dickdarm. G Hauptkoordinatenanalyse auf ASV-Ebene; Relative Häufigkeit der bakteriellen Zusammensetzung der fäkalen Mikrobiota von Mäusen auf Stamm- und Gattungsebene; Blasendiagramm für die fäkale mikrobielle Differenzialanalyse auf ASV-Ebene. n = 6 für A–E und G; n = 3 für F. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM (A–E) ausgedrückt und eine einfaktorielle ANOVA durchgeführt, gefolgt von einem LSD-Test (A–E). * P < 0,05.

Wir analysierten auch Veränderungen in der Struktur und Zusammensetzung der Darmmikrobiota nach L. mucosae-Intervention (Abb. 6G). PCoA zeigte, dass sich die Bakteriensignaturen zwischen den drei Gruppen auf ASV-Ebene nicht signifikant unterschieden. Auf Stammebene waren Firmicutes, Bacteroidota und Campilobacterota die vorherrschenden Bakterien im Kot von ETEC K88-Mäusen, wohingegen Firmicutes, Bacteroidota und Proteobacteria die vorherrschenden Bakterien im Kot von ETEC K88 + L. mucosae-Mäusen waren. Auf Gattungsebene waren Lactobacillus, Bacteroidetes_vadinHA17 und Alistipes die vorherrschenden Bakterien im Kot von ETEC K88- und ETEC K88 + L. mucosae-Mäusen. Wir identifizierten insgesamt zwei diskriminierende Mikroben zwischen den Gruppen ETEC K88 und ETEC K88 + L. mucosae auf ASV-Ebene; Im Vergleich zur ETEC K88-Gruppe zeichnete sich die ETEC K88 + L. mucosae-Gruppe durch zwei angereicherte Bakterien aus. Die Eigenschaften der Darmmikrobiota in der Kontrollgruppe und der ETEC K88 + L. mucosae-Gruppe am Ende der L. mucosae-Intervention, aber vor der ETEC K88-Provokation sind in der ergänzenden Abbildung 8 dargestellt.

Wir untersuchten weiter die mildernde Wirkung von aus L. mucosae stammenden Elektrofahrzeugen auf die durch ETEC K88 verursachten Durchfallsymptome (Abb. 1E). Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wurde verwendet, um das Vorhandensein von EVs in den L. mucosae-Kulturen zu bestätigen (Abb. 7A). EVs von L. mucosae (LmEVs) wurden auch durch Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) quantifiziert (Abb. 7B). Die biochemische Analyse ergab, dass die LmEVs DNA, RNA und Proteine ​​enthielten und der Proteingehalt deutlich höher war als der von DNA oder RNA (ergänzende Abbildung 9). Nach 6-stündiger Koinkubation mit MODE-K- oder IPEC-J2-Zellen wurden DiI-markierte LmEVs (rotes Signal) im Zytoplasma dieser Zellen gefunden, was darauf hindeutet, dass LmEVs von Darmepithelzellen internalisiert wurden (ergänzende Abbildung 10). Durch Messung des Körpergewichts der Mäuse während des Experiments stellten wir fest, dass Mäuse, die mit von L. mucosae abgeleiteten EVs gefüttert wurden, eine signifikante Verbesserung der durch die ETEC K88-Infektion verursachten Wachstumsverzögerung aufwiesen (Abb. 7C). Bei der histologischen Beobachtung des Dickdarms und des Ileums der drei Mäusegruppen (Abb. 7D) wurde festgestellt, dass der histopathologische Score des Dickdarms in der Interventionsgruppe signifikant niedriger war (P = 0,000; Abb. 7D). Darüber hinaus wurden die Serum-, Ileum- und Dickdarmspiegel von IL-1β (P = 0,000/0,001/0,000), IL-6 (P = 0,001/0,025/0,000) und TNF-α (P = 0,000/0,011/0,004) gemessen. , LPS (P = 0,001/0,014/0,000), DAO (P = 0,000/0,006/0,003) und d-LA (P = 0,000/0,001/0,000) in der ETEC K88 + LmEVs-Gruppe waren signifikant niedriger als die der ETEC K88-Gruppe (Abb. 7E–G). Wir fanden auch heraus, dass die Expressionsniveaus der Arg1-, ZO-1- und Occludin-Proteine ​​im Ileum und Dickdarm in der ETEC K88 + LmEVs-Gruppe signifikant höher waren als in der ETEC K88-Gruppe, wohingegen die Expression von iNOS und die Niveaus von p -AKT- und p-NF-κB-Proteine ​​waren signifikant niedriger (Abb. 7H).

Ein TEM isolierter Elektrofahrzeuge (Maßstabsbalken, 200 oder 100 nm). B Größenverteilung der von NTA analysierten Elektrofahrzeuge. C Körpergewichte von Mäusen während des Versuchszeitraums. D H&E-Färbung von Ileum- und Dickdarmgewebeschnitten von Versuchsmäusen; Messungen der Zottenlänge, der Kryptenlänge und des Verhältnisses von Zotten zu Kryptenlänge des Ileums sowie der histopathologischen Werte des Dickdarms (Maßstab, 50 μm). Spiegel von IL-1β, IL-6, TNF-α, LPS, DAO und D-LA in E dem Serum, F dem Ileumgewebe und G dem Dickdarmgewebe. H Expression von iNOS-, Arg1-, ZO-1-, Occludin-, AKT- und NF-κB-Proteinen und Spiegel von p-AKT und p-NF-κB im Ileum und Dickdarm. I Hauptkoordinatenanalyse auf ASV-Ebene; Relative Häufigkeit der bakteriellen Zusammensetzung der fäkalen Mikrobiota von Mäusen auf Stamm- und Gattungsebene; Blasendiagramm für die fäkale mikrobielle Differenzialanalyse auf ASV-Ebene. n = 3 für A und B; n = 6 für C, E–G und I; n = 5/6 für D; n = 3 für H. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM (C–G) ausgedrückt und eine einfaktorielle ANOVA durchgeführt, gefolgt von einem LSD-Test (C–G). *P < 0,05.

Wir analysierten auch Veränderungen in der Struktur und Zusammensetzung der Darmmikrobiota nach LmEV-Intervention (Abb. 7I). PCoA zeigte, dass sich die Bakteriensignaturen zwischen den drei Gruppen auf ASV-Ebene deutlich unterschieden. Auf Stammebene waren Bacteroidota, Firmicutes und Campilobacterota die vorherrschenden Bakterien im Kot von Mäusen aus den Gruppen ETEC K88 und ETEC K88 + LmEVs. Auf Gattungsebene waren Muribaculaceae, Alistipes und Lactobacillus die vorherrschenden Bakterien im Kot der ETEC K88-Gruppe, wohingegen Muribaculaceae, Lactobacillus und Alistipes die vorherrschenden Bakterien im Kot von ETEC K88 + LmEVs-Mäusen waren. Darüber hinaus haben wir auf ASV-Ebene insgesamt 27 unterscheidende Bakterien zwischen den Gruppen ETEC K88 und ETEC K88 + LmEVs identifiziert; Im Vergleich zur ETEC K88-Gruppe war die ETEC K88 + LmEVs-Gruppe durch 13 angereicherte Bakterien und 14 abgereicherte Bakterien gekennzeichnet.

Um die Rolle von Makrophagen bei der Linderung der durch ETEC K88 hervorgerufenen Symptome einer Durchfallerkrankung durch LmEVs aufzuklären, führten wir ein Makrophagen-Eliminierungsexperiment durch (Abb. 1F). Es wurde kein Unterschied in den Körpergewichtsveränderungen zwischen Makrophagen-eliminierten Mäusen, die mit ETEC K88 (der ETEC K88-E-Gruppe) herausgefordert wurden, und ETEC K88-E-Mäusen, denen LmEVs verabreicht wurden (der ETEC K88 + LmEVs-E-Gruppe) festgestellt (Abb. 8A). Es gab keine signifikanten Unterschiede in der Länge der Jejunalzotten, der Kryptalänge, dem Verhältnis von Zotten zu Kryptalänge oder den histopathologischen Werten des Dickdarms zwischen den Gruppen ETEC K88 + LmEVs-E und ETEC K88-E (Abb. 8B). Es gab auch keine offensichtlichen Unterschiede in den Serum-, Ileum- und Dickdarmspiegeln von IL-1β, IL-6, TNF-α, LPS, DAO und d-LA zwischen den Gruppen ETEC K88 + LmEVs-E und ETEC K88-E ( Abb. 8C–E).

A Körpergewichte von Mäusen im Versuchszeitraum. B H&E-Färbung von Ileum- und Dickdarmgewebeschnitten von Versuchsmäusen; Messungen der Zottenlänge, der Kryptenlänge und des Verhältnisses der Zotten- zur Kryptenlänge des Ileums sowie histopathologische Scores des Dickdarms (Maßstab, 50 μm). Die Spiegel von IL-1β, IL-6, TNF-α, LPS, DAO und D-LA im C-Serum, im D-Ileumgewebe und im E-Kolongewebe. F Hauptkoordinatenanalyse auf ASV-Ebene; Relative Häufigkeit der bakteriellen Zusammensetzung der fäkalen Mikrobiota von Mäusen auf Stamm- und Gattungsebene; Blasendiagramm für die fäkale mikrobielle Differenzialanalyse auf ASV-Ebene. n = 6 für A–F. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM (A–E) ausgedrückt und eine einfaktorielle ANOVA durchgeführt, gefolgt von einem LSD-Test (A–E). *P < 0,05.

Die Veränderungen in der Struktur und Zusammensetzung der Darmmikrobiota nach LmEV-Intervention sind in Abb. 8F dargestellt. PCoA zeigte, dass sich die Bakteriensignaturen zwischen den drei Gruppen auf ASV-Ebene nicht signifikant unterschieden. Auf Stammebene waren Firmicutes, Bacteroidota und Proteobacteria die vorherrschenden Bakterien im Kot von ETEC K88-E-Mäusen und ETEC K88 + LmEV-E-Mäusen. Auf Gattungsebene waren Lactobacillus, Muribaculaceae und Acinetobacter die dominanteste Gattung im Kot von ETEC K88-E-Mäusen, wohingegen Lactobacillus, Muribaculaceae und Alistipes die dominanteste Gattung im Kot von ETEC K88 + LmEV-E-Mäusen waren. Darüber hinaus haben wir auf ASV-Ebene insgesamt acht diskriminierende Mikroben zwischen den Gruppen ETEC K88-E und ETEC K88 + LmEVs-E identifiziert. Im Vergleich zur ETEC K88-E-Gruppe war die ETEC K88 + LmEVs-E-Gruppe durch vier angereicherte Bakterien und vier abgereicherte Bakterien gekennzeichnet.

Durchfallerkrankungen sind ein globales Gesundheitsproblem für Mensch und Nutztier38. Es wird geschätzt, dass Durchfall bei Millionen von Patienten auftritt, und Durchfallerkrankungen verursachen jedes Jahr weltweit medizinische Ausgaben in Milliardenhöhe39. Es wird vermutet, dass Durchfall teilweise durch eine Dysbiose der Darmmikrobiota verursacht wird, die als Verbindung zwischen dem Phänotyp der Wirtskrankheit und der physiologischen Funktion von Geweben und Organen fungiert24. Daher ist es wichtig, die Mechanismen, die Durchfallerkrankungen zugrunde liegen, insbesondere aus der Perspektive der Darmmikrobiota, aufzuklären, um neue Präventions- und Behandlungsstrategien zu entwickeln. Hier verwendeten wir zunächst gesunde und durchfallkranke neugeborene Ferkel als Modelle, um systematisch die Eigenschaften der Darmmikrobiome von Neugeborenen unter diesen unterschiedlichen Bedingungen aufzudecken, und wir identifizierten spezifische potenzielle probiotische Stämme, die gesunde und durchfallkranke Individuen unterscheiden. Zweitens transplantierten wir fäkale Mikrobiota von gesunden und durchfallkranken Neugeborenen in GF-Mäuse, um die molekularen Mechanismen aufzuklären, durch die die gestörte Darmmikrobiota von Durchfall-Neugeborenen zu Darmschäden und Wachstumsverzögerungen führte. Darüber hinaus führten wir Interventionsversuche mit spezifischen probiotischen Komponenten durch, die aus gesunden Personen isoliert wurden, und zeigten eine überlegene lindernde Wirksamkeit gegen Durchfallsymptome. Schließlich haben wir gezeigt, dass von Probiotika abgeleitete EVs die Makrophagen-Phänotypen modulieren, um den Symptomen einer Durchfallerkrankung entgegenzuwirken.

Die Verwendung neugeborener Ferkel als Translationsmodell ermöglichte die Aufklärung der Darmmikrobiota-Eigenschaften gesunder und durchfallkranker Personen. Die Ergebnisse unserer metagenomischen Analyse zeigten, dass neugeborene Ferkel mit Durchfall tatsächlich an einer Störung der Darmmikrobiota leiden, die durch eine andere Struktur der Darmmikrobiota als gesunde Personen gekennzeichnet ist. Lactobacilli spp. gelten derzeit als Probiotika, die eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase der Darmmikrobiota spielen40. Unsere Daten zeigten, dass Lactobacillus spp. kommen im Darm sowohl gesunder als auch durchfallkranker Neugeborener in der höchsten relativen Häufigkeit vor, doch Lactobacillus spp. und einige spezifische Lactobacillus-Arten weisen einen erheblichen Mangel im Darm von Neugeborenen mit Durchfall auf. Darüber hinaus identifizierten wir L. reuteri und L. mucosae als Schlüsselmikroorganismen, die mithilfe von Random-Forest-Modellen gesunde und Durchfall-Neugeborene unterschieden. E. coli ist der wichtigste enterische Krankheitserreger, der für Durchfallerkrankungen verantwortlich ist, und Kinder unter 5 Jahren sind anfällig für eine E. coli-Infektion41. In unserer Studie war Escherichia die zweithäufigste Gattung im Kot von neugeborenen Ferkeln mit Durchfall. Obwohl keine statistischen Unterschiede bestanden, war die relative Häufigkeit von E. coli im Kot von Durchfallferkeln doppelt so hoch wie die von gesunden Ferkeln. LPS ist ein klassischer Virulenzfaktor, der von E. coli produziert wird und Durchfall verursacht.42,43 Unsere KEGG-Funktionsanalyse ergab, dass die LPS-Biosynthese bei neugeborenen Ferkeln mit Durchfall deutlich höher war als bei gesunden neugeborenen Ferkeln. Die Fusobakterien sind eine kleine Gruppe gramnegativer Bakterien, von denen Fusobakterien häufig im Verdauungstrakt von Menschen und Tieren vorkommen. Die wichtigste repräsentative Art von Fusobacterium ist Fusobacterium nucleatum, das nachweislich stark mit Darmentzündungen und Darmkrebs assoziiert ist44,45. In unserer Studie war der Gehalt an Fusobakterien bei neugeborenen Ferkeln mit Durchfall signifikant höher, was darauf hindeutet, dass Fusobakterien ein Zwischenmediator von Darmentzündungen bei Ferkeln sein könnten, die an Durchfall durch E. coli leiden. Unsere Forschung konzentriert sich eher auf die Aufklärung der potenziellen Mechanismen, durch die Laktobazillen Durchfallerkrankungen lindern, als auf die Pathogenese von Durchfall. Daher überlassen wir die Untersuchung pathogener Bakterien zukünftigen Arbeiten. Die vorliegenden Ergebnisse legen nahe, dass die Belastung durch E. coli und die Überproduktion von LPS wichtige Risikofaktoren für Durchfall bei Neugeborenen sind, während das Fehlen von Lactobacillus die Resistenz gegen die pathogene Invasion der Darmmikrobiota bei Neugeborenen erheblich schwächt.

Zusätzlich zu seinem Potenzial als Therapie für komplexe Krankheiten hat FMT auch dazu beigetragen, den intrinsischen Zusammenhang zwischen Darmmikroben und Wirtskrankheitsphänotypen sowie physiologischen Funktionen von Geweben und Organen aufzudecken46,47,48. In unserer Studie führte die Transplantation fäkaler Mikrobiota von Durchfallferkeln auf GF-Mäuse zu einer erheblichen Wachstumsverzögerung, begleitet von schweren systemischen Entzündungsreaktionen. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen bei neugeborenen Ferkeln gab es signifikante Unterschiede in der Struktur der Darmmikrobiota zwischen GF-Mäusen, die mikrobielle Proben gesunder und durchfallkranker Ferkel erhielten. Obwohl die überwiegende Mehrheit der Darmmikrobiota der Empfängermäuse von Spenderschweinen stammte, war die Artenzusammensetzung der Darmmikrobiota der Mäuse radikal verändert, ein Phänomen, das in vielen FMT-Studien häufig vorkommt49,50. Bacteroides spielen eine wichtige Rolle bei der Interaktion zwischen Darmmikrobiota und Wirt, und frühere Studien haben gezeigt, dass Bacteroides die Produktion entzündungsfördernder Zytokine regulieren kann51,52. Unsere Daten zeigten, dass Bacteroides in der Darmmikrobiota beider Mäusegruppen dominierte und die relative Häufigkeit von Bacteroides im Kot von Durchfallempfängermäusen deutlich höher war als die von gesunden Empfängermäusen. Bemerkenswert ist, dass einige mit der Darmmikrobiota zusammenhängende Funktionswege von den Spenderschweinen auf die Empfängermäuse übertragen wurden, wie beispielsweise die LPS-Biosynthese. Unsere Ergebnisse zeigten übereinstimmend, dass die Serumkonzentrationen von LPS bei den Empfängermäusen mit Durchfall signifikant höher waren als bei den gesunden Empfängermäusen. Fäkale Metaboliten gelten als funktionelle Anzeige der Darmmikrobiota53, und in unserer Studie gab es auch signifikante Unterschiede zwischen den fäkalen Metaboliten der beiden Gruppen von Empfängermäusen. Die Ergebnisse der Identifizierung unterschiedlicher Metaboliten zeigten, dass einige Metaboliten mit entzündungshemmendem Potenzial (3,4-Dihydroxyhydrozimtsäure54, Homovanillinsäure55 und Phenylmilchsäure56) bei gesunden Empfängermäusen signifikant angereichert waren, wohingegen ein entzündungsfördernder Metabolit (Picolinsäure57) wurde in Mäusen, die Durchfall hatten, angereichert. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Störung der Darmmikrobiota und ihrer Metaboliten bei Neugeborenen mit Durchfall für die Wachstumsverzögerung und Entzündungsreaktionen als Folge einer Durchfallerkrankung verantwortlich ist.

Durchfallerkrankungen führen nicht nur zu einer hohen Kindersterblichkeit, sondern sind auch eine wichtige Ursache für Darmdysplasie58,59. Darmdysplasie äußert sich hauptsächlich in einem schlecht entwickelten Immunsystem der Darmschleimhaut und einer beeinträchtigten Darmbarrierefunktion, was die Darmpermeabilität und die bakterielle Translokation erhöht, systemische Entzündungsreaktionen hervorruft und letztendlich zu einer Wachstumsverzögerung des Neugeborenen führt60. In dieser Studie verursachte die gestörte Darmmikrobiota von Durchfallferkeln tiefgreifende Auswirkungen auf die Darmentwicklung bei Empfänger-GF-Mäusen, hauptsächlich in Form dramatischer Veränderungen in den Genexpressionsprofilen aller Darmsegmentgewebe (Zwölffingerdarm, Jejunum, Ileum, Blinddarm und Dickdarm). ). Die KEGG-Anreicherungsanalyse ergab, dass unterschiedliche Gene in den fünf Darmsegmenten hauptsächlich auf entzündliche und immunbezogene Signalwege, wie z. B. NF-κB- und PI3K-AKT-Signalwege, abgebildet sind. NF-κB und AKT sind wichtige Proteinmoleküle, die Entzündungsreaktionen vermitteln und phosphoryliert werden, um ihre biologischen Funktionen zu aktivieren61,62. Unsere Ergebnisse zeigten, dass sowohl die Phosphorylierung von NF-κB als auch die AKT im Darm von Mäusen, die an Durchfall leiden, erhöht sind, mit ähnlich erhöhten Spiegeln proinflammatorischer Zytokine im Darmgewebe. Immunschwäche und Entzündungsreaktionen beeinträchtigen die Barrierefunktion des Darms, stören die Darmmorphologie und -struktur und erhöhen die Darmpermeabilität, was zur Infiltration schädlicher Substanzen wie LPS aus dem Darmlumen in den Blutkreislauf führt63,64. Konsequenterweise verschlechterte die Transplantation fäkaler Mikrobiota von Ferkeln mit Durchfall die intestinalen Tight-Junction-Proteine ​​und die Darmmorphologie bei Empfängermäusen erheblich. Diese Ergebnisse zeigen, dass die gestörte Darmmikrobiota von Durchfall-Neugeborenen durch die Aktivierung entzündlicher Signalwege eine lokale Entzündungsreaktion im Darm auslöst, die wiederum zu Störungen der Darmentwicklung führt.

In der klinischen Praxis wird FMT häufig bei Versuchen zur Heilung von Magen-Darm-Erkrankungen eingesetzt und hat eine gewisse Wirksamkeit gezeigt65,66. Eine frühere Studie ergab, dass FMT die Schwere der Erkrankung verringerte, indem es die relative Häufigkeit von Probiotika erhöhte67. Wie oben erwähnt, haben wir L. reuteri und L. mucosae als wichtige Darmmikroorganismen identifiziert, die zwischen gesunden und durchfallkranken Neugeborenen unterscheiden. Um zu überprüfen, ob ihre Wiederauffüllung die durch Durchfall verursachte Wachstumsverzögerung und Darmschädigung der Darmmikrobiota beheben kann, führten wir außerdem probiotische Interventionsexperimente durch. Frühere Studien haben gezeigt, dass L. reuteri und L. mucosae eine entzündungshemmende Wirkung haben68,69. Dementsprechend zeigten unsere Daten, dass L. mucosae, jedoch nicht L. reuteri, die Entzündungsreaktion und Darmschäden wirksam aufhob, indem es die LPS-Synthese und die Phosphorylierung von NF-κB und AKT hemmte, wodurch die durch Durchfall verursachte Wachstumsverzögerung durch Darmmikrobiota wirksam gemildert wurde ETEC K88-Infektion. Probiotika schützen typischerweise die Gesundheit des Wirts, indem sie pathogene Bakterien direkt abtöten oder die Darmmikrobiota umgestalten, um die Widerstandsfähigkeit gegen die Besiedlung durch pathogene Bakterien zu erhöhen18,24,70. In unserer Studie erhöhte die L. mucosae-Intervention die fäkale Häufigkeit von Lactobacillus spp. signifikant. in Mäusen. Diese Daten legen nahe, dass L. mucosae von gesunden Personen eine wichtige Rolle bei der Resistenz gegen Durchfall und Darmverletzungen spielen, indem sie die Darmmikrobiota regulieren. Allerdings müssen die Mechanismen, durch die L. mucosae die Darmhomöostase des Wirts reguliert, um Durchfallerkrankungen zu lindern, weiter geklärt werden.

Die mikrobielle Regulierung der physiologischen Funktionen des Wirts kann zusätzlich zu direkten Wechselwirkungen mit dem Wirt durch aktive Mediatoren vermittelt werden, die von der Mikrobiota abgesondert werden71,72. Unter den verschiedenen bakteriellen Mediatoren spielen EVs nachweislich eine Schlüsselrolle beim interzellulären Crosstalk und der Signalübertragung73. Die Kommunikation zwischen Probiotika und Wirtszellen durch die EV-Sekretion hat die Aufmerksamkeit der wissenschaftlichen Gemeinschaft auf sich gezogen. Jüngste Studien haben gezeigt, dass einige aus Probiotika gewonnene Elektrofahrzeuge eine ähnliche Rolle spielen wie ihre Elternbakterien74,75. In dieser Studie haben wir erfolgreich von L. mucosae abgeleitete EVs isoliert und identifiziert. Darüber hinaus haben wir auch gezeigt, dass LmEVs eine bessere Wirksamkeit bei der Linderung von Durchfallsymptomen haben als L. mucosae. Eine aktuelle Studie hat gezeigt, dass von L reuteri DSM 17938 abgeleitete EVs allein die Auswirkungen ihrer Elternbakterien auf die Darmmotilität vollständig reproduzieren können76. Darüber hinaus gibt es Hinweise darauf, dass von L reuteri DSM 17938 und BG-R46 abgeleitete EVs die Darmbarrierefunktion verbessern, wenn sie von Darmepithelzellen aufgenommen werden, wodurch die durch ETEC77 verursachte Leckage verringert wird. EVs von L reuteri BBC3 können auch von Makrophagen aufgenommen werden, um die Immunantwort zu modulieren78. Unsere Daten zeigten jedoch, dass L reuteri die Symptome einer Durchfallerkrankung nicht linderte, weshalb wir keine Folgeexperimente mit von L reuteri abgeleiteten EVs durchführten. Das in unserer Studie verwendete L reuteri wurde aus dem Kot gesunder neugeborener Ferkel isoliert, was sich von dem in den obigen Berichten verwendeten Modellstamm unterscheidet, und die Variabilität zwischen den Stämmen dürfte ein wichtiger Grund für die unterschiedlichen Ergebnisse sein. Eine frühere Studie hat gezeigt, dass L reuteri DSM 17938 oder seine EVs die Dauer von akutem Durchfall und Krankenhausaufenthalten wegen akuter Gastroenteritis verkürzen können, aber nosokomialen Durchfall oder Antibiotika-assoziierten Durchfall nicht zu verhindern scheinen79, was darauf hindeutet, dass sogar die vorteilhaften Wirkungen desselben Stamms bestehen kann unter verschiedenen pathologischen Bedingungen unterschiedlich sein.

Makrophagen können als Kernzellen, die die Entzündungsreaktion auslösen und regulieren, eine Vielzahl von Zytokinen produzieren, die Proliferation von Darmepithelzellen fördern, die Integrität der Epithelbarriere regulieren und eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Darmhomöostase spielen80,81. Abhängig von konvergierenden Signalen von Entzündungsreizen und der zellulären Umgebung werden die verschiedenen Phasen der Makrophagenaktivierung allgemein als proinflammatorische M1- und antiinflammatorische M2-Polarisation beschrieben82,83. Aktuelle Studien haben eine regulatorische Wirkung der NF-κB- und AKT-Signalwege auf Makrophagen-Phänotypen gezeigt84,85. Unsere Daten zeigten, dass die EV-Intervention die M2-Makrophagenpolarisation aktivierte und die M1-Makrophagenpolarisation hemmte sowie die Expression entzündungsregulierender Proteine ​​(NF-κB und AKT) unterdrückte. Bemerkenswert ist, dass Elektrofahrzeuge in einem Mausmodell zur Makrophageneliminierung nicht mehr in der Lage waren, die Symptome einer Durchfallerkrankung zu lindern. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass LmEVs Durchfall bekämpfen, indem sie die Entzündungsreaktion auf Makrophagen-abhängige Weise modulieren.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Störungen der Darmmikrobiota bei Durchfallferkeln durch eine Veränderung der Mikrobiotastruktur, das Fehlen von Lactobacillus, eine übermäßige E. coli-Proliferation und LPS-Biosynthese gekennzeichnet sind. L. mucosae und L. reuteri waren potenzielle Schlüsselmikroben, die gesunde von durchfallkranken Ferkeln unterscheiden. Durchfallbedingte Darmmikrobiota vermittelten erfolgreich Phänotypen von Durchfallerkrankungen wie Wachstumsverzögerung, Entzündungsreaktionen und Darmschäden an GF-Mäuse. Mechanistisch gesehen aktivierte die gestörte Darmmikrobiota von Durchfall-Neugeborenen entzündungsfördernde Signalwege über LPS, was zu gestörten morphologischen Strukturen des Darms, einer geschwächten Darmbarrierefunktion und einer erhöhten Darmpermeabilität führte. Eine übermäßige LPS-Translokation vom Darmlumen in den Blutkreislauf löste eine systemische Entzündungsreaktion aus, die letztendlich zu einer Wachstumsverzögerung führte. Aus dem Kot gesunder neugeborener Ferkel isolierter L. mucosae übte seine überlegene antidiarrhoische Wirkung aus, indem er die Entzündungsreaktion und Darmschäden reduzierte. Von L. mucosae abgeleitete EVs regulierten die intestinale Homöostase, indem sie M2-Makrophagen aktivierten und M1-Makrophagen hemmten, wodurch die Symptome einer Durchfallerkrankung gelindert wurden. Insgesamt linderte L. mucosae durch die Regulierung der Aktivität von Makrophagen durch die Freisetzung von EV die durch Darmmikroben verursachten Krankheiten. Die wichtigsten Ergebnisse unserer Studie sind in Abb. 9 zusammengefasst. Diese Ergebnisse stellen eine mögliche Strategie zur Prävention des Durchfallrisikos bei Neugeborenen dar.

Schematische Darstellung, die die Ergebnisse der vorliegenden Studie zusammenfasst.

Für die Lactobacillus-Isolierung wurden nach dem Zufallsprinzip Stuhlproben von neugeborenen gesunden Ferkeln ausgewählt. Proben von gefrorenem Kot (200 mg) wurden in sterilem phosphatgepuffertem Salzlösungspuffer (PBS) suspendiert und durch Pipettieren gründlich aufgeschlossen, um eine Bakteriensuspension zu erzeugen. Diese Suspension wurde mit einem zehnfachen Gradienten in sterilem PBS verdünnt und gleiche Volumina (100 μl) jeder Verdünnung wurden auf de Man-, Rogosa- und Sharpe-Agarmedium (MRS) ausgebreitet und 24 Stunden lang anaerob bei 37 °C inkubiert. Einzelne Kolonien mit unterschiedlichen Morphologien wurden mithilfe von Impfösen aus Platten ausgewählt, die mit unterschiedlichen Verdünnungen hergestellt wurden, und die Bakterien wurden durch Aufzeichnen auf neues MRS-Agarmedium gereinigt und die Platten 24 Stunden lang anaerob bei 37 °C inkubiert. Nach vier Reinigungszyklen wurden einzelne Kolonien von MRS-Agarplatten in 500 μl MRS-Brühe übertragen, und die Flüssigkeit wurde unter anaeroben Bedingungen in 15 ml MRS-Brühe überführt und 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Als die MRS-Brühe trüb war, wurde DNA aus einem Teil der Bakterienbrühe extrahiert. Die universellen Primer 27 F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) und 1492 R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) wurden zur Amplifikation des 16S-rRNA-Gens des einzelnen Stamms verwendet und das PCR-Produkt wurde mit der Sanger-Methode sequenziert. Ein weiterer Teil der Bakterienlösung wurde mit einem gleichen Volumen 50 % sterilem Glycerin gemischt und bei –80 °C gelagert. Die 16S-rRNA-Gensequenzen wurden zum Scannen der NCBI-Nukleotidsequenzdatenbank verwendet, um Stämme von L. reuteri und L. mucosae zu identifizieren.

EVs wurden aus Kulturüberständen von L. mucosae-Bakterien isoliert78,86. Kurz gesagt, Bakterienkulturen im logarithmischen Wachstumsstadium wurden 30 Minuten lang bei 8000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und erneut 45 Minuten lang bei 20.000 × g zentrifugiert. Dieser Überstand wurde dann durch einen 0,22-μm-Filter (Millipore) geleitet und das Filtrat in einem SW 32 Ti-Rotor (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) 2 Stunden lang bei 4 ° C und 120.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Sediment in PBS resuspendiert. Die Suspension wurde filtriert und erneut 2 Stunden lang bei 4 ° C und 120.000 × g zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde das Sediment in PBS gesammelt. Das Vorhandensein von Elektrofahrzeugen wurde mit TEM bestätigt und der Bereich der Partikeldurchmesser der Elektrofahrzeuge wurde mit NTA bestimmt.

Der Proteingehalt der LmEVs wurde mit dem Solarbio BCA Protein Assay Kit (Solarbio, #PC0020) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. DNA und RNA in den LmEVs wurden mit dem Qubit™ dsDNA HS Assay Kit (YEASEN, #12640ES60) bzw. dem Qubit™ RNA HS Assay Kit (Invitrogen, #Q32852) gemäß den Anweisungen des Herstellers quantifiziert. Der Gehalt an Protein, DNA und RNA wurde unter Verwendung von 1 × 109 Vesikelpartikeln normalisiert. Die Menge der in den folgenden Experimenten verwendeten LmEVs basierte auf dem Proteingehalt.

MODE-K- und IPEC-J2-Zellen wurden in DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin, in einer Atmosphäre von 5 % CO2 bei 37 °C kultiviert. Das Zellkulturmedium wurde durch ausgewogene Hank-Salzlösung ersetzt, und nach 15-minütiger Inkubation wurden mit DiI (Sigma, Nr. 42364) markierte LmEVs (10 μg/ml) zugegeben und die Zellen 6 Stunden lang inkubiert. DiI-positive Zellen wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop analysiert.

Alle Tierversuchs- und Probenentnahmeverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Huazhong Agricultural University, Hubei, China, genehmigt. In dieser Studie wurden alle experimentellen Methoden gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der Huazhong Agricultural University of Health (Zulassungsnummer HZAUMO-2022-0005) durchgeführt.

Die in dieser Studie verwendeten neugeborenen Ferkel wurden von Guangxi Yangxiang Co., Ltd. bezogen. Nach der Geburt wurden 30 Ferkelwürfe ausgewählt, und aus jedem Wurf wurden ein Durchfallferkel und ein gesundes Ferkel ausgewählt. Ferkel mit flüssigem und wässrigem Kot an mindestens zwei aufeinanderfolgenden Tagen wurden als Durchfallferkel eingestuft, während Ferkel, die keinen Durchfall oder andere Krankheiten aufwiesen, als gesunde Ferkel eingestuft wurden87. Kotproben wurden von neugeborenen Ferkeln (30 Ferkel mit Durchfall und 30 gesunden Ferkeln) entnommen, deren Alter zwischen 8 und 11 Tagen lag (Ergänzungstabelle 3). Alle ausgewählten Ferkel erhielten vor der Probenentnahme keine Antibiotika, Probiotika oder Präbiotika. Die gesammelten Stuhlproben wurden in zwei Portionen aufgeteilt: Eine wurde sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren, die andere wurde in einer sterilen Glycerin-PBS-Lösung (15 % Glycerin) gemischt und dann in flüssigem Stickstoff eingefroren. Alle Proben wurden bei –80 °C gelagert.

Zur Herstellung von FMT-Lösungen wurden Stuhlproben von Ferkeln mit Durchfall oder von gesunden Ferkeln unter anaeroben Bedingungen gehandhabt. Gepoolte Stuhlproben wurden 2 Minuten lang bei 100 × g zentrifugiert und der Überstand durch einen 70-μm-Filter88 filtriert.

Zwanzig GF-Mäuse (Kunming, 4 Wochen alt) wurden in einer sterilen Isolationsumgebung gehalten. Futter und Wasser standen ad libitum zur Verfügung. Die Mäuse wurden zufällig in H-FMT- (n = 10) oder D-FMT-Gruppen (n = 10) eingeteilt. Der H-FMT-Gruppe wurden eine Woche lang einmal täglich morgens 200 μl einer fäkalen Mikrobiota-Suspension von gesunden Ferkeln per Magensonde verabreicht, und der D-FMT-Gruppe wurde eine äquivalente Menge einer fäkalen Mikrobiota-Suspension von Durchfallferkeln verabreicht. In der zweiten Woche wurden die Tiere normal aufgezogen. Das Körpergewicht der behandelten Mäuse wurde während des gesamten Versuchszeitraums jeden Morgen bestimmt. Am Ende des Versuchszeitraums wurden Kotproben entnommen und frisch gesammelter Stuhl schnell in flüssigen Stickstoff getaucht und bei –80 °C gelagert. Alle Mäuse wurden durch Genickbruch getötet. Histologische Proben aus Zwölffingerdarm, Jejunum, Ileum, Blinddarm und Dickdarm wurden mit PBS gespült, um den Darminhalt zu entfernen, und in 4 % Paraformaldehyd fixiert. Der Rest des Zwölffingerdarm-, Jejunum-, Ileum-, Blinddarm- und Dickdarmgewebes wurde gesammelt und bei –80 °C gelagert. Venöses Blut wurde aus dem inneren Augenwinkel entnommen. Insgesamt wurden zwei Arten von Blutproben entnommen. Bei einer der Proben handelte es sich um Vollblut, das für Tests hämatologischer Parameter in 0,5-ml-EDTA-Antikoagulationsröhrchen gesammelt wurde. Die zweite Blutprobe wurde etwa 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und anschließend 10 Minuten bei 1000 × g zentrifugiert.

Dreißig GF-Mäuse (Kunming, 4 Wochen alt) wurden in drei Gruppen eingeteilt: eine D-FMT-Gruppe (n = 10), eine D-FMT + L. reuteri-Gruppe (n = 10) und eine D-FMT + L. reuteri-Gruppe (n = 10). . Mucosae-Gruppe (n = 10). Futter und Wasser wurden nach Belieben bereitgestellt. Der D-FMT-Gruppe wurden in der ersten Woche täglich 100 μl einer fäkalen Mikrobiota-Suspension von Durchfallferkeln und 100 μl PBS und in der zweiten Woche täglich 200 μl PBS per Sonde verabreicht. Der D-FMT + L. reuteri-Gruppe und der D-FMT + L. mucosae-Gruppe wurden 100 μl einer fäkalen Mikrobiota-Suspension von Durchfallferkeln und 100 μl einer L. reuteri- oder L. mucosae-Bakteriensuspension (1010 KBE/ml) per Sonde verabreicht ) täglich in der ersten Woche und 200 μl PBS täglich in der zweiten Woche. Das Körpergewicht aller Mäuse wurde jeden Morgen bestimmt. Die Verfahren zur Probenentnahme waren die gleichen wie im zweiten Tierversuch.

In diesem Experiment wurden insgesamt 18 SPF-Mäuse (BALB/c, 4 Wochen alt) verwendet. Die Mäuse wurden zufällig in drei Gruppen eingeteilt: (1) CON-Gruppe (n = 6); (2) ETEC K88-Gruppe (n = 6); und (3) ETEC K88 + L. mucosae-Gruppe (n = 6). Mäuse des Stammes ETEC K88 (Serotyp O149:K91, K88ac) wurden freundlicherweise von Prof. Wang von der China Agricultural University (Peking, China) zur Verfügung gestellt. In den ersten drei Wochen des Experiments erhielten die Mäuse der CON- und ETEC K88-Gruppen 200 μl PBS pro Tag per Sonde, und die ETEC K88 + L. mucosae-Gruppe erhielt 200 μl einer L. mucosae-Suspension (1010 KBE/ ml) pro Tag. Anschließend wurden 200 μl PBS intraperitoneal in die CON-Gruppe und 200 μl ETEC K88 (2 × 108 KBE/ml) intraperitoneal in die ETEC K88- und ETEC K88 + L. mucosae-Gruppen injiziert, und die Proben wurden 5 Tage lang gesammelt später. Das Körpergewicht aller Mäuse wurde jeden Morgen bestimmt. Die Verfahren zur Probenentnahme waren die gleichen wie im zweiten Tierversuch.

In diesem Experiment wurden insgesamt 18 SPF-Mäuse (BALB/c, 4 Wochen alt) verwendet. Die Mäuse wurden zufällig in drei Gruppen eingeteilt: (1) CON-Gruppe (n = 6); (2) ETEC K88-Gruppe (n = 6); und (3) ETEC K88 + LmEVs-Gruppe (n = 6). Mäusen in der CON-Gruppe wurden 200 μl PBS intraperitoneal injiziert, und Mäusen in den Gruppen ETEC K88 und ETEC K88 + LmEVs wurden 200 μl ETEC K88 (2 × 108 KBE/ml) intraperitoneal injiziert. An den nächsten fünf aufeinanderfolgenden Tagen erhielten Mäuse in den Gruppen CON und ETEC K88 täglich 200 μl PBS oral und Mäuse in der Gruppe ETEC K88 + LmEVs erhielten täglich 50 μg LmEVs in 200 μl PBS oral. Die Behandlungsdosen von LmEVs wurden gemäß unserer vorherigen Studie89 verwendet. Das Körpergewicht aller Mäuse wurde jeden Morgen aufgezeichnet. Die Verfahren zur Probenentnahme waren die gleichen wie im zweiten Tierversuch.

Die Eliminierung von Makrophagen erfolgte durch intraperitoneale Injektion von Clodronat-Liposomen (200 μl/Maus) täglich für 3 Tage vor dem Experiment und dann alle 3 Tage während dieses Experiments, wie zuvor in Lit. beschrieben. 90. Alle anderen Versuchsschritte und die Probenentnahme stimmten mit dem fünften Tierversuch überein. Dieses Experiment wurde ebenfalls in drei Gruppen unterteilt: (1) CON-E-Gruppe (n = 6); (2) ETEC K88-E-Gruppe (n = 6); und (3) ETEC K88 + LmEVs-E-Gruppe (n = 6).

Die gesamte genomische DNA von Stuhlproben wurde mit dem QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Tübingen, Deutschland) extrahiert. Die DNA-Konzentration und -Qualität wurde mit einem Qubit 2.0 Fluorometer (Life Technologies, CA, USA) gemessen. Als Ausgangsmaterial für den Bibliotheksaufbau wurde hochwertige DNA (1 μg) verwendet. Sequenzierungsbibliotheken wurden mit dem NEBNext® Ultra™ DNA Library Prep Kit für Illumina (NEB, USA) erstellt. Die Bibliothek wurde mithilfe einer Illumina HiSeq-Plattform sequenziert und Paired-End-Reads wurden generiert.

Durch Filterung von Adaptern, Lesevorgängen geringer Qualität und Kontamination der genomischen DNA des Wirts aus Rohsequenzierungsdaten wurden qualitativ hochwertige Lesevorgänge für die nachgelagerte Analyse erhalten. Die Annotation der Taxonomie wurde mit MetaPhlAn3 (Version 3.0.7)91 durchgeführt und ihre relative Häufigkeit berechnet, gefolgt von der Berechnung der Differenzarten zwischen Ferkeln mit Durchfall und gesunden Ferkeln mithilfe der LEfSe-Methode (Linear Discriminant Analysis Effect Size) mit a Screening-Kriterium: Ergebnis der linearen Diskriminanzanalyse (LDA) ≥2 und P < 0,05. Zur Berechnung der Alpha-Diversität und zur Durchführung von PCoA-Analysen wurden die R-Pakete vegan (Version 2.5-7) und ade4 (Version 1.7-18) verwendet. Der Unterschied in der Alpha-Diversität zwischen den beiden Gruppen wurde mit Wilcox.test berechnet. Die Signifikanz von PCoA wurde mithilfe der permutationellen multivariaten Varianzanalyse (PERMANOVA) basierend auf 9999 Permutationen berechnet. Arten mit einer mittleren relativen Häufigkeit von weniger als 0,1 % wurden herausgefiltert und die verbleibenden Arten wurden als Eingabemerkmal für das Random-Forest-Klassifizierungsmodell mit den R-Paketen forcats (Version 0.5.1), Random Forest (Version 4.7-1) und Splines verwendet (Version 4.1.2). Die Bedeutung der Arten wurde anhand der mittleren Abnahme der Modellgenauigkeit eingestuft. Die Top-20-Arten wurden als Variablen im Zufallswaldmodell ausgewählt und ihre Werte der Fläche unter der Kurve (AUC) wurden mit dem R-Paket ROCR (Version 1.0-11) berechnet, um die Modellgenauigkeit zu bewerten. Darüber hinaus wurde humann3 (Version 3.0.0) zur Durchführung funktionaler Annotationen eingesetzt. Der signifikante Differential-KO wurde von Wilcox.test berechnet. Die signifikant unterschiedlichen KO (p_adj <0,01) wurden mit dem R-Paket MicrobiomeProfiler (Version 1.1.3) gegen KEGG-Pfade angereichert.

Die V3-V4-Region des 16 S-rRNA-Gens wurde unter Verwendung von Universalprimern amplifiziert und die amplifizierten Produkte in äquimolaren Mengen gepoolt und auf der Illumina MiSeq-Plattform sequenziert, um Paired-End-Reads von 300 bp zu generieren. Rohe Lesevorgänge ohne Barcodes wurden einer Qualitätskontrolle unterzogen, indem Lesevorgänge mit geringer Qualität herausgefiltert wurden. Die resultierenden hochwertigen Lesevorgänge wurden als Eingabe in QIIME2 importiert. Kurz gesagt, hochwertige Sequenzen wurden zunächst mit dem DADA2-Algorithmus entrauscht und mithilfe der SILVA 132-Datenbank einer Taxonomieklassifizierung unterzogen. Die Datenanalyse wurde auf der kostenlosen Online-Plattform Majorbio Cloud Platform (www.majorbio.com) durchgeführt. Die mikrobiellen Ergebnisse wurden durch die FDR-Analyse (False Discovery Rate) angepasst (q < 0,05). Die statistische Signifikanz wurde bei P < 0,05 berücksichtigt.

Zur Extraktion der Gesamt-RNA wurde Trizol-Reagenz (Invitrogen) verwendet. Die erhaltene RNA wurde mit dem NanoDrop ND-1000 Spektrophotometer (Thermo, USA) gemessen. Es folgte die Vorbereitung und Sequenzierung der Transkriptombibliothek92. Die rohen Paired-End-Lesevorgänge wurden von SeqPrep (https://github.com/jstjohn/SeqPrep) und Sickle (https://github.com/najoshi/sickle) unter Verwendung von Standardparametern qualitätskontrolliert und getrimmt. Die erhaltenen sauberen Lesevorgänge wurden von TopHat (Version 2.0.0) mit dem Referenzgenom von Mäusen (http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Info/Index) verglichen, um Dateien zur Genhäufigkeit zu erhalten. Um unterschiedlich exprimierte Gene zwischen den beiden Gruppen zu erhalten, wurde eine differenzielle Expressionsanalyse mit dem R-Paket DESeq2 mit einem Screening-Schwellenwert von |log2FoldChange| durchgeführt ≥ 1 und padjust < 0,05. Danach wurde eine KEGG-Anreicherungsanalyse für differentiell exprimierte Gene durchgeführt, wobei ein Bonferroni-korrigierter P-Wert ≤ 0,05 erforderlich war, um signifikant angereicherte Signalwege auszusortieren. Die KEGG-Signalweganalyse wurde von KOBAS (http://kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do) durchgeführt.

Wir führten die Metabolomics-Erkennung und -Analyse durch Metabo-Profile (Shanghai, China) durch und quantifizierten anschließend alle Zielmetaboliten mit Metabo-Profile Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd93.

Es wurden H&E-, PAS- und AB-Färbungstests durchgeführt94,95. Kurz gesagt, mit 4 % Formaldehyd fixiertes Darmgewebe wurde in Paraffin eingebettet, und Schnitte (5 mm Dicke) wurden entnommen und mit H&E, PAS oder AB gefärbt. Die CaseViewer-Software (Version 220 2.2) wurde verwendet, um die Zottenhöhe, die Kryptatiefe und die Anzahl der Becherzellen und Glykoproteine ​​zu messen und die histopathologische Bewertung auszuwerten.

Der IL-1β-, IL-6-, IL-8-, TNF-α-, LPS-, D-LA- und DAO-Gehalt im Serum-, Ileum- und Dickdarmgewebe von Mäusen wurde mithilfe von ELISA-Kits (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) gemessen mit den Anweisungen des Herstellers (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co. Ltd., Shanghai, China).

Zur Extraktion bzw. Quantifizierung von Proteinen aus Darmgeweben wurden RIPA-Proteinlyselösung (Roche, Penzberg, Deutschland) und BCA-Proteinassay-Kits (Pierce, Rockford, IL, USA) verwendet. Die durch SDS-PAGE-Gelelektrophorese aufgetrennten Proteine ​​wurden auf eine Nitrozellulosemembran (Bio Trace, Pall Co, USA) übertragen. Anschließend wurde die Nitrozellulosemembran 2 Stunden lang in einen Blockierungspuffer getaucht und anschließend über Nacht mit den entsprechenden Primärantikörpern inkubiert. Die Membranen wurden mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween (TBST) gewaschen und dann 2 Stunden lang in eine sekundäre Antikörperverdünnung getaucht. Abschließend wurde die Proteinexpression mit einem Imaging System (Bio-Rad, USA) bzw. einer Quantity One-Software (Bio-Rad, USA) aufgezeichnet und analysiert. Die folgenden in den Western-Blot-Assays verwendeten Antikörper wurden wie folgt angezeigt: Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugierte Sekundärantikörper (Santa Cruz Biotechnology, Ziegen-Anti-Kaninchen (sc-2004; 1:10.000), Ziegen-Anti-Maus (sc-2005). ; 1:10.000)), ZO-1-Antikörper (Abcam, ab221547; 1:1000), Occludin-Antikörper (Abcam, ab216327; 1:1000), Phospho-AKT-Antikörper (Abcam, ab8933; 1:1000), AKT-Antikörper ( Abcam, ab8805; 1:1000), Phospho-NF-κB-Antikörper (Abcam, ab239882; 1:1000), NF-κB-Antikörper (Abcam, ab207297; 1:1000), iNOS-Antikörper (Abcam, ab178945; 1:1000) , Arg1-Antikörper (Abcam, ab92274; 1:1000), β-Actin-Antikörper (Sigma-Aldrich, A5441; 1:1000). Alle Blots oder Gele stammen aus demselben Experiment und wurden parallel verarbeitet. Original-Blots finden Sie in den Zusatzinformationen.

Die statistische Signifikanz wurde mithilfe einer einseitigen Varianzanalyse (ANOVA) bewertet, gefolgt von einem Post-hoc-LSD-Test für paarweise Vergleiche (SPSS Version 20.0 für Windows; SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Alle Ergebnisse wurden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Unterschiede wurden als statistisch signifikant angesehen, wenn P < 0,05. Die Anzahl der für die Statistik verwendeten Replikate ist in den Legenden der Abbildungen angegeben.

Die Datensätze, die die Schlussfolgerungen dieses Artikels stützen, sind im NCBI Sequence Read Archive (SRA)-Repository unter den Zugangsnummern PRJNA847006, PRJNA847017 und PRJNA895872 verfügbar.

Liu, L. et al. Globale, regionale und nationale Ursachen der Sterblichkeit von Kindern unter 5 Jahren im Jahr 2000–15: eine aktualisierte systematische Analyse mit Auswirkungen auf die Ziele für nachhaltige Entwicklung. Lancet 388, 3027–3035 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Duggan, CP & Jaksic, T. Darmversagen bei Kindern. N. engl. J. Med. Rev. 377, 666–675 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Thiagarajah, JR et al. Fortschritte bei der Beurteilung von chronischem Durchfall bei Säuglingen. Gastroenterology 154, 2045–2059.e2046 (2018).

Artikel PubMed Google Scholar

Clasen, TF et al. Maßnahmen zur Verbesserung der Wasserqualität zur Vorbeugung von Durchfall. Cochrane-Datenbanksystem. Rev. 2015, CD004794 (2015).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Ferdous, F. et al. Schweregrad von Durchfall und Unterernährung bei Kindern unter fünf Jahren im ländlichen Bangladesch. Bin. J. Trop. Med. Hyg. 89, 223–228 (2013).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Manary, MJ et al. Eine gestörte Zinkhomöostase bei ländlichen Kindern im Alter von 3 bis 5 Jahren in Malawi ist mit Anomalien der Darmpermeabilität verbunden, die auf tropische Enteropathie zurückzuführen sind. Pädiatr. Res. 67, 671–675 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ngure, FM et al. Wasser, Sanitärversorgung und Hygiene (WASH), Umwelt-Enteropathie, Ernährung und frühkindliche Entwicklung: Zusammenhänge herstellen. Ann. NY Acad. Wissenschaft. 1308, 118–128 (2014).

Artikel PubMed Google Scholar

John, CC, Black, MM & Nelson, CA 3. Neuroentwicklung: Die Auswirkungen von Ernährung und Entzündungen in der frühen bis mittleren Kindheit in ressourcenarmen Umgebungen. Pädiatrie 139, S59–S71 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Mitarbeiter GBDU-M. Globale, regionale und nationale Fortschritte beim Ziel 3.2 für nachhaltige Entwicklung für die Gesundheit von Neugeborenen und Kindern: Ergebnisse zur Gesamtmortalität und ursachenspezifischen Mortalität aus der Global Burden of Disease Study 2019. Lancet 398, 870–905 (2021).

Artikel Google Scholar

Thiagarajah, JR, Donowitz, M. & Verkman, AS Sekretorischer Durchfall: Mechanismen und neue Therapien. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 12, 446–457 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Lu, Q. et al. Veränderungen der Darmmikrobiota-Zusammensetzung bei Neugeborenen, die durch assistierte Reproduktionstechnologie gezeugt wurden, und ihr Zusammenhang mit dem Säuglingswachstum. Darmmikroben 12, 1794466 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Brodin, P. Immun-Mikroben-Wechselwirkungen im frühen Leben: eine Determinante für Gesundheit und Krankheit auf lange Sicht. Wissenschaft 376, 945–950 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Westrom, B., Arevalo Sureda, E., Pierzynowska, K., Pierzynowski, SG & Perez-Cano, FJ Die unreife Darmbarriere und ihre Bedeutung für die Etablierung der Immunität bei neugeborenen Säugetieren. Vorderseite. Immunol. 11, 1153 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Krajmalnik-Brown, R., Ilhan, ZE, Kang, DW & DiBaise, JK Auswirkungen von Darmmikroben auf die Nährstoffaufnahme und Energieregulierung. Nutr. Klin. Üben. 27, 201–214 (2012).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Kabat, AM, Srinivasan, N. & Maloy, KJ Modulation der Immunentwicklung und -funktion durch Darmmikrobiota. Trends Immunol. 35, 507–517 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bauer, E., Williams, BA, Smidt, H., Verstegen, MW & Mosenthin, R. Einfluss der gastrointestinalen Mikrobiota auf die Entwicklung des Immunsystems bei jungen Tieren. Curr. Probleme Intest. Mikrobiol. 7, 35–51 (2006).

CAS PubMed Google Scholar

Ward, DV et al. Die metagenomische Sequenzierung mit Auflösung auf Stammebene weist darauf hin, dass uropathogene E. coli an nekrotisierender Enterokolitis und Mortalität bei Frühgeborenen beteiligt sind. Cell Rep. 14, 2912–2924 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Buffie, CG & Pamer, EG Mikrobiota-vermittelte Kolonisierungsresistenz gegen Darmpathogene. Nat. Rev. Immunol. 13, 790–801 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pamer, EG Wiederbelebung der Darmmikrobiota zur Bekämpfung antibiotikaresistenter Krankheitserreger. Wissenschaft 352, 535–538 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Smits, LP, Bouter, KE, de Vos, WM, Borody, TJ & Nieuwdorp, M. Therapeutisches Potenzial der fäkalen Mikrobiota-Transplantation. Gastroenterology 145, 946–953 (2013).

Artikel PubMed Google Scholar

Hvas, CL et al. Bei der Behandlung rezidivierender Clostridium-difficile-Infektionen ist die Transplantation fäkaler Mikrobiota Fidaxomicin überlegen. Gastroenterology 156, 1324–1332.e1323 (2019).

Artikel PubMed Google Scholar

Haifer, C. et al. Lyophilisierte orale fäkale Mikrobiota-Transplantation bei Colitis ulcerosa (LOTUS): eine randomisierte, doppelblinde, placebokontrollierte Studie. Lanzette Gastroenterol. Hepatol. 7, 141–151 (2022).

Artikel PubMed Google Scholar

Lima, SF et al. Übertragbarer, mit Immunglobulin A beschichteter Odoribacter splanchnicus bei Patienten, die auf eine fäkale Mikrobiota-Transplantation bei Colitis ulcerosa ansprechen, begrenzt die Entzündung des Dickdarms. Gastroenterologie 162, 166–178 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hu, J. et al. Ein aus Mikrobiota gewonnenes Bakteriozin zielt auf den Wirt ab, um früh entwöhnten Ferkeln eine Durchfallresistenz zu verleihen. Cell Host Microbe 24, 817–832.e818 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lemon, KP, Armitage, GC, Relman, DA & Fischbach, MA Auf Mikrobiota ausgerichtete Therapien: eine ökologische Perspektive. Wissenschaft. Übers. Med. 4, 137rv135 (2012).

Artikel Google Scholar

Yanez-Mo, M. et al. Biologische Eigenschaften extrazellulärer Vesikel und ihre physiologischen Funktionen. J. Extracell Vesicles 4, 27066 (2015).

Artikel PubMed Google Scholar

Kim, JH, Lee, J., Park, J. & Gho, YS Gram-negative und Gram-positive bakterielle extrazelluläre Vesikel. Semin. Zellentwickler. Biol. 40, 97–104 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Schwechheimer, C. & Kuehn, MJ Außenmembranvesikel aus gramnegativen Bakterien: Biogenese und Funktionen. Nat. Rev. Microbiol. 13, 605–619 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rivera, J. et al. Bacillus anthracis produziert Membranvesikel, die biologisch aktive Toxine enthalten. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 107, 19002–19007 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Olaya-Abril, A. et al. Charakterisierung schützender, von der extrazellulären Membran abgeleiteter Vesikel, die von Streptococcus pneumoniae produziert werden. J. Proteomics 106, 46–60 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Brown, L., Kessler, A., Cabezas-Sanchez, P., Luque-Garcia, JL & Casadevall, A. Extrazelluläre Vesikel, die vom grampositiven Bakterium Bacillus subtilis produziert werden, werden durch das Lipopeptid Surfactin zerstört. Mol. Mikrobiol. 93, 183–198 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jiang, Y., Kong, Q., Roland, KL & Curtiss, R. 3. Membranvesikel von Clostridium perfringens Typ A-Stämmen induzieren angeborene und adaptive Immunität. Int. J. Med. Mikrobiol. 304, 431–443 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dominguez Rubio, AP et al. Lactobacillus casei BL23 produziert Mikrovesikel, die Proteine ​​tragen, die mit seiner probiotischen Wirkung in Verbindung gebracht werden. Vorderseite. Mikrobiol. 8, 1783 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, M. et al. Von Lactobacillus abgeleitete extrazelluläre Vesikel verstärken die Immunantwort des Wirts gegen Vancomycin-resistente Enterokokken. BMC Mikrobiol. 17, 66 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Dean, SN, Leary, DH, Sullivan, CJ, Oh, E. & Walper, SA Isolierung und Charakterisierung von aus Lactobacillus stammenden Membranvesikeln. Wissenschaft. Rep. 9, 877 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, Z. et al. Xylan lindert die durch Ballaststoffmangel verursachte Dysbiose durch selektive Förderung von Bifidobacterium pseudocatenulatum bei Schweinen. Mikrobiom 9, 227 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, N. et al. Räumliche Heterogenität der bakteriellen Besiedlung in verschiedenen Darmsegmenten nach einer Mikrobiota-Transplantation zwischen den Arten. Mikrobiom 8, 161 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhou, X. et al. Die durch den Verlust von microRNAs verursachte Ansammlung von Succinat, das von der Mikrobiota produziert wird, im Darm führt bei entwöhnten Ferkeln zu Durchfall. Darmmikroben 14, 2091369 (2022).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

da Cruz Gouveia, MA, Lins, MTC & da Silva, GAP Akuter Durchfall mit Blut: Diagnose und medikamentöse Behandlung. J. Pädiatr. 96, 20–28 (2020).

Artikel Google Scholar

van Baarlen, P., Wells, JM & Kleerebezem, M. Regulierung der Darmhomöostase und Immunität mit probiotischen Laktobazillen. Trends Immunol. 34, 208–215 (2013).

Artikel PubMed Google Scholar

Zhang, Y., Tan, P., Zhao, Y. & Ma, X. Enterotoxigenes Escherichia coli: Mechanismen der Darmpathogenese und Kolonisierungsresistenz durch Darmmikrobiota. Darmmikroben 14, 2055943 (2022).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Clairfeuille, T. et al. Struktur des essentiellen Lipopolysaccharid-PbgA-Komplexes der inneren Membran. Natur 584, 479–483 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Xiao, Z. et al. Ein potenzielles Probiotikum gegen Durchfall: Clostridium tyrobutyricum schützt vor LPS-induzierter epithelialer Dysfunktion über IL-22, das von Th17-Zellen im Ileum produziert wird. Vorderseite. Immunol. 12, 758227 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kostic, AD et al. Fusobacterium nucleatum verstärkt die Tumorentstehung im Darm und moduliert die tumorimmune Mikroumgebung. Cell Host Microbe 14, 207–215 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brennan, CA & Garrett, WS Fusobacterium nucleatum – Symbiont, Opportunist und Onkobakterium. Nat. Rev. Microbiol. 17, 156–166 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Turnbaugh, PJ et al. Ein mit Fettleibigkeit assoziiertes Darmmikrobiom mit erhöhter Fähigkeit zur Energiegewinnung. Natur 444, 1027–1031 (2006).

Artikel PubMed Google Scholar

Wang, Z. et al. Die Darmmikrobiota moduliert die durch Schlafentzug verursachte Entzündungsreaktion und kognitive Beeinträchtigung. Mol. Psychiatrie 26, 6277–6292 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Huang, Z. et al. Die Transplantation fäkaler Mikrobiota von metabolisch beeinträchtigten menschlichen Spendern beschleunigt Arthrose bei Mäusen. Ann. Rheum. Dis. 79, 646–656 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ridaura, VK et al. Darmmikrobiota von Zwillingen, die hinsichtlich Fettleibigkeit nicht übereinstimmen, modulieren den Stoffwechsel bei Mäusen. Science 341, 1241214 (2013).

Artikel PubMed Google Scholar

Ma, C. et al. Kottransplantationen von Kuh zu Maus deuten darauf hin, dass das Darmmikrobiom eine Ursache für Mastitis ist. Mikrobiom 6, 200 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Mazmanian, SK, Round, JL & Kasper, DL Ein mikrobieller Symbiosefaktor verhindert entzündliche Darmerkrankungen. Natur 453, 620–625 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yang, J. et al. Landschaften bakterieller und metabolischer Signaturen und deren Wechselwirkung bei schweren depressiven Störungen. Wissenschaft. Adv. 6, eaba8555 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zierer, J. et al. Das fäkale Metabolom als funktionelle Anzeige des Darmmikrobioms. Nat. Genet. 50, 790–795 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, S., Suh, JH, Zheng, X., Wang, Y. & Ho, CT Identifizierung und Quantifizierung potenzieller entzündungshemmender Hydroxyzimtsäureamide aus Wolfberry. J. Agrar. Lebensmittelchem. 65, 364–372 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ding, S., Jiang, H., Fang, J. & Liu, G. Regulatorische Wirkung von Resveratrol auf durch Lipopolysaccharide induzierte Entzündungen durch Neuprogrammierung von Darmmikroben und Verbesserung der Serumstoffwechselprofile. Vorderseite. Immunol. 12, 777159 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chifiriuc, MC et al. In-vivo-Versuchsmodell zur Untersuchung des Einflusses subinhibitorischer Konzentrationen von Phenylmilchsäure auf die Pathogenität von Staphylococcus aureus. Rum. Bogen. Mikrobiol. Immunol. 68, 34–37 (2009).

PubMed Google Scholar

Bosco, MC et al. Makrophagenaktivierende Eigenschaften des Tryptophan-Kataboliten Picolinsäure. Adv. Exp. Med. Biol. 527, 55–65 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kotloff, KL et al. Die Inzidenz, Ätiologie und unerwünschten klinischen Folgen weniger schwerer Durchfallepisoden bei Säuglingen und Kindern in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen: eine 12-monatige Fall-Kontroll-Studie als Folgestudie zur Global Enteric Multicenter Study (GEMS). ). Lancet Glob. Gesundheit 7, e568–e584 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Moore, SR et al. Längere Episoden akuten Durchfalls verringern das Wachstum und erhöhen das Risiko anhaltender Durchfälle bei Kindern. Gastroenterology 139, 1156–1164 (2010).

Artikel PubMed Google Scholar

Kinashi, Y. & Hase, K. Partner beim Leaky-Gut-Syndrom: Darmdysbiose und Autoimmunität. Vorderseite. Immunol. 12, 673708 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Afonina, IS, Zhong, Z., Karin, M. & Beyaert, R. Begrenzung der Entzündung – die negative Regulierung von NF-kappaB und dem NLRP3-Inflammasom. Nat. Immunol. 18, 861–869 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Schieber, AM et al. Die durch das Mikrobiom E. coli vermittelte Krankheitstoleranz umfasst Inflammasom- und IGF-1-Signale. Wissenschaft 350, 558–563 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Tilg, H., Zmora, N., Adolph, TE & Elinav, E. Die Darmmikrobiota, die metabolische Entzündungen befeuert. Nat. Rev. Immunol. 20, 40–54 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Martel, J. et al. Störung der Darmbarriere und chronische Erkrankung. Trends Endokrinol. Metab. 33, 247–265 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Thomas, H. IBD: FMT induziert eine klinische Remission bei Colitis ulcerosa. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 14, 196 (2017).

Artikel PubMed Google Scholar

Moayyedi, P. et al. Eine fäkale Mikrobiota-Transplantation induziert in einer randomisierten kontrollierten Studie eine Remission bei Patienten mit aktiver Colitis ulcerosa. Gastroenterology 149, 102–109.e106 (2015).

Artikel PubMed Google Scholar

Lleal, M. et al. Eine einzelne fäkale Mikrobiota-Transplantation moduliert das Mikrobiom und verbessert die klinischen Manifestationen in einem Rattenmodell für Kolitis. EBioMedicine 48, 630–641 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, JK, Lee, KE, Lee, SA, Jang, HM & Kim, DH Zusammenspiel zwischen menschlichen Darmbakterien Escherichia coli und Lactobacillus mucosae beim Auftreten neuropsychiatrischer Störungen bei Mäusen. Vorderseite. Immunol. 11, 273 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, H. et al. Lactobacillus reuteri sorgt für die Regeneration des Darmepithels und repariert beschädigte Darmschleimhaut. Gut Microbes 11, 997–1014 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Buffie, CG et al. Die präzise Rekonstitution des Mikrobioms stellt die Gallensäure-vermittelte Resistenz gegen Clostridium difficile wieder her. Natur 517, 205–208 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Thaiss, CA, Zmora, N., Levy, M. & Elinav, E. Das Mikrobiom und die angeborene Immunität. Natur 535, 65–74 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Macia, L., Nanan, R., Hosseini-Beheshti, E. & Grau, GE Von Wirten und Mikrobiota abgeleitete extrazelluläre Vesikel, Immunfunktion und Krankheitsentwicklung. Int. J. Mol. Wissenschaft. Rev. 21, 107 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Diaz-Garrido, N., Badia, J. & Baldoma, L. Von Mikrobiota abgeleitete extrazelluläre Vesikel in der Kommunikation zwischen Königreichen im Darm. J. Extracell Vesicles 10, e12161 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Kang, CS et al. Extrazelluläre Vesikel aus Darmmikrobiota, insbesondere Akkermansia muciniphila, schützen das Fortschreiten der durch Dextransulfat-Natrium verursachten Kolitis. PLoS ONE 8, e76520 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, JH et al. Extrazelluläres Vesikel-abgeleitetes Protein aus Bifidobacterium longum lindert Nahrungsmittelallergien durch die Unterdrückung von Mastzellen. J. Allergieklinik. Immunol. 137, 507–516.e508 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

West, CL et al. Mikrovesikel aus Lactobacillus reuteri (DSM-17938) reproduzieren die Modulation der Darmmotilität durch Bakterien bei Mäusen vollständig. PLoS ONE 15, e0225481 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pang, Y. et al. Extrazelluläre Membranvesikel aus Limosilactobacillus reuteri stärken die Integrität des Darmepithels, modulieren Zytokinreaktionen und antagonisieren die Aktivierung von TRPV1. Vorderseite. Mikrobiol. 13, 1032202 (2022).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Hu, R. et al. Von Lactobacillus reuteri abgeleitete extrazelluläre Vesikel erhalten die intestinale Immunhomöostase gegen Lipopolysaccharid-induzierte Entzündungsreaktionen bei Broilern aufrecht. J. Anim. Wissenschaft. Biotechnologie. 12, 25 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dargenio, VN et al. Verwendung von Limosilactobacillus reuteri DSM 17938 bei pädiatrischen Magen-Darm-Erkrankungen: eine aktualisierte Übersicht. Benef. Mikroben 13, 221–242 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Na, YR, Stakenborg, M., Seok, SH & Matteoli, G. Makrophagen bei Darmentzündungen und -auflösung: ein potenzielles therapeutisches Ziel bei IBD. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 16, 531–543 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Viola, MF & Boeckxstaens, G. Nischenspezifische funktionelle Heterogenität darmresidenter Makrophagen. Gut 70, 1383–1395 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Macias-Ceja, DC et al. Der Succinatrezeptor vermittelt Darmentzündungen und Fibrose. Schleimhautimmunol. 12, 178–187 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Quail, DF et al. Die Tumormikroumgebung liegt der erworbenen Resistenz gegen die CSF-1R-Hemmung bei Gliomen zugrunde. Wissenschaft 352, aad3018 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, L. et al. Progranulin hemmt die LPS-induzierte Makrophagen-M1-Polarisierung über die Signalwege NF-small ka, CyrillicB und MAPK. BMC Immunol. 21, 32 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vergadi, E., Ieronymaki, E., Lyroni, K., Vaporidi, K. & Tsatsanis, C. Akt-Signalweg bei der Makrophagenaktivierung und M1/M2-Polarisation. J. Immunol. Rev. 198, 1006–1014 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Liu, L., Liang, L., Yang, C., Zhou, Y. & Chen, Y. Extrazelluläre Vesikel von Fusobacterium nucleatum beeinträchtigen die Darmbarriere, indem sie auf den RIPK1-vermittelten Zelltodweg abzielen. Darmmikroben 13, 1–20 (2021).

Artikel PubMed Google Scholar

Hermann-Bank, ML et al. Charakterisierung der bakteriellen Darmmikrobiota von Ferkeln, die an neugeborenem Schweinedurchfall leiden. BMC Tierarzt. Res. 11, 139 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, Z. et al. Die Darmmikrobiota von mit Grüntee-Polyphenol behandelten Mäusen verbessert die Homöostase des Darmepithels und lindert experimentelle Kolitis. Mikrobiom 9, 184 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Ma, L. et al. Clostridium butyricum und seine abgeleiteten extrazellulären Vesikel modulieren die Darmhomöostase und lindern akute experimentelle Kolitis. Mikrobiol. Spectr. 10, e0136822 (2022).

Artikel PubMed Google Scholar

Li, L. et al. IL-25-induzierte Verschiebungen der Makrophagenpolarisation fördern die Entwicklung von beigem Fett und verbessern die metabolische Homöostase bei Mäusen. PLoS Biol. 19, e3001348 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Beghini, F. et al. Integration taxonomischer, funktioneller und Stammprofilierung verschiedener mikrobieller Gemeinschaften mit bioBakery 3. eLife 10, e65088 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tao, S. et al. N-Acylhomoserinlactone können die Darmgesundheit von Ferkeln mit niedrigem Geburtsgewicht beeinträchtigen, indem sie die Barrierefunktion der Darmepithelzellen und den Aminosäurestoffwechsel verändern. J. Nutr. 151, 1736–1746 (2021).

Artikel PubMed Google Scholar

Wu, Z. et al. Die intestinale Mikrobiota und das Stoffwechselprofil im Serum reagierten auf zwei ernährungsphysiologisch unterschiedliche Diäten bei Mäusen. Vorderseite. Nutr. 8, 813757 (2021).

Artikel PubMed Google Scholar

Tao, S. et al. Eine durch eine hochkonzentrierte Ernährung verursachte Störung der Dickdarmepithelbarriere ist mit der Aktivierung der Zellapoptose bei laktierenden Ziegen verbunden. BMC Tierarzt. Res. 10, 235 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Tao, S., Bai, Y., Li, T., Li, N. & Wang, J. Ursprünglich niedriges Geburtsgewicht verschlechtert die Epithelbarrierefunktion des Hinterdarms bei Schweinen im Wachstumsstadium. FASEB J. 33, 9897–9912 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Referenzen herunterladen

Diese Arbeit wurde von der National Nature Science Foundation of China (32272898 und 31902189), der Natural Science Foundation der Provinz Hubei (2021CFB436 und 2021CFA018), dem Knowledge Innovation Program des Wuhan-Shuguang Project (2022020801020230) und den Fundamental Research Funds unterstützt die Zentraluniversitäten (2662020DKQD004). Wir danken Dr. Canfeng Hua, Yale University, für seine hilfreichen Kommentare zum Manuskript.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Jingjing Li, Shuaifei Feng, Zhenyu Wang.

Hochschule für Tierwissenschaften und -technologie, Huazhong Agricultural University, Wuhan, 430070, China

Jingjing Li, Shuaifei Feng, Jinhui He, Zeyue Zhang, Huicong Zou, Zhifeng Wu, Xiangdong Liu, Hong Wei und Shiyu Tao

Staatliches Schlüssellabor für Tierernährung, Hochschule für Tierwissenschaften und -technologie, China Agricultural University, Nr. 2 Yuanmingyuan West Road, Peking, 100193, China

Zhenyu Wang

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

ST, XL und HW haben die Forschung entworfen. Die Experimente wurden hauptsächlich von JL, SF und ZW durchgeführt, einige Experimente wurden mit Unterstützung von ZW, JH durchgeführt und ZZ, SF und HZ analysierten die Daten. ST hat das Manuskript mit Hilfe aller Autoren verfasst. Alle Autoren haben die endgültige Fassung des Manuskripts gelesen und genehmigt. JL, SF und ZW haben gleichermaßen zu dieser Studie beigetragen.

Korrespondenz mit Xiangdong Liu, Hong Wei oder Shiyu Tao.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Li, J., Feng, S., Wang, Z. et al. Von Limosilactobacillus mucosae abgeleitete extrazelluläre Vesikel modulieren den Makrophagen-Phänotyp und orchestrieren die Darmhomöostase in einem Durchfall-Ferkelmodell. npj Biofilms Microbiomes 9, 33 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00403-6

Zitat herunterladen

Eingegangen: 3. Januar 2023

Angenommen: 22. Mai 2023

Veröffentlicht: 06. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00403-6

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt