Eine Veränderung der Tyrosinphosphorylierung des Herzproteoms und des EGFR-Signalwegs trägt zur hypertrophen Kardiomyopathie bei

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 1251 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Veränderungen der Serin-/Threonin-Phosphorylierung des Herzproteoms sind ein Kennzeichen der Herzinsuffizienz. Der Beitrag der Tyrosinphosphorylierung (pTyr) zur Pathogenese der Herzhypertrophie bleibt jedoch unklar. Wir verwenden globale Kartierung, um ortsspezifisches pTyr in zwei kardialen hypertrophen Mausmodellen zu entdecken und zu quantifizieren, d. h. kardiale Überexpression von ErbB2 (TgErbB2) und der schweren Kette von α-Myosin R403Q (R403Q-αMyHC Tg) im Vergleich zu Kontrollherzen. Daraus ergeben sich signifikante phosphoproteomische Veränderungen bei TgErbB2-Mäusen in den Bahnen der rechtsventrikulären Kardiomyopathie, der hypertrophen Kardiomyopathie (HCM) und der dilatativen Kardiomyopathie (DCM). Andererseits zeigten R403Q-αMyHC Tg-Mäuse, dass der EGFR1-Signalweg neben der Aktivierung der Signalwege Angiopoietin, ErbB, Wachstumshormon und Chemokin von zentraler Bedeutung für die Herzhypertrophie ist. Überraschenderweise kommt es bei den meisten Myofilamentproteinen zu einer Herunterregulierung von pTyr statt zu einer Hochregulierung. Die Kinase-Substrat-Anreicherungsanalyse (KSEA) zeigt eine deutliche Herunterregulierung der MAPK-Signalwegaktivität stromabwärts von k-Ras in TgErbB2-Mäusen und eine Aktivierung der EGFR-, fokalen Adhäsions-, PDGFR- und Aktin-Zytoskelett-Signalwege. In vivo verringert die Hemmung von ErbB2 durch AG-825 die Unordnung der Kardiomyozyten. Serin/Threonin und Tyrosin-Phosphoproteom bestätigen die oben beschriebenen Wege und die Wirksamkeit der AG-825-Behandlung. Daher könnte verändertes pTyr eine regulatorische Rolle in Herzhypertrophiemodellen spielen.

Bei der familiären hypertrophen Kardiomyopathie (HCM) kommt es zu einer Vergrößerung der Wandstärke des linken Ventrikels (LV); Abnormale Belastungsbedingungen können diese Veränderung nicht erklären. Mutationen in Genen, die für Sarkomerproteine ​​kodieren, kommen bei HCM-Patienten häufig vor (40–60 %)1. Die Untersuchung posttranslationaler Modifikationen (PTMs) der Sarkomerproteine ​​(oder Ca2+-Handhabungsproteine) kann eine einzigartige Gelegenheit bieten, besser zu verstehen, wie genetische Störungen zu Herzfunktionsstörungen führen, und potenzielle Angriffspunkte für die Therapie zu entdecken2,3,4. Beispielsweise wurden PTMs von kardialem Troponin I (cTnI), einem Sarkomerprotein, das zentral an der Regulierung der Myokardkontraktilität beteiligt ist, eingehend untersucht, insbesondere im Hinblick auf die funktionelle Rolle der Proteinkinase A-abhängigen Phosphorylierung5. Insbesondere ist die Phosphorylierung von cTnI-S22/23 – einer der wichtigsten regulatorischen Stellen von cTnI – bei menschlicher Herzinsuffizienz (HF)6 herunterreguliert und führt zu einer kontraktilen Dysfunktion7.

Die Tyrosinphosphorylierung (pTyr) ist für die strukturelle Entwicklung des Herzens und die Myofibrillenorganisation während der Embryogenese von wesentlicher Bedeutung8,9. Beispielsweise wurden mehrere Tyrosinphosphatasen mit Herzerkrankungen in Verbindung gebracht und sogar als therapeutisches Ziel für einige Erkrankungen vorgeschlagen. Darüber hinaus können Mutationen des Tyrosin-Protein-Phosphatase-Nichtrezeptors Typ 11 (PTPN11) zu HCM oder dilatativer Kardiomyopathie (DCM) führen10,11. Im Herzen spielt PTPN11 wahrscheinlich eine Rolle bei der systolischen Dysfunktion, die durch Drucküberlastung verursacht wird12. Saure Phosphatase 1 (ACP1) ist eine weitere Tyrosinphosphatase, die mit der Pathophysiologie des Herzens assoziiert ist. Dementsprechend schützt seine Löschung vor stressbedingter Kardiomyopathie13. Unsere Gruppe zeigte zunächst, dass die cTnI-Y26-Phosphorylierung in gesunden menschlichen Herzen leicht nachweisbar und in menschlichem HF und DCM14 herunterreguliert ist. Wie diese Veränderungen zum Ausbruch und Fortschreiten von Herzerkrankungen beitragen, ist jedoch noch immer kaum verstanden. Ein besseres Verständnis zusätzlicher ortsspezifischer Veränderungen einzelner Tyrosinphosphorylierungsstellen würde in dieser Richtung erheblich helfen.

In der vorliegenden Studie wurde ein markierungsfreier und Tandem-Mass-Tagging (TMT)-Ansatz zur quantitativen globalen Phosphotyrosin-Proteomik angewendet, um zu bestimmen, welche Sarkomerstellen an bestimmten Stellen in zwei nicht verwandten HCM-Modellen veränderte Mengen an Tyr-Phosphorylierung aufweisen. Das erste Modell ist sekundär zur Überexpression des Tyrosinkinaserezeptors ErbB215,16. Die zweite fasst Merkmale der menschlichen Krankheit zusammen, genauer gesagt eine R403Q-Mutation der schweren Kette des Myofilamentproteins Myosin, die für familiäres HCM17 charakteristisch ist. TgErbB2-Mäuse entwickeln zunächst eine auffällige, konzentrische Herzhypertrophie, die sich bei HCM zu diffuser Fibrose und Myozytenstörung16 entwickelt. Diese Mäuselinie weist außerdem einen abnormalen Umgang mit Kalzium auf, ist anfällig für Arrhythmien und entwickelt eine hypertrophe obstruktive Kardiomyopathie2. In ähnlicher Weise reproduzieren R403Q-αMyHC-Mäuse menschliche familiäre HCM, indem sie von leichter Hypertrophie und Fibrose zu offener Myozytenstörung, Herzinsuffizienz und Arrhythmien fortschreiten17.

Der Hauptanstoß für diese Studie bestand darin, festzustellen, ob die Auslösung von HCM durch verschiedene Mechanismen ähnliche pTyr-bezogene Signalwege/regulatorische Stellen im Herzen hervorruft. Auf diese Weise würde die Manipulation dieser pTyr-Stellen wiederum neue Möglichkeiten für die therapeutische Ausrichtung auf verschiedene Formen menschlicher HCM bieten

Zunächst führten wir eine Immunoblot-Analyse des Myokards von TgErbB2-, R403Q-αMyHC- und nicht-transgenen (Ntg) Mäusen durch, um pTyr abzuschätzen. Es gab einen globalen Rückgang des pTyr in Ganzherzhomogenaten von TgErbB2- (p = 0,0298) und R403Q-αMyHC-Mäusen (p = 0,003) im Vergleich zu Ntg (Abb. 1a, b). Das pTyr-Signal wurde auf Troponin-I-Expressionsniveaus normalisiert (Abb. 1a). Obwohl die Protoonkogen-Tyrosin-Proteinkinase Src (c-Src) dem ErbB2-Signal nachgeschaltet ist, haben wir bei Normalisierung auf GAPDH-Western-Blot-Signale keine erhöhte Expression in R403Q-αMyHC-Mäusen erwartet (Abb. 1c, d, p = 0, 0414). . Die c-Src-Aktivität (c-Src Tyr416-Phosphorylierung) schien bei R403Q-αMyHC-Mäusen im Vergleich zu Ntg erhöht zu sein; Es erreichte jedoch keine statistische Signifikanz (Abb. 1e, f, zum Vergleich der Gruppen wurde eine einfache ANOVA verwendet). Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass es sich bei pTyr um ein weit verbreitetes PTM im Myokard handelt. Daher kann seine Hoch- oder Herunterregulierung als Teil der pathophysiologischen Reaktion auf die Grunderkrankung eine regulatorische Rolle beim Krankheitsverlauf nicht-ischämischer Kardiomyopathien spielen, wie im Fall der familiären Kardiomyopathie (HCM) und DCM.

a Western Blots zeigen eine Abnahme von pTyr bei TgErbB2-Mäusen (p = 0,0298) und R403Q-α-MyHC-Herzhomogenaten (p = 0,003). Das Troponin I-Signal zeigt die entsprechende Gesamtproteinbeladung. b Densitometrieanalyse zeigt, dass nach der Normalisierung des pTyrosin-Signals auf Gesamt-cTnI der pTyr-Wert der TgErbB2- und R403Q-α-MyHC-Mäuse signifikant abnahm. c Western Blots zeigen die Expressionsniveaus von Gesamt-Src und p-Src (Tyr 416) sowie GAPDH als Ladungskontrolle. d Densitometrieanalyse ergab, dass die Src-Werte in R403Q-α-MyHC signifikant erhöht sind (p = 0,0282), wohingegen e und f zeigen, dass die p-Src-Phosphorylierungswerte in R403Q-α-MyHC erhöht sind, aber keine statistische Signifikanz erreichten. Die Signale in d und e wurden auf Gesamt-GAPDH normalisiert, wohingegen in f pSRC auf Gesamt-SRC normalisiert wurde. Ntg (n = 3), TgErbB2 (n = 3) und R403Q-α-MyHC (n = 3), Fehlerbalken stellen SEM dar. Zum Vergleich der Gruppen wurde eine einfache ANOVA verwendet.

Als nächstes haben wir einen globalen TMT-Phospho-Tyrosin-Proteom-Ansatz angewendet, um das pTyr-Profil des gesamten Herzens von Ntg-, TgErbB2- und R403Q-αMyHC-Mäusen zu vergleichen (Abb. 2). Wir stellten die Hypothese auf, dass eine unvoreingenommene globale pTyr-Profilierung des gesamten Herzens eine vollständige Landschaft über spezifische Tyrosinstellen in essentiellen herzspezifischen Proteinen und Tyrosinkinasen liefern und somit Hinweise darauf liefern würde, welche Tyrosinkinasen kardiales pTyr vermitteln. Insgesamt wurden 1.800 übereinstimmende Peptidspektren (PSM) aus dem gesamten Proteom der Herzkammer gesammelt und 50 % mit hoher Sicherheit identifiziert, was zu 213 (R403Q-αMyHC), 214 (Ntg) und 217 (TgErbB2) einzigartigen tyrosinphosphorylierten Peptiden führte entsprechend 499 Proteinen (Abb. 2g). Tabellen mit allen identifizierten Phosphoproteinen und Phosphopeptiden finden Sie in den Ergänzungsdaten 3. Die Qualität, Intensität und Verteilung der Massenspektrometriedaten nach der Median-Sweep-Normalisierung sind in den Ergänzungsabbildungen 1a, b enthalten. Für die Annotation wurde das Vertrauen in die Lokalisierung der phosphorylierten Stelle bewertet, und es war eine Punktzahl von mehr als 49 % erforderlich. Dieser Datensatz weist darauf hin, dass eine vergleichbare Ausbeute bei der Peptididentifizierung, eine Reproduzierbarkeit bei der Anreicherung von pTyr-Peptiden und qualitativ hochwertige MS/MS-Daten unter Verwendung ähnlicher Ansätze wie bei anderen erzielt wurden18,19,20.

a Ventrikelgewebe wurden mit PBS gespült und einer Hitzestabilisierung mit einem T1-Gewebestabilisator unterzogen, um den Erhalt der Phosphorylierung zu maximieren, dann in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur weiteren Verwendung bei –80 °C gelagert. b Ntg-, TgErbB2- und R403Q-αMyHC-Mäuseherzen (n = 5 pro Gruppe) wurden parallel verarbeitet, um Ganzherzlysate zu erhalten; 30 mg Proteinlysate aus jedem Mäuseherz wurden für den Trypsinverdau in Lösung verwendet. Insgesamt 150 mg trypsinisiertes Protein pro Genotyp wurden C18-entsalzt und drei Tage lang bei –20 ° C lyophilisiert. c Insgesamt 150 mg tryptische Peptide (gepooltes Material aus 5 Herzen pro Gruppe) wurden mittels Immunaffinitätsfällung (Protein-Agarose-Kügelchen + 300 Mikrogramm mAb Anti-pTyr) auf pTyrosin angereichert und auf Spitzen der C18-Stufe entsalzt. d RP-HPLC ESI (Elektrospray-Ionisation) MS/MS wurde auf einem LTQ Orbitrap Elite (Thermo Scientific) 120 Minuten lang auf einem linearen Acetonitrilgradienten (4–40 %) durchgeführt. Die Rohdaten wurden mit Mascot 2.3 durchsucht und mit MaxQuant wurde eine markierungsfreie Quantifizierung mit MS1-extrahierten Ionenchromatogrammen durchgeführt. Dieser Ansatz wurde dreimal wiederholt, wobei die Proben aus allen drei Gruppen parallel liefen; 15 Herzen pro Genotyp in drei technischen Replikaten. e Ein Teil des Durchflusses der pTyr-Anreicherung wurde für einen 9-plexTMT verwendet; Drei Replikate jedes Genotyps (Ntg, TgErbB2 und R403Q-αMyHC) wurden gepoolt und zur vollständigen Proteomquantifizierung in RPLC fraktioniert. f Daten von pTyrosin und vollständigem Proteom wurden auf ähnliche Weise verarbeitet, pTyrosin-Signale wurden normalisiert, um der Gesamtproteinexpression zu entsprechen Daten normalisieren. Die Analysen werden im Text und in den ergänzenden Daten detailliert beschrieben. g zeigt die Überlappung der in den drei Gruppen gefundenen phosphorylierten Proteine, während h die überlappenden Tyrosin-phosphorylierten Peptide zwischen den drei Gruppen zeigt.

Der globale TMT-Phospho-Tyrosin-Proteomics-Ansatz identifizierte 499 verschiedene Tyrosin-phosphorylierte Proteine, 294 Tyrosin-phosphorylierte Proteine, die sich zwischen dem Ntg und dem Myokard aus zwei kardialen hypertrophen Modellen (TgErbB2 und R403Q-αMyHC) überlappen. Auf Peptidebene wurden 217 pTyr-Stellen mit einer Überlappung von 178 Tyrosin-phosphorylierten Resten nachgewiesen (Abb. 2g, h).

Als nächstes lag der Fokus auf den herzspezifischen Proteinen aus dem Myofilamentapparat. Neun wichtige Myofilamentproteine ​​wurden Tyrosinphosphoryliert. Sie beherbergen mehrere pTyr-Aminosäurestellen, von denen viele neu sind (siehe ergänzende Abbildung 2); Das beste Beispiel ist Titin mit 36 ​​pTyr-Aminosäurestellen (siehe ergänzende Abbildung 3). Außerdem wiesen siebzehn Tyrosinkinasen nachweisbare Tyrosinphosphorylierte Peptide auf; Daher könnten sie möglicherweise an der Regulierung des kardialen Myofilament-pTyr beteiligt sein.

Im Gegensatz dazu wiesen nur zwei Tyrosinphosphatasen (Ptpn11 und Ptpra) nachweisbare Tyrosinphosphorylierte Peptide auf; Daher spielen sie wahrscheinlich eine Rolle bei der Regulierung der kardialen pTyr-Spiegel im Sarkomer. Zusätzlich zu der Anzahl der Tyrosinkinasen, die mit phosphorylierten Peptiden gefunden wurden, wiesen fünfzehn Serin/Threoninkinasen nachweisbare Tyrosinphosphorylierte Peptide auf; jedoch zeigte nur eine Serin/Threonin-Phosphatase (Ppp1r12b) Tyrosin-phosphorylierte Peptide. Diese Daten zeigen, dass pTyr im Herzproteom (Herzsarkomer und andere Subproteome) weit verbreitet ist und dass eine Wechselwirkung zwischen Tyrosinkinasen/Phosphatasen und Serin/Threoninkinasen/Phosphatasen den pTyr des Herzsarkomers regulieren könnte.

Als nächstes führten wir bioinformatische Analysen durch, um den Einfluss der kardialen ErbB2-Überexpression und der R403Q-Mutation der schweren Myosinkette des Herzens auf die spezifischen pTyr-Veränderungen zu definieren. Wir haben die Signaltransduktionswege bestimmt, die mit zwei nicht verwandten HCM-Typen verbunden sind. Die Spektralsignalnormalisierung von pTyr wurde über die gesamten globalen TMT-Isobarensonden des Herzens durchgeführt, die das gesamte Proteom quantifizierten (Abb. 2e, f), und es wurden statistische Methoden durchgeführt, wie zuvor beschrieben 21, 22. Anschließend wurden Hauptkomponentenanalyse (PCA) und hierarchisches Clustering angewendet, um festzustellen, ob die pTyr-Profile innerhalb der Gruppen ähnlich waren. Dieser Ansatz ergab, dass sich die drei Gruppen bei der vollständigen Proteomquantifizierung nach Hauptkomponente 1 (PC1 = 46 %) aufteilen (Abb. 3a). Dieser Befund war auch nach der pTyr-Normalisierung auf das vollständige Proteom offensichtlich; Die drei Gruppen trennen sich entlang der Hauptkomponente (PC1 = 52,2 %) (Abb. 3b). Bemerkenswert ist, dass ein technisches/biologisches Replikat von R403Q-αMyHC entfernt wurde, da es im Vergleich zu den anderen beiden Replikaten mehr als 50 % fehlende pTyr-Peptide aufwies. Daher wurde es als technischer Fehler angesehen. Heatmaps hierarchisch geclusterter hoch- oder herunterregulierter normalisierter pTyr-Peptide halfen dabei, die technische Reproduzierbarkeit und die Spezifität zu veranschaulichen, wie der Genotyp der Herzhypertrophie die Umgestaltung des pTyr-Proteoms weitgehend beeinflusste (Abb. 3c, p <0, 05 durch ANOVA). Tyrosinphosphorylierte Peptide sind entsprechend den Signalintensitäten ihres extrahierten Chromatogramms MS1, normiert auf die Intensität des isobaren TMT-Markierungspeptids MS2, farblich gekennzeichnet. Gelb wird hochreguliert und Blau wird herunterreguliert. Dieser Ansatz lieferte uns die globale Häufigkeit von Tyrosinpeptiden im Herzproteom. Diese Ergebnisse zeigen, dass Ntg-, TgErbB2- und R403Q-αMyHC-Mäuse ein pTyr-Proteom mit einer deutlichen Signatur haben, was durch PCA- und Heatmaps-Clustering in unbeaufsichtigten, unvoreingenommenen statistischen Methoden belegt wird.

Eine unbeaufsichtigte PCA des gesamten Herzproteoms von nicht-transgenen Mäusen, TgErbB2- und R403Q-αMyHC-Mäusen zeigt eine deutliche Trennung der Versuchsgruppen. Die Gruppen trennen sich zusammen mit der ersten Hauptkomponente (PC #1), die 46 % der Gesamtkorrelation in der Expression des vollständigen Proteoms ausmacht (normalisiert, Mittelwert = 0, Varianz = 1). b Unbeaufsichtigte PCA des pTyrosin-Peptidsignals normalisiert sich zur vollständigen Proteomexpression. Die Gruppen trennen sich auch zusammen mit der ersten Hauptkomponente (PC Nr. 1), die 52,2 % der Gesamtkorrelation ausmacht. c Eine Heatmap wurde verwendet, um die unbeaufsichtigte hierarchische Clusterbildung von pTyrosin-Peptiden zu visualisieren, die durch ANOVA auf die vollständige Proteomexpression mit einem p-Wert < 0,05 normalisiert wurden. Überrepräsentiert (gelb) und unterrepräsentiert (blau). d Vulkandiagramm, das die Log2-Faltungsänderung und den –Log10-p-Wert jedes pTyr-Peptids im paarweisen Vergleich von Ntg und TgErbB2 zeigt. Die rot hervorgehobenen Datenpunkte zeigen eine deutlich geringere Intensität, wohingegen die grün markierten Daten eine deutlich höhere Intensität zeigen. Die signifikanten Stellen wurden in der Abbildung vergrößert (gepunktete Quadrate), um einige Peptidstellen zu kennzeichnen. Magenta-Datenpunkte stimmen mit Genen überein, die signifikant mit MsigDB-Krankheitspfaden assoziiert sind. Der Cyan-Datenpunkt erreichte keine statistische Signifikanz, obwohl er auf den EGFR1-Signalweg hinweist. e Vulkandiagramm, das die Log2-Faltungsänderung und den –Log10-p-Wert jedes pTyr-Peptids im paarweisen Vergleich von Ntg und R403Q-αMyHC zeigt. Rote und grüne Datenpunkte wurden wie oben farbcodiert. Bei einer ähnlichen Vergrößerung wie oben zeigen die Cyan-Datenpunkte eine signifikante Assoziation zum EGFR1-Signalweg durch PTMsigDB. f Molecular Signature DB (MSigDB) und Molecular PTMs Signature DB (PTMsigDB) aus globalen pTyr-Daten identifizierten Signalwege, die signifikant verändert waren.

Statistisch signifikante Veränderungen (Log2-fache Änderung > 1, -Log p-Wert < 1,3) wurden in 23 Phosphositen nachgewiesen, die 18 Proteinen in TgErbB2-Mäusen (Abb. 3d) und 45 Phosphositen in 35 Proteinen in den R403Q-αMyHC Tg-Mäusen (Abb . 3f) mittels ANOVA (p < 0,05). Es ist bemerkenswert, dass pTyr mehrerer Peptide der schweren Kette von Alpha-Myosin (Myh7-Y386, Y410, Y1375), eines Peptids der schweren Kette von Beta-Myosin (Myh6-Y1349) und zwei Peptiden von Titin (Ttn-Y2118, Y21190) werden herunterreguliert, während kardiales Ttn Y-31324 pTyr auf TgErbB2-Mäuseherzen hochreguliert wird (Abb. 3d). Interessanterweise ist die Myh7-Y410-Phosphorylierung in TgErbB2 herunterreguliert und in R403Q-αMyHC Tg-Mäuseherzen hochreguliert (Abb. 3e). Im Gegensatz dazu ist cTnI Y113 (Tnni3-Y113) pTyr in beiden HCM-Modellen herunterreguliert, erreichte jedoch nur in R403Q-αMyHC Tg-Mäuseherzen statistische Signifikanz. Die Titinphosphorylierung (TtnY1881, Y1901 und Y33864) war im letzteren Modell deutlich herunterreguliert.

Wir verwendeten MATLAB, eine maßgeschneiderte PhoshoEnrichment-Software (M. Ayati), die die Molecular Signatures Database (MsigDB)23 und eine neuartige Datenbank mit PTMs ortsspezifischen Phosphorylierungssignaturen von Kinasen, Störungen und Signalwegen (PTMsigDB)24 integriert. Das Broad Institute hat die Datenbanken erstellt, die eine gut kuratierte Sammlung annotierter Gendatensätze und PTMs umfassen. PTMsigDB berücksichtigt ortsspezifische Phospho-Änderungen und deren Auswirkungen auf die Aktivierung oder Hemmung eines bestimmten Signalwegs sowie die häufigsten Störungen der experimentellen Systembiologie. Der Vorteil dieser Bioinformatik-Tools besteht darin, die statistische Signifikanz jedes Signalwegs und jeder Störung (Genebene und Standortebene) mithilfe eines hypergeometrischen Tests zu bewerten. Als Population für den hypergeometrischen Modellparameter wird hier anstelle aller bekannten Gene die Anzahl der identifizierten Phosphosite und Gene verwendet.

An wichtigen Genen/Stellen wurde eine Pathway-Anreicherungsanalyse auf Gen-Protein-Ebene mit MSigDB durchgeführt. Die wichtigsten Signalwege von TgErbB2-Mäusen sind arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie (ARVC), HCM, DCM und Integrin AlphaIIB Beta3-Signalisierung (Abb. 3f). Die wichtigsten Signalwege von R403Q-αMyHC Tg sind der Angiopoietin-Rezeptor-Signalweg, der ErbB-Signalweg, der Wachstumshormon-Rezeptor-Signalweg und der Chemokin-Signalweg (Abb. 3f).

Beide Tg-Tiermodelle zeigten eine bemerkenswerte Veränderung des Plakophilin-2 (PKP2) pTyr an der Stelle Y119, obwohl es in TgErbB2-Herzen herunterreguliert und in R403Q-αMyHC Tg-Herzen hochreguliert war (Abb. 3e). Die MsigDB-Analyse des globalen TMT-Flusses des gesamten Herzens durch das gesamte Proteom wird in den Zusatzdaten 3 dargestellt. PKP2 ist eine kritische Komponente der Desmosomen des Myokards. Mutationen in diesem Gen werden mit arrhythmogener Kardiomyopathie in Verbindung gebracht25,26,27. Daher könnte eine gestörte Phosphorylierung von Plakophilin-2 funktionelle Auswirkungen haben.

Im Vergleich dazu ergab die PTMsigDB, dass die Signalweganalyse auf der phosphorylierten ortsspezifischen Ebene keine statistische Signifikanz für den EGFR1-Signalweg in TgErbB2-Mäusen erreichte; nur zwei ortsspezifische Phosphosite stimmten mit dem EGFR1-Signalweg überein; Sie werden im Volcano-Diagramm (Abb. 3d) und in der PTMsigDB-Tabelle (Abb. 3f) in Cyan-Farbe hervorgehoben. Interessanterweise war bei R403Q-αMyHC-Mäusen derselbe Signalweg statistisch signifikant; Sehen Sie sich die zehn ortsspezifischen Änderungen an, die mit dem EGFR1-Signalweg übereinstimmten (p = 0,001), dargestellt im Vulkandiagramm als cyanfarbene Datenpunkte (Abb. 3e) und in der PTMsigDB-Tabelle (Abb. 3f). Diese Daten zeigen den Nutzen ortsspezifischer Phosphorylierungsdatenbanken zur Eingrenzung der Suche nach einem biologisch relevanten Weg in Phosphoproteomik-Datensätzen, insbesondere bei wenig untersuchten Phosphorylierungsereignissen wie pTyr mit bisher kleinen Datensätzen.

Wir verwendeten eine quantitative TMT-Markierungsproteomik, um spezifischere Einblicke in die Veränderungen des Myofilament-pTyr zu erhalten. Genauer gesagt stellten wir die Hypothese auf, dass die Anreicherung von Myofilamenten die Anzahl der Ortsidentifizierungen in Myofilamentproteinen erhöhen würde, insbesondere bei solchen mit Phospho-Tyrosin-Modifikationen in geringer Häufigkeit, die beim globalen Ansatz möglicherweise übersehen wurden. Zu diesem Zweck verwendeten wir frisch aus Ntg- und TgErbB2-Mäusen isolierte Myofilamente, wie in „Methoden“28 beschrieben, mit geringfügigen Modifikationen. Wir verwendeten drei Herzen pro Genotyp, um das Myofilament-pTyr-Proteom zu charakterisieren (Abb. 4a, b), wie für das Herzinsuffizienz-Phosphoproteom beschrieben20. Kurz gesagt führten wir ein groß angelegtes 6-Plex-TMT-Experiment durch, bei dem die meisten TMT-markierten Peptide mit pTyr angereichert wurden (Abb. 4c). Für die weitere statistische Datenanalyse haben wir einen Arbeitsablauf übernommen, der der Ganzherz-TMT-Phospho-Tyrosin-Proteomik ähnelt (Abb. 4d). Die mit Einzelspektren identifizierten Peptide wurden entfernt, was zu 24.727 PSM führte. Nach der Median-Sweep-Normalisierung entsprachen 1.116 Peptide 1.092 Proteinen. Siehe ergänzende Abbildung 4a, b für die spektrale Intensitätsverteilung vor und nach der Normalisierung (ergänzende Abbildung 4c, d). Für das pTyr-Proteom wurden 4391 PSM gesammelt und die gleiche Qualitätskontrollkur des gesamten Proteoms durchgeführt, um fehlende Daten und einzigartige Spektren zu entfernen, was zu 3064 PSM führte. Rohdaten der spektralen Intensitätsverteilung des pTyr-Proteoms werden vor der Normalisierung (ergänzende Abb. 5a, b) und nach der Normalisierung (ergänzende Abb. 5c, d) und PCA (Abb. 5b) gezeigt. Nach der Median-Sweep-Normalisierung entsprachen 832 Peptide 184 verschiedenen Proteinen. Der spezifische pTyr für 146 Peptide wurde quantifiziert, da sie entsprechende Peptide aus den Expressionsdaten des vollständigen Proteoms hatten.

Ein Myofilament aus Ntg- (n = 3) und ErbB2- (n = 3) transgenen Mäuseherzen wurde frisch auf eiskalten Puffern isoliert, die Proteinase- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktails (Roche) enthielten. b Das gesamte Material wurde in TEAB resuspendiert, dann reduziert und alkyliert. Tryptische Peptide wurden entsalzt und mit 6-plex isobaren Tandem-Massen-Tags (TMT) markiert. c Die verdauten und markierten Peptide wurden gepoolt und mit C18 SEP-PAK entsalzt. Die Anreicherung von Phosphotyrosin wurde mit dem PTMScan Phospho-Tyrosine Rabbit mAb (P-Tyr-1000) Kit (Cell Signaling Technology) durchgeführt. Die eluierten Peptidproben wurden mit C18 STAGE-Spitzen und einem Easy-nanoLC 1200 Nanoflow-Flüssigkeitschromatographiesystem, gekoppelt an Orbitrap Fusion Lumos Tribrid, entsalzt.

Ein vollständiges Proteom wurde mit TMT markiert, und die protokollierten und zusammengefassten Proteinsignalintensitäten zeigen, dass sich experimentelle Gruppen zusammen mit der ersten Hauptkomponente (PC #1) trennen, was 53,9 % der Gesamtkorrelation im Expressionsproteom ausmacht (normalisiert, Mittelwert). = 0, Varianz = 1). b PCA des Phospho-Tyr-Proteoms zeigt einen ähnlichen Trend, und die Gruppen trennen sich entlang der PC#1, was 47,2 % der Korrelation ausmacht. c Signalintensitäten des Phospho-Tyr-Proteoms wurden auf die vollständige Proteom-Proteinexpression normalisiert und durch Hauptkomponentenanalyse analysiert. Die charakteristische Signatur von pTyr ist bei PC#1 immer noch erkennbar und macht 57 % der Korrelation aus. d Eine Heatmap wurde verwendet, um die unbeaufsichtigte hierarchische Korrelationsclusterung der Proteinexpression und der e pTyr-Proteomexpression mit p < 0,05 durch einen LIMMA-moderierten 2-Proben-t-Test-Vergleich der TgErbB2- und Ntg-Gruppe zu visualisieren. f Vulkandiagramm, das die Log2-Faltungsänderung und den –Log10-p-Wert jedes pTyr-Peptids im paarweisen Vergleich von Ntg und TgErbB2 zeigt. Die Datenpunkte in Rot zeigten eine deutlich geringere Intensität, wohingegen die Datenpunkte in Grün eine deutlich höhere Intensität zeigten. Aus Gründen der Klarheit der Darstellung wurden nur einige Peptide hervorgehoben. g Molecular Signature DataBase (MSigDB) bestätigte Ziele und die Beteiligung von dilatierten und HCM-KEEG-Signalwegen, die auch bei TgErbB2-Mäusen in Abb. 3 gefunden wurden.

Der erste Schritt der Analyse nutzt unbeaufsichtigte PCA und hierarchisches Clustering. Die PCA-Analyse zeigte die Korrelation zwischen Mitgliedern derselben Gruppe (Abb. 5a – c), vollständigem Proteom, pTyr-Proteom und normalisiertem pTyr-Proteom, die sich entlang PC1 gut trennen, und zeigte eine Expressionskorrelation von 57,6 %, 82,4 % und 62,1 %. jeweils. Heatmaps der hierarchisch geclusterten Expression halfen zu veranschaulichen, wie die kardiale Überexpression von TgErbB2 die Clusterbildung des Genotyps weitgehend beeinflusste. Beide Muster, Proteine ​​aus dem gesamten Proteom (Abb. 5d) und die normalisierte Intensität des pTyr-Proteoms (Abb. 5e), deuteten auf eine gespiegelte Umgestaltung hin (377 Proteine ​​​​für das gesamte Proteom und 51 pTyr-Peptide hatten ap < 0,05 durch LIMMA-moderierte 2- Beispiel-T-Test-Vergleich).

Das vollständige Proteom wies 1116 Peptide nach, was 1092 Proteinen entsprach. Ein Vergleich des Log2 Fold-Change (FC) von Ntg/TgErbB2 zeigte 377 Proteine ​​mit statistisch signifikanten Unterschieden (Log2 FC > 1 und p-Wert < 0,05). Wie das TMT-Phosphotyrosin des gesamten globalen Herzens auf vollständige Proteomdaten normalisiert wurde, wurden die statistisch signifikanten Proteinexpressionsänderungen zur Signalweganalyse MSigDB unterzogen. Die Ergebnisse sind in den Zusatzdaten 4 dargestellt.

Wir verwendeten 146 Phosphostellen, die 50 Proteinen entsprachen, um die Phosphorylierung des pTyr-Proteoms oder das normalisierte pTyr-Proteom zu analysieren. Die TgErbB2-Mäuse zeigten signifikante Veränderungen an 21 pTyr-Stellen (Abb. 5g), entsprechend 15 Proteinen. Ein erheblicher Anstieg von pTyr wurde unter anderem bei MLC1-Y82, Y139, Myh6-Y1310, α-Tm-Y261, Actin-Y168, MyBP-C-Y544 und Actinin2-Y200 festgestellt. Die MsigDB-Signalweganalyse lieferte ähnliche Ergebnisse wie der globale TMT-Phospho-Tyrosin-Ansatz für ganze Herzen (Abb. 3). TgErbB2-Sarkomer-pTyr-Daten zeigen auch, dass die wichtigsten Signalwege DCM und HCM sind (Abb. 5g, h). Interessanterweise nehmen die ErbB2-Y1006-Phosphorylierungsniveaus ab, wenn sie auf das gesamte ErbB2 normalisiert werden. Andererseits ergab die Analyse der PTMsigDB-Pfade keine Übereinstimmung mit den Pfaden, da viele Standorte neu sind und nicht in der PTMsigDB-Datenbank aufgeführt sind.

Unsere Daten zeigen, dass durch die Anreicherung von Sarkomerproteinen mehr Myofilament-pTyr-Peptide nachgewiesen wurden, die im globalen Ansatz von Ganzherzlysaten übersehen wurden. Allerdings war die Gesamtzahl der Tyrosin-phosphorylierten Peptide und entsprechenden Proteine ​​geringer.

KSEA wurde verwendet, um genotypinduzierte Signaländerungen zu charakterisieren, indem die relative Aktivität der Kinase in TgErbB2- und R403Q-αMyHC-Mäusen unter Verwendung der globalen pTyr-TMT- und TMT-quantitativen Sarkomer-pTyrosin-Proteomikdaten für das ganze Herz abgeschätzt wurde, wobei ihre jeweiligen Ntg-Gruppen als Referenz verwendet wurden. KSEA29 ist eine Methode, die auf der Grundlage der unterschiedlichen Phosphorylierung ihrer Substrate auf die unterschiedliche Aktivität der Kinasen schließt und Werte berechnet, die die Richtungsänderung der Aktivität jeder Kinase widerspiegeln. Diese Methode geht davon aus, dass die unterschiedliche Aktivität von Kinasen mit Phosphorylierungsänderungen in ihren Substraten korreliert. Ein positiver Wert entspricht einer Kinase mit phosphorylierten Substraten in Tg-Mäusen im Vergleich zur Ntg-Kontrolle. Ebenso ist ein negativer Wert eine Hypophosphorylierung des Tg im Vergleich zur Ntg-Kontrolle. Die Daten zur Kinase-Substrat-Interaktion wurden von der PhosphoSitePlus30-Website heruntergeladen. Als nächstes wurde die KSEA-Methode auf alle in diesen Experimenten identifizierten pTyr-Stellen angewendet. Wir haben 34 Phosphosites identifiziert, die über auf PhosphoSitePlus gemeldete assoziierte Kinasen verfügen. In den kombinierten Datensätzen wurden jedoch 49 einzigartige Kinasen bewertet. Eine KSEA-Heatmap, die auf Cluster herunterregulierter (blaue Farbskala) oder hochregulierter (rote Farbskala) Kinasen schließen lässt, ist in Abb. 6a dargestellt. TgErbB2-Mäuse zeigten eine signifikante Herunterregulierung von MAP2K4, MAP3K6, MAP3K5, MAP2K3 und MAP2K6 und eine deutliche Hochregulierung von EPHA4. Andererseits zeigte R403Q-αMyHC Tg eine erhebliche Herunterregulierung von GSK3B (siehe hervorgehobenes blaues Rechteck in Abb. 6a). R403Q-αMyHC Tg zeigte einen größeren Cluster deutlich hochregulierter Kinasen (siehe hervorgehobenes rotes Rechteck in Abb. 6a).

eine KSEA zu Daten zur pTyr-Anreicherung ganzer Herzen und zur TMT-pTyr-Myofilament-Anreicherung. Heatmaps melden KSEA-Ergebnisse gemäß normalisierten Werten (z. B. TgErbB2/Ntg, R403Q-αMyHC/Ntg usw.). Es sind nur Kinasen enthalten, die von Datensätzen gemeinsam genutzt werden und daher in Tg und Ntg vorhanden sind. Sternchen geben die statistische Signifikanz von p < 0,05 an. Rot steht für einen positiven Wert und Blau für einen negativen Wert. Das rote Rechteck hebt Gruppen aktivierter Kinasen hervor, die zusammengeballt sind und in R403Q-αMyHC vorherrschen, während das blaue Rechteck unterdrückte Kinasen hervorhebt, die sich zusammenballen und in ganzen TgErbB2-Herzen vorherrschen. b MoBaS identifizierte ein eng miteinander verbundenes Subnetzwerk, das an der Signalübertragung von Wachstumsfaktoren beteiligt ist (ERBB, PDGFRA und EGFR1). Repräsentiert durch das am höchsten bewertete PPI-Subnetzwerk namens Modul 1, wurde die pTyr-Anreicherung mit TgErbB2 im gesamten Herzen identifiziert und mit R403Q-αMyHC verglichen. c KSEA auf der Substratgruppe Modul 1, MsigDB und PTMsigDB. d Das zweite PPI-Subnetzwerk mit der höchsten Punktzahl, Modul 2 genannt, wurde anhand der R403Q-αMyHC-Gesamtherz-pTyr-Anreicherung identifiziert und mit TgErbB2 verglichen. Die KSEA auf der Substratgruppe Modul 2 zeigt aktivierte Kinasen in R403Q-αMyHC. Die Ergebnisse der PTMsigDB- und MSigDB-Analyse identifizierten EGFR1, Aktin-Zytoskelett, ERBB und fokale Adhäsionssignale. Jeder Knoten ist ein Phosphoprotein, das durch sein wichtigstes Peptid auf PPI-Modulen dargestellt wird. Die Knotenfarbe basiert auf der Log2-Fold-Änderung relativ zu NTG. Die Skala ist mit FC gekennzeichnet und ein Balken ist von blau nach rot gefärbt.

Bei der herkömmlichen Signalweganalyse können Proteingruppen übersehen werden, da die Signalwegalgorithmen vordefiniert und starr sind. Ein Protein-Protein-Interaktionsnetzwerkansatz (PPI) könnte Signalreaktionen in diesen Modellen besser erfassen, die normalerweise nicht durch Signalweganalyse erkannt werden. Zu diesem Zweck wurde die MoBaS-Analyse22,31 eingesetzt, um dicht verbundene Teilnetzwerke zu identifizieren, die miteinander in Beziehung stehen und in Tg-Modellen eine unterschiedliche Phosphorylierung aufweisen könnten. Es wurden mehrere Module identifiziert, und wir haben uns auf die beiden statistisch signifikantesten PPI-Module aus dem globalen TMT-Flow-Through-Datensatz für das gesamte Herz konzentriert. Aus Interpretationsgründen wurden sie als Modul 1 und Modul 2 bezeichnet. Die Substrate der Module 1 und 2 sind in Abb. 6b bzw. d dargestellt.

Interessanterweise zeigte die molekulare Signaturanalyse von PTMsigDB auf Standortebene, dass Modul 1 signifikante ortsspezifische Modifikationen für den EGFR1-Signalweg enthielt. Darüber hinaus zeigten mithilfe der MSigDB-Gen-Protein-Level-Analyse mehrere Signalwege, wie z. B. der ErbB-Signalweg, PDGFRA und fokale Adhäsionswege, statistische Signifikanz. KSEA des Protein-Protein-Netzwerks Modul 1 zeigt eine signifikante Aktivierung von AURKB (Aurora-Kinase B) und CSNK2A1 (Abb. 6c).

In ähnlicher Weise bestätigte die PTMSigDB-Analyse für Modul 2 die Beteiligung des EGFR1-Signalwegs, während MsigDB Aktin-Zytoskelett-, ErbB-Signalisierungs- und fokale Adhäsionspfade detektierte. KSEA des Modul-2-Protein-Protein-Netzwerks zeigt eine signifikante Aktivierung von SRC, MAP2K1, HCK, LCK, SYK, JAK3, JAK2, FYN, PTK6 und ABL1 in R403Q-αMyHC-Mäusen (Abb. 6e). Diese Daten bestätigen, dass MoBAS funktionsrelevante PPI-Module unter den identifizierten pTyr-Peptiden identifizierte und PTMsigDB auf den EFGR1-Signalweg als gemeinsamen Signalweg für HCM aus zwei nicht verwandten Mausmodellen hinwies.

TgErbB2-Mausherzen entwickeln einen konzentrischen Typ von HCM. Diese Veränderung entwickelt sich schnell zu einer pathologischen HCM und zeigt Merkmale wie Fibrose, Kardiomyozyten-Unordnung, gestörte Ca2+-Verarbeitung, Arrhythmien und plötzlichen Tod16. Auf dieser Grundlage stellten wir die Hypothese auf, dass ein Tyrosinkinaserezeptor unter Verwendung von AG-825 (einem ErbB2-Inhibitor) der Aktivität der kardialen ErbB2-Überexpression pharmakologisch entgegenwirken und das Fortschreiten des histopathologischen Phänotyps stoppen würde. Zu diesem Zweck wurden TgErbB2-Mäuse (Alter 6–9 Monate) mit etablierten HCM- und Ntg-Kontrollen zwei Wochen lang zweimal täglich subkutan in einer Dosis von 1 mg/kg mit AG-825 oder DMSO-Vehikel behandelt16. Als nächstes wurde die Myokardfibrose durch Massons Trichrom-Färbung beurteilt. Unbehandelte TgErbB2-Mäuse entwickelten unterschiedliche Ausmaße an Fibrose des linken Ventrikels (Abb. 7a, b); TgErbB2-behandelte Mäuse zeigten jedoch weniger Fibrose (Abb. 7b). Im Gegensatz dazu wurde die Herzhistologie bei Ntg-Mäusen durch die AG-825-Behandlung nicht beeinflusst. Wir verwendeten CytoSpectre32, eine webgrafische Benutzerschnittstelle, um die Auswirkungen von AG-825 auf die Kardiomyozyten-Unordnung zu charakterisieren. Diese Interphase bestimmt die lokale Ausrichtung von Strukturen, einschließlich Herzmuskelzellen, über histologische Schnitte hinweg, ähnlich der zuvor vom Seidman-Labor beschriebenen Analyse33. Zufällig ausgewählte Bereiche von Interesse sind in Abb. 7a dargestellt und erhöhen die Vergrößerung der Mikrofotografien von 5X auf 40X (Abb. 7b). Die Winkelvarianz der Myozytenorientierung wurde ausgewertet, als kreisförmige Varianz bezeichnet und bedeutet Orientierungswinkelvarianz. Mit dem Vehikel behandeltes Ntg (Abb. 7c) unterschied sich im Vergleich zu mit Ntg AG-825 behandeltem (Abb. 7c) nicht signifikant (Abb. 7d), wie bereits beschrieben33. Im Gegensatz dazu zeigten mit dem Vehikel behandelte TgErbB2-Mäuse-Kardiomyozyten eine Orientierungswinkelvarianz, die sich wesentlich von der Ntg-Vehicle-Kontrolle unterschied; siehe die heterogene und breitere Form des Orientierungsdiagramms in Abb. 7c. Überraschenderweise zeigten Kardiomyozyten von TgErbB2-Mäusen, die mit AG-825 behandelt wurden, deutlich weniger Unordnung, wie durch die signifikante Rückkehr der zirkulären Varianz und Form des Diagramms zu den mit Ntg-Vehikel oder AG-825 behandelten Kontrollen gezeigt wurde (Abb. 7e, p = 0,0014 nach Ein- Weg-ANOVA). Diese Analyse legt nahe, dass Kardiomyozyten von TgErbB2-Mäusen, die mit AG-825 behandelt wurden, eine deutlich geringere Myozyten-Unordnung aufwiesen, was durch eine verringerte zirkuläre Varianz angezeigt wird.

a Masson-Trichrom-gefärbte Schnitte (5X) von mit Vehikel behandelten Ntg- und AG-825-behandelten Ntg- und Vehikel-behandelten TgErbB2- und AG-825-behandelten TgErbB2-Mäusen; gelbe Pfeilspitzen zeigen auf fibrotische Bereiche. Maßstabsleiste 1 mm. b Massons Trichrom-gefärbte Schnitte (40fach) aus repräsentativen Regionen von Interesse zeigen eine erhöhte Fibrose im Myokard von TgErbB2-Mäusen, wobei sich die Fibrose nach zweiwöchiger Behandlung mit AG-825 verbesserte. Die gleichen Bereiche wurden verwendet, um den Grad der Herzmuskel-Unordnung zu bestimmen, was durch Analyse der Zellorientierung mit der CytoSpectre-Software von Vehicle und AG-825-behandelten Ntg- und TgErbB2-Mausherzschnitten (Maßstab 50 μm) erreicht wurde. c Diagramme der Verteilung der Ausrichtungswinkel der Herzzellen. Beachten Sie, dass die Ntg-Winkel homogen sind und sich in der mit AG-825 behandelten Gruppe nicht verändert haben. Im Gegensatz dazu zeigte Tg, das mit Vehikel behandelt wurde, weniger homogene und unterschiedliche Orientierungswinkel, was die Unordnung der Kardiomyozyten bestätigte. Die Behandlung mit AG-825 reduziert die Unordnung der Kardiomyozyten und die Orientierungskurve ähnelt der der mit AG-825 behandelten NTG-Gruppe. d Mittlerer Orientierungswinkel der Herzmuskelzellen und e Zirkuläre Varianz, ein weiteres Maß für die Isotropie, bei Ntg- und TgErbB2-Mäusen mit und ohne AG-825-Behandlung (n = 5 Tiere pro Bedingung). Diagrammbalken werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt; Für statistische Vergleiche wurde ein einseitiger ANOVA-Test durchgeführt, der eine signifikante Verbesserung bei mit AG-825 behandelten TgErbB2-Mäusen zeigte (p-Wert < 0,0014). f Die kardiale Echokardiographie der vier Gruppen zeigt, dass die 14-tägige Behandlung mit AG-825 die kontraktile Funktion nicht veränderte, geschätzt als %-Fraktionsverkürzung.

Als nächstes untersuchten wir den direkten In-vivo-Einfluss der ErbB2-Hemmung durch AG-825 auf die Kontraktilität, Echokardiogramme und Gewebedoppler-Bildgebung, um die diastolische Funktion zu beurteilen. Diese Studien wurden an wachen (nicht anästhesierten) Mäusen zu Studienbeginn und nach zweiwöchiger Behandlung durchgeführt. Wir verwendeten ein Vevo 2100 High-Resolution Imaging System mit einem 40-MHz-Wandler (VisualSonics®, Toronto). Die Daten wurden anschließend mit einer Advanced Cardiocular Package Software analysiert. Die untersuchten Parameter waren Kammerabmessungen, fraktionelle Verkürzung, Auswurffraktion und Gewebe-Doppler-Geschwindigkeitsdynamik. Funktionsdaten des linken Ventrikels, die durch parasternale Kurzachsen-Echokardiographie-Bildgebung erhalten wurden, ergaben keine signifikante Änderung der mittleren fraktionellen Verkürzung über die Zeit bei TgErbB2-Mäusen, die mit Vehikellösung behandelt wurden, im Vergleich zu Ntg (Abb. 7f). In ähnlicher Weise zeigten mit AG-825 behandelte TgErbB2-Mäuse im Laufe der Zeit keine signifikanten Veränderungen der kontraktilen Funktion im Vergleich zu mit Ntg AG-825 behandelten Mäusen (Abb. 7f). Die Gewebedoppler-Bildgebung ergab keine signifikanten Unterschiede in der diastolischen Funktion; siehe vollständige Echokardiographiedaten in den Zusatzdaten 6. Diese Daten legen nahe, dass die pharmakologische Hemmung von ErbB2 den pathologischen Umbau stoppte oder umkehrte, indem sie die fibrotische Reaktion reduzierte und die Ausrichtung der Kardiomyozyten wiederherstellte. Diese Reaktion ging jedoch nicht mit der Erhaltung der kontraktilen LV-Funktion in vivo bei TgErbB2-Mäusen einher.

Wir haben die Phosphoproteomik von TgErbB2 und NTg erneut untersucht, um bioinformatische Ergebnisse von KSEA zu validieren und den Einfluss des Tyrosinkinase-Inhibitors AG-825 auf das Proteom zu untersuchen. Wir verwendeten einen TMT-13-Plex-Markierungsansatz, um das Phosphorylierungsprofil des gesamten Herzens von Ntg- und TgErbB2-Mäusen zu vergleichen, die mit Vehikel oder AG-825 (ErbB2-Inhibitor) behandelt wurden. Kurz gesagt wurde ein TMT 13-Plex wie folgt durchgeführt; Ntg-Vehicle (n = 3), Ntg-AG-825-Behandlung (n = 3), TgErbB2-Vehicle (n = 3) und TgErbB2-AG-825-Behandlung (n = 4). Ganze Herzproteinlysate wurden aus thermisch stabilisierten Herzen isoliert und wie in Abb. 2 und „Material und Methoden“ beschrieben verarbeitet. Der größte Teil des Materials wurde zur Anreicherung von pS/pT/pY-Peptiden verwendet, und ein kleiner Teil ist markiert, um das gesamte Proteom mit TMT zu quantifizieren. Wie im vorherigen Experiment in Abb. 2 beschrieben, wird die Intensität der pS/pT/pY-Peptide auf die Intensität der TMT-Signale des vollständigen Proteoms normalisiert. Insgesamt wurden 6614 Proteine, 4732 phosphorylierte Serin- und Threoninpeptide und 346 pTyr-Peptide durch TMT-Reporterionen quantifiziert. Der vollständige Datensatz ist in Supplementary Data 7 verfügbar.

Heatmaps hierarchisch geclusterter hoch- oder herunterregulierter normalisierter Serin/Threonin-phosphorylierter oder Tyrosin-phosphorylierter Peptidintensitäten bestätigen den Einfluss des Genotyps auf die gesamte Phosphoproteom-Remodellierung, Serin- und Threonin-Phosphorylierung (Abb. 8a) und pTyr (Abb. 8b). Wir haben Daten direkt mit MSigDB und PTMSigDB abgefragt, um Ntg-Mäuse mit TgErbB2-Mäusen zu vergleichen. Wie erwartet bestätigten wir die Beteiligung des EGFR1-Signalwegs durch PTMSigDB an der Herzhypertrophie von TgErbB2-Mäusen, die mit Vehikel (Abb. 8c, d) oder AG-825 (Abb. 8e, f) behandelt wurden. Außerdem bestätigten wir die Beteiligung von fokaler Adhäsion und extrazellulären Matrixwegen durch MSigDB bei mit Vehikel behandelten Mäusen sowie dilatative Kardiomyopathie, HCM und arrhythmogene Kardiomyopathie des rechten Ventrikels (ARCV) bei mit AG-825 behandelten Mäusen. Allerdings hatte die 14-tägige Behandlung mit AG-825 bei TgErbB2-Mäusen einen subtilen Effekt, der bei MsigDB oder PTMsigDB nicht erkennbar war. Da wir das gesamte Phosphoproteom einbezogen haben, haben wir die Kinaseaktivität im Serin- und Threonin-Phosphorylierungspeptid geschätzt. Die am stärksten hoch- und herunterregulierten Kinasen wurden mithilfe von KSEA identifiziert und das Ergebnis ist in Abb. 8g dargestellt. Die vollständige KSEA- und Pathway-Analyse ist in den Ergänzungsdaten 5 und 7 verfügbar. Wir haben die Aktivität der Kinasen bei mit AG-825 behandelten Tieren im Vergleich zu ihrer Kontrolle (Vehikelbehandlung) verglichen. Wir identifizierten eine kleine Gruppe von Kinasen, die durch die AG-825-Behandlung und nicht durch die Vehikelbehandlung deutlich gehemmt oder herunterreguliert wurden (siehe hervorgehobenes rotes Rechteck in Abb. 8g). Um weitere Einblicke in die funktionellen Auswirkungen aus systembiologischer Sicht zu erhalten, haben wir die Beziehung dieser Kinasen mithilfe der Visualisierungssoftware The Signaling Network Open Resource (Signor 2.0) untersucht34. Abbildung 8h zeigt, dass die meisten dieser Kinasen stromabwärts von EGFR liegen, hervorgehoben durch blaue gepunktete Kreise. Insgesamt deuten unsere Daten darauf hin, dass EGFR1 für die Hypertrophie von TgErbB2 von zentraler Bedeutung ist und dass die Behandlung mit AG-825 ErbB2 und EGFR hemmt; Daher ist eine erhebliche Untergruppe von Zielen stromabwärts der EGFR-Signalkaskade betroffen.

a Eine Heatmap wurde verwendet, um die unbeaufsichtigte hierarchische Clusterbildung von Ser/Thr-Peptiden zu visualisieren, und b pTyrosin-Peptide wurden durch ANOVA auf die vollständige Proteomexpression mit einem p-Wert < 0,05 normalisiert. Überrepräsentiert (gelb) und unterrepräsentiert (blau). c Vulkandiagramme, die die Log2-Faltungsänderung und den –Log10-p-Wert jedes pSer/pThr-Peptids und d pTyr-Peptids im paarweisen Vergleich von Ntg und TgErbB2 nach zweiwöchiger Vehikelbehandlung zeigen. e Vulkandiagramme, die die Log2-Faltungsänderung und den –Log10-p-Wert jedes pSer/pThr-Peptids und f pTyr-Peptids im paarweisen Vergleich von Ntg und TgErbB2 nach zweiwöchiger AG-825-Behandlung zeigen, (g) KSEA wird rot angezeigt Rechteck der Kinasen, die durch AG-825 deutlich gehemmt werden. KSEA und Pathway Enrichment Analysis der kombinierten Ser/Thr/Tyr-Phosphorylierungsdatenanalyse mit PTMSigDB bestätigen, dass der EGFR1-Pathway maßgeblich beteiligt ist. h Die Analyse der Signaling Network Open Resource (Signor 2.0) zeigt, dass neun Kinasen am EGFR-Signalweg beteiligt sind. Im Netzwerk und auch in KSEA gefundene Kinasen sind in gepunkteten blauen Kreisen eingekreist. Neben dem Weg wird der Symbolcode des Netzwerks angezeigt.

Die vorliegende Studie zeigt, dass das pTyr-Proteom des Herzens in Proteinen im Zusammenhang mit Kardiomyopathien, Serin/Threonin und Tyrosinkinasen in zwei pathogenetisch nicht verwandten Modellen der Hypertrophie-Kardiomyopathie (HCM) verändert ist, nämlich der herzspezifischen Überexpression von ErbB2 und der allelischen Expression von R403Q-αMyHC. Darüber hinaus ist auch das Serin/Threonin-Phosphoproteom des Herzens in der Herzhypertrophie des TgErbB2-Mausmodells verändert. Insgesamt deuten unsere Daten darauf hin, dass die Aktivierung des EGFR-Signalwegs eine zentrale Rolle bei der Herzhypertrophie spielt, die aus zwei sehr unterschiedlichen Mausmodellen hervorgeht.

Die kontraktile Dysfunktion bei Herzinsuffizienz ist teilweise auf die Desensibilisierung des Myofilaments Ca2+ zurückzuführen. Eine veränderte Serin/Threonin-Phosphorylierung des Herzsarkomers und eine verringerte Ca2+-Empfindlichkeit des Myofilaments sind Merkmale menschlicher und experimenteller Modelle der Herzinsuffizienz und spielen eine Rolle in der Pathophysiologie von HCM und DCM7,35,36. Wir haben zuvor pTyr im menschlichen Herz-Troponin I Y26 identifiziert, das bei menschlicher Herzinsuffizienz und DCM14 herunterreguliert war. Es gibt jedoch noch keine Studien, die sich mit den Auswirkungen global fehlregulierter kardialer pTyr auf die Pathogenese von Herzerkrankungen befassen.

Hier zeigen wir Hinweise darauf, dass im Herzen von TgErbB2-Mäusen das Tyrosin-Phosphoproteom auf unterschiedliche Weise verändert wird, nämlich durch Hochregulierung und Herunterregulierung von Tyrosin-Phosphopeptiden. Die MsigDB-Signalweganalyse zeigte die Beteiligung von ARVC-, HCM-, DCM- und Integrin-AlphaIIB-Beta3-Signalen in TgErbB2-Mäuseherzen. Die meisten Sarkomerproteine ​​wiesen eine signifikante Herunterregulierung von pTyr auf, wie etwa Myh7-Y386, Y410, Y1375, Myh6-Y1349 und Ttn-Y2118, Y21190, mit Ausnahme von Ttn-Y31324, das hochreguliert war. Die Richtungsänderung von pTyr in diesen Sarkomerproteinen ist eine Herunterregulierung, genau wie es für menschliches cTnI Y26 bei Herzinsuffizienz und DCM berichtet wurde. Über die Rolle von pTyr in Sarkomerproteinen ist nur sehr wenig bekannt. Tatsächlich hat nur eine Gruppe37 die potenziellen Tyrosinkinasen untersucht, die cTnI phosphorylieren. Sie zeigten in vitro, dass c-Src und ein weiteres Mitglied der Src-Kinasen-Familie, Lyn, das cTnIY26 phosphorylieren, und berichteten, dass die Nachahmung von Phosphorylierung und Pseudophosphorylierung an dieser Stelle die Ca2+-Empfindlichkeit der Myofilamente verringerte, was durch die veränderte Kraft-Kalzium-Reaktion der Myofilamente belegt wurde. Bemerkenswert ist, dass die cTnI-Y113-Phosphorylierung, eine neu entdeckte Stelle, in R403Q-αMyHC-Mäusen herunterreguliert wurde. Wir haben auch eine signifikante Herunterregulierung von pTyr in Ttn-Y1881, Y1902 und Y33864 nachgewiesen. Im Gegensatz zu TgErbB2-Mäusen war Myh7-Y410 in R403Q-αMyHC-Mäusen hochreguliert. pTyr bei Myh7-410 liegt in der Nähe von R403Q αMyHC und könnte einen funktionellen Einfluss haben, da es sich im motorischen Domänenkopf von αMyHC befindet. Die ortsspezifischen Auswirkungen dieser Änderungen sind einer weiteren Untersuchung wert; Dies liegt jedoch außerhalb des Rahmens der vorliegenden Arbeit. Interessanterweise ist in den R403Q-αMyHC-Herzen auch das pTyr-Proteom unterschiedlich verändert. Bei R403Q-αMyHC-Mäusen erreichten jedoch mehr Phosphotyrosinpeptide statistische Signifikanz. Im Gegensatz zu TgErbB2 zeigte die MsigDB-Signalweganalyse, dass R403Q-αMyHC-Mäuse Veränderungen in den Signalwegen des Tyrosinkinaserezeptors, des Angiopoetinrezeptors, ErbB und des Wachstumshormonrezeptors aufwiesen. PTMsigDB hingegen zeigte eine Veränderung des EGFR1-Signalwegs und ein Plattenepithelkarzinom auf. Wir gingen davon aus, dass eine Überexpression einer Rezeptortyrosinkinase in TgErbB2-Mäuseherzen zu einer signifikanteren Veränderung des pTyr-Proteoms führen würde. Die Daten deuten jedoch darauf hin, dass eine einzelne Sarkomer-Punktmutation, wie im Fall von R403Q-αMyHC-Mäusen, einschneidend genug ist, um das pTyr-Proteom des Herzens signifikant zu verändern. Die Top-Down-Proteomik38 zeigte, dass konsistente Veränderungen von cTnI, ENH2 und anderen Z-Disk-Protein-Phosphorylierungen im HCM-Myokard besser mit dem Phänotyp korrelierten, unabhängig von der krankheitsverursachenden Mutation am einzelnen Sarkomerpunkt. Die Mechanismen, die eine pathogene Mutation in der schweren Kette von Myosin (R403Q-αMyHC) auf die pTyr-Regulation beeinflussen können, sind unbekannt und erfordern weitere Untersuchungen.

Die globale pTyr-Dysregulation im TgErbB2-Mausmodell ist von wesentlicher Bedeutung, da sie eine ausgeprägte Herzhypertrophie, eine Sarkomerdysfunktion und eine abnormale Kalziumverarbeitung16 mit Veränderungen in den Tyrosinkinasewegen in Verbindung bringt. Andererseits erhöht die pharmakologische Hemmung von ErbB2 (HER2/neu) mit dem Inhibitor Lapatinib bei Brustkrebspatientinnen, die mit Doxorubicin behandelt werden, das Risiko einer Herzinsuffizienz im Vergleich zu Patientinnen, die nur mit Doxorubicin behandelt werden39. Dies deutet darauf hin, dass die Aufrechterhaltung der pTyr-Homöostase für die Regulierung der Funktion und Homöostase der Kardiomyozyten notwendig sein könnte.

In dieser Studie wurde mit pTyr eine Vielzahl anderer funktionell relevanter Ziele identifiziert, von Sarkomerproteinen bis zur Z-Scheibe, Zwischenfilamenten (wie Desmin), Desmosomenkomponenten, fokaler Adhäsion und Adherence-Junction-Proteinen, Membranrezeptoren, Kinasen und Phosphatasen . Beispielsweise wurde pTyr in mehreren Z-Disk-assoziierten Proteinen festgestellt (eine vollständige Liste finden Sie in den Zusatzdaten 2, 3 und 6). Z-Disk-Proteine ​​sind entscheidend für Muskelkontraktion und mechanischen Stress, Wachstum und Stoffwechselsignale40. Außerdem wurde in beiden Mausmodellen eine Veränderung der Phosphorylierungsniveaus des Desmosom-Schlüsselbestandteils Plakophilin-2-Protein (Pkp2)-Peptids Pkp2-Y119 festgestellt, nämlich eine Hochregulierung bei R403Q-αMyHC Tg und eine Herunterregulierung bei TgErbB2. Der funktionelle Effekt einer Hoch- oder Herunterregulierung der Pkp2-Y119-Phosphorylierung ist nicht bekannt. Allerdings stört die homozygote Deletion von Pkp2 die Herzarchitektur und ist für den Embryo tödlich41. Im Herzen ist Pkp2 für den Aufbau des Desmosoms und der PKC-Aktivität erforderlich42. Autosomal-dominante Mutationen in diesem Gen sind für 25 bis 50 % der ARVC verantwortlich. Interessanterweise weisen TgErbB2-Mäuse eine erhöhte Anfälligkeit für Arrhythmien und myofibrilläre Störungen auf16, ähnlich wie Patienten mit Myosinmutationen und HCM. Veränderungen der Pkp-Y119-Phosphorylierung könnten sich auf den Phänotyp auswirken.

Der EGFR1 (ErbB1)-Signalweg spielt in beiden Tg-Modellen eine zentrale Rolle bei der Herzhypertrophie. Die pharmakologische Hemmung von EGFR unter Verwendung von AG-1478 schützt in vitro und in vivo vor Angiotensin II-induzierter Herzhypertrophie43. Die konzentrische Hypertrophie, die mit der herzspezifischen Überexpression von ErbB2 verbunden ist, kann durch die frühe Verabreichung von Lapatinib umgekehrt werden, das zusätzlich zu ErbB2 die EGFR-Rezeptor-Tyrosinkinase12 hemmt. In dieser Studie reduzierte die pharmakologische Blockade des ErbB2-Rezeptors durch AG-825 bei erwachsenen TgErbB2-Mäusen die Myozytenstörung, bewahrte jedoch weder die Herzfunktion noch veränderte sie die Herzhypertrophie. Wir glauben, dass die fehlende Reaktion mit dem Alter der Mäuse zum Zeitpunkt der Verabreichung zusammenhängt: In der aktuellen Studie verwendeten wir erwachsene Mäuse, während in früheren Studien Jungtiere verwendet wurden15. Wir haben auch das kardiale Serin/Threonin- und pTyr-Proteom in TgErbB2 nach Vehikel- oder AG-825-Behandlung untersucht. Wir fanden globale Veränderungen im Phosphoproteom (Abb. 8), die die Beteiligung des EGFR-Signalwegs bestätigten. Darüber hinaus bestätigten wir die Veränderungen der fokalen Adhäsion, der extrazellulären Matrix, der DCM-, HCM- und ARCV-Signalwege. Wir haben KSEA verwendet, um die Ergebnisse mit einer Untergruppe aktivierter Kinasen zu verknüpfen und sie auf die 40 repräsentativsten Serin-/Threonin- und Tyrosinkinasen einzugrenzen, die im Herzproteom von Ntg- und TgErbB2-Mäusen nachgewiesen wurden. Die Behandlung mit AG-825 könnte die Aktivierung von 14 Kinasen, die dem EGFR-Signalweg entsprechen, hemmen oder deutlich reduzieren (Abb. 8g, h), was darauf hindeutet, dass die Behandlung mit AG-825 wirksam und spezifisch war. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass sich Veränderungen des Herzproteoms auf Serin/Threonin und pTyr erstrecken, was die Beteiligung der oben beschriebenen Wege bestätigt. Darüber hinaus deuten diese Daten darauf hin, dass durch die AG-825-Behandlung induzierte Veränderungen im Phosphoproteom mit einer Verbesserung der Herzmuskelstörung einhergingen.

Die KSEA implizierte eine deutliche Herunterregulierung von Mitgliedern des kanonischen MAPK-Signalwegs stromabwärts von k-Ras in TgErbB2-Mäusen. Umgekehrt beobachteten wir bei R403Q-αMyHC-Mäusen eine Hochregulierung der fokalen Adhäsion und der PDGFR-beta-Signalwege (SRC, LYN, LCK, JAK2, INSR, MAPK1 und HCK). Noch wichtiger ist, dass die Modularity-Base-Scoring-Analyse (MoBas) Protein-Protein-Interaktions-Subnetzwerke identifizierte, die mit ErbB, PDGFRA und fokalen Adhäsionswegen sowie der Aktivierung von Aurora-Kinase B und CSNKA1 angereichert sind. Diese Daten deuten darauf hin, dass sich viele Ziele in beiden transgenen Modellen der Herzhypertrophie überschneiden. Obwohl es deutliche Unterschiede bei den vorgeschalteten Regulatoren von ErbB2 und der schweren Kette von Myosin gibt, kommen viele nachgeschaltete Effektormoleküle häufig vor und können von niedermolekularen Inhibitoren (ursprünglich zur Behandlung verschiedener Krebsarten entwickelt) angegriffen werden, um die Herzhypertrophie zu blockieren.

Der MAPK-Signalweg ist an der adaptiven und maladaptiven Reaktion beteiligt, die zu einer Herzhypertrophie führen könnte (zur Überprüfung44). Der RAS-RAF-MEK-ERK-Signalweg ist ein attraktives Ziel für onkologische therapeutische Interventionen. Mehrere selektive niedermolekulare RAF- und MEK-Inhibitoren wurden in klinischen Studien getestet45. Die vorliegende Studie ergab eine erhöhte Phosphorylierung bei MAPK1-Y185, die die Kinase in R403Q-αMyHC aktiviert, und die MAPK1-Aktivität steht in direktem Zusammenhang mit der Herzhypertrophie46. Die c-Src, die zentrale Kinase ihrer Familie, könnte einer der potenziellen Regulatoren für die in R403Q-αMyHC beobachteten pTyr-Proteomveränderungen sein, da sie den EGFR-Rezeptor stromaufwärts und unter anderem Stat stromabwärts phosphoryliert. c-Src beeinflusst die Reaktion auf mechanische Dehnung der Kardiomyozyten, indem es eine Kaskade intrazellulärer Signale in Kardiomyozyten in Richtung einer hypertrophen Reaktion auslöst47,48. Außerdem phosphoryliert c-Src PXN-Y11849, und diese Stelle wies bei R403Q-αMyHC-Mäusen einen 25-fachen Anstieg der Phosphorylierung auf. Interessanterweise vermittelt c-Src die Aktivierung von MAPK1 und MAPK3 als Reaktion auf Drucküberlastung47. Insbesondere hat eine frühere Studie gezeigt, dass die durch Drucküberlastung induzierte Herzhypertrophie bei R403-αMyHC Tg-Mäusen verschlimmert wird50, was darauf hindeutet, dass der Mechanismus, durch den die R403-αMyHC-Mutation eine Herzhypertrophie erzeugt, darin besteht, Zellen für durch Drucküberlastung induzierte Signale über c zu sensibilisieren -Src.

R403Q-αMyHC-Mäuse zeigten eine verstärkte JAK2-, STAT5A- und STAT5B-Phosphorylierung an den Aktivierungsstellen (Y570, Y694 bzw. Y699), was nicht nur auf eine Aktivierung des MAPK-Signals, sondern auch auf eine Aktivierung des JAK-STAT-Signals hinweist. Jak-Stat-Signalisierung: Der IL-6-Signalweg wird als Reaktion auf die IL-6-Zytokinfamilie (IL-6, Cardiotrophin 1 und Leukämie-Inhibitor-Faktor) aktiviert, interagiert mit dem EGFR-Signalweg und ist an der Herzhypertrophie beteiligt. Dieser Signalweg hat kardioprotektive Wirkungen, eine chronische Aktivierung kann jedoch zu einer Herzhypertrophie führen (Übersicht in Lit. 44). Vakrou und Kollegen führten eine Pathway-Analyse der miRNA-Profile von R403Q-αMyHC durch. Diese Autoren fanden Ähnlichkeiten mit den in dieser Arbeit beschriebenen Ergebnissen, wie z. B. eine Überaktivierung der Chemokin-Signalwege (CXCR4), des Aktin-Zytoskeletts und der Signalwege für Herzhypertrophie51. Diese Ergebnisse legen eine wesentliche Beteiligung der pTyr-Regulation in Myofilamenten und anderen Herzproteinen nahe. Die aus diesen Studien gewonnenen Erkenntnisse könnten neue Therapieansätze bei HCM im Zusammenhang mit Sarkomermutationen und möglicherweise anderen mit HCM verbundenen Erkrankungen liefern. Die Studien beschränkten sich auf zwei transgene Mausmodelle, die eine Herzhypertrophie entwickeln; Andere Modelle für Sarkomermutationen oder Drucküberlastung wie Aortenbandbildung könnten untersucht und verglichen werden. Einige relevante Tyrosin-phosphorylierte Stellen könnten aufgrund ihrer niedrigen Stöchiometrie und technischen Herausforderungen übersehen werden. Dieses Problem gilt insbesondere für membrangebundene Proteine, die in phosphoproteomischen Studien schwer zu bewerten sind.

Diese Studie zeigt, dass veränderte pTyr-Muster in zwei verschiedenen HCM-Modellen auffallen. Darüber hinaus können ätiologisch unterschiedliche Formen von HCM trotz einiger gemeinsamer Standorte spezifische pTyr-Signaturen aufweisen, die darauf hinweisen, dass der EGFR-Signalweg in beiden transgenen Modellen von zentraler Bedeutung ist. Dieser Beweis kann in Kombination mit der Hemmung einer spezifischen Rezeptortyrosinkinase unter Verwendung von Tyrphostin AG-825 die Unordnung der Kardiomyozyten umkehren und Ansätze zur Manipulation des pTyr-Proteoms als therapeutischen Ansatz für HCM rationalisieren. Darüber hinaus deuten diese Studien darauf hin, dass Tyrosinkinase-Inhibitoren, die heute häufig in der Krebstherapie eingesetzt werden, die Herzfunktion verändern können, indem sie die Tyrosinkinase- und Serin/Threonin-Kinase-Profile des Herzens direkt verändern.

Ganzherzlysate aus hitzestabilisiertem Gewebe wurden in 1 % SDS-Puffer resuspendiert, 10–15 μg wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrozellulosemembranen übertragen. Die Membranen wurden mit 5 % BSA in TBS-T-Puffer (20 mmol/l Tris, pH 7,4, 150 mmol/l NaCl und 0,1 % Tween 20) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert und dann mit einer primären Antikörperverdünnung von 1:1000 inkubiert in 1 % BSA-TBS-T; Phospho-Tyrosin-Maus-mAb (pTyr-100, Kat.-Nr. 9411SCST), TnI-Kaninchen-Ab (Kat.-Nr. 4002SCTS), Src-Kaninchen-Ab (Kat.-Nr. 2108SCST), Phopsho-Src-Familie (Tyr416), Kaninchen-mAb (D49G4 , Kat.-Nr. 6943T CST), GAPDH Rabbit Ab (14C10, Kat.-Nr. 2118S CST) bei 4 °C über Nacht. Nach fünfmaligem Waschen wurden die Sekundärantikörper 1:10.000 in 1 % BSA-TBS-T (Anti-Kaninchen-IgG-HRP-gebunden (Kat.-Nr. 7074S CTS), Anti-Maus-m-IgGk-BP-HRP (Kat.-Nr. 7074S CTS) verdünnt . Nr. sc-516102, Santa Cruz) und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Membranen mit Supersignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo) entwickelt und die immunreaktiven Banden durch Chemilumineszenz mit einem iBright 1500 (Invitrogen) nachgewiesen ). Die Bilder wurden mit der Image J-Software aufgenommen und analysiert. Eine einfache ANOVA wurde verwendet, um Gruppen zu vergleichen und die statistische Signifikanz zu bestimmen.

Alle Protokolle wurden gemäß dem „Guide for the Use and Care of Laboratory Animals“ durchgeführt, der von den National Institutes of Health und der Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee veröffentlicht wurde. Die Mäuse TgErbB2 (B6SJLF1/J-Färbung) und R403Q-αMyHC (C57/Bl6) wurden von Dr. K. Gabrielson bzw. Dr. LA Leinwand16,17 erhalten, um Brutkolonien zu gründen. Männliche oder weibliche Mäuse (6–9 Monate) wurden mit einer Überdosis Natriumpentobarbital IP (75 mg/kg) oder Isofluran (5 %) anästhesiert; Die Herzen wurden schnell präpariert, gefolgt von einer thermischen Stabilisierung (Denator T1 Heat Stabilizor, Schweden) und bis zur Analyse bei –80 ° C gelagert. TgErbB2- und R403Q-αMyHC-Mäuseherzen (n = 5 pro Gruppe) wurden parallel verarbeitet. Um Ganzherzlysate zu erhalten, wurden Herzventrikel (~200 mg) auf eiskaltem Puffer homogenisiert: 20 mM HEPES, pH 7,6, 1 mM, 1,5 mM Natriumpyrophosphat, PhosStop und 9 M Harnstoff bei 10 μl/mg (Nassgewicht). von Gewebe). Das Homogenat wurde auf Eis gekühlt, gefolgt von einer kurzen Mikrospitzenbeschallung auf Eis und einer 15-minütigen Zentrifugation bei 10.000 × g bei 4 ° C. Der Überstand wurde entnommen und die Proteinkonzentration mit der Methode von Lowry (Bio-Rad) bestimmt.

Protein aus Herzlysaten wurde in 5 mM Dithiothreitol (DTT) bei 60 °C für 20 Minuten reduziert und in 10 mM Iodacetamid (IDA) bei Raumtemperatur für 15 Minuten im Dunkeln alkyliert. Jede Probe (30 mg pro Maus, n = 5 Mäuse pro Genotyp) wurde mit Trypsin der Proteomics-Qualität (Promega) im Verhältnis 1:200 in 2 M Harnstoff, 20 mM HEPES-Puffer, pH 8,0 bei Raumtemperatur über Nacht verdaut. Der Aufschluss wurde mit Trifluoressigsäure (1 % TFA) beendet. Die Proben wurden zentrifugiert (5 Minuten bei 1800 g) und die Überstände wurden durch Festphasenextraktion (SepPak C18 10-ml-Kartusche, Waters) entsalzt. Die Elutionsmittel wurden drei Tage lang bei –20 °C lyophilisiert.

Insgesamt 150 mg trypsinisierte Peptide pro Genotyp wurden gepoolt und mit pTyrosin angereichert, wie zuvor beschrieben52. Lyophilisierte Peptide wurden in 1,4 ml Immunpräzipitationspuffer (IAP-Puffer 50 mM MOPS, pH 7,2, 10 mM Natriumphosphat, 50 mM NaCl, pH 7,0) gemischt. Eine Stammlösung aus Protein-Agarose-G-Kügelchen (Santa Cruz Biotechnology) 80 μl Aufschlämmung wurden mit 300 μg monoklonalem Phospho-Tyrosin-Maus-Antikörper (p-Tyr-100, Cell Signaling Technology) konjugiert. Das Perlen-Anti-p-Tyr-Antikörper-Konjugat wurde in das Peptidröhrchen überführt und unter sanfter Rotation 2 Stunden lang bei 4 °C inkubiert. Die Perlen wurden mit 55 μl bzw. 45 μl 0,15 % Trifluoressigsäure (TFA) gewaschen und eluiert. Die beiden Elutionsausbeuten wurden gepoolt. Die resultierenden Peptidmischungen wurden durch Festphasenextraktion (Stufenspitzen C18, Thermo Scientific) gereinigt. Die Proben wurden durch Vakuumzentrifugation getrocknet. Dieser Ansatz wurde dreimal wiederholt, wobei Proben aus allen drei Gruppen parallel untersucht wurden, 15 Herzen pro Genotyp in drei technischen Replikaten. Der Immunpräzipitationspuffer-Durchfluss wurde für den anschließenden TMT-9-Plex bei –80 °C gelagert. Gemäß den Anweisungen des Herstellers wurden tryptische Peptide entsalzt und mit 9-plex isobarem TMT (Thermo Scientific) markiert. Die Markierungsreaktion wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur durchgeführt, gefolgt von einem Abschrecken mit 100 mM Tris.HCl (pH 8,0).

Phosphopeptide wurden in 10 μl 0,1 % TFA, 2 % ACN (v/v) gelöst, gefolgt von einer RF-HPLC-ESI-MS/MS-Analyse. Phosphopeptide wurden auf einer C18-Umkehrphasensäule mit einem linearen Gradienten von Acetonitril (4–40 %) 120 Minuten lang getrennt und dann auf einem LTQ-Orbitrap Elite MS (ThermoFisher Scientific) mit durch Neutroverlust ausgelöstem HCD analysiert.

Rohe MS-Daten wurden mit Mascot 2.3 durchsucht und eine markierungsfreie Quantifizierung mit MS1-extrahierten Ionenchromatogrammen wurde mit der MaxQuant-Software durchgeführt.

Die Peptide wurden auf dem Orbitrap Fusion Lumos Tribrid (Thermo Scientific) in Verbindung mit dem Nanoflow-Flüssigkeitschromatographiesystem Easy-nanoLC 1200 (Thermo Scientific) analysiert. Die Peptide aus jeder Fraktion wurden in 10 % Ameisensäure rekonstituiert und auf eine Acclaim PepMap100 Nano Trap-Säule (100 μm × 2 cm) (Thermo Scientific) geladen, die mit 5 μm großen C18-Partikeln mit einer Flussrate von 5 μl pro Minute gefüllt war. Peptide wurden bei einer Flussrate von 250 nl/min unter Verwendung eines linearen Gradienten von 10 bis 35 % Lösungsmittel B (0,1 % Ameisensäure in 95 % Acetonitril) über 120 Minuten auf der EASY-Spray-Säule (50 cm × 75 µm ID, PepMap RSLC) aufgelöst C18 und 2 µm C18-Partikel) (Thermo Scientific). Es war an einer EASY-Spray-Ionenquelle angebracht, die mit einer Spannung von 2,0 kV betrieben wurde. Die massenspektrometrische Analyse wurde datenabhängig mit vollständigen Scans von m/z 350 bis 1500 durchgeführt. Sowohl MS als auch MS/MS wurden mit dem Orbitrap-Massenanalysator erfasst und gemessen. Vollständige MS-Scans wurden mit einer Auflösung von 120.000 bei m/z 200 gemessen. Vorläuferionen wurden mithilfe einer Kollisionsdissoziationsmethode mit höherer Energie fragmentiert (35) und mit einer Massenauflösung von 30.000 bei m/z 200 nachgewiesen. Es wurde Proteome Discoverer 2.4 verwendet zur Identifizierung und Quantifizierung gegen uniport_mouse_120119_UP000000589. Die verwendeten Suchparameter sind wie folgt: (a) Trypsin (bis zu zwei fehlende Spaltungen), (b) minimale Aminosäurelänge: 6, (c) minimale Peptide für Protein: 1, (d) Feste Modifikationen TMT6plex an jedem N- Terminus und Lyserest, Carbamidomethylierung von Cystein, (e) Dynamische Modifikationen: Oxydation an Methionin, Acetyl am N-Terminus, Met-Verlust an M und Met-Verlust + Acetyl an M und (f) 1 % Falscherkennungsrate für Peptid und Protein Ebenen.

Mit Myofilamenten angereicherte Präparate wurden erhalten, indem frisch isolierte Herzen in eiskaltem PBS (Proteinase-Inhibitoren Roche 1X und PhosStop 1X, Roche) gespült, Ohrmuschelgewebe entfernt und Ventrikelgewebe in eiskaltem Standardpuffer (60 mM KCl, 30 mM Imidazol, pH 7,0) zerkleinert wurden , 2 mM MgCl2, Proteinase-Inhibitoren Roche 1X und PhosStop 1X von Roche). Die ventrikulären Gewebe wurden mit einem Homogenisator (Omni Tissue Homogenizer TH) bei maximaler Geschwindigkeit für 2–3 Impulse von 10 Sekunden mit der Lösung auf Eis homogenisiert und 15 Minuten bei 12.000 g zentrifugiert. Die Myofilamentpellets wurden in einer Häutungslösung (10 mK EGTA, 8,2 mM MgCl2, 14,4 mM KCl, 60 mM Imidazol pH 7,0, 5,5 mM ATP, 12 mM Kreatinphosphat, 10 U/ml Kreatinphosphokinase, 1 % Triton 100X, Proteinaseinhibitoren) resuspendiert Roche 1X und PhosStop 1X von Roche) und 30 Minuten auf Eis inkubiert28. Myofilamentpellets wurden 15 Minuten lang bei 1100 g zentrifugiert und im Standardpuffer gewaschen. Frisch isolierte Myofilamentpellets wurden in Standardpuffer verdünnt und mit dem Lowery-Assay quantifiziert. Myofilamentproteine ​​(~7 mg) aus jedem Mäuseherz wurden in 8 M Harnstoff und 50 mM Triethylammoniumbicarbonat (TEAB) (Sigma) resuspendiert, gefolgt von einer Reduktion mit 10 mM Dithiothreitol (Sigma) bei Raumtemperatur für 1 Stunde und einer Alkylierung mit 30 mM Iodacetamid (Sigma) für 20 Minuten im Dunkeln, siehe Abb. 4a–d. Die Proteinproben wurden dann über Nacht bei 37 ° C mit Trypsin in Sequenzierungsqualität (1:50) (Promega) verdaut. Tryptische Peptide wurden entsalzt und gemäß den Anweisungen des Herstellers mit 6-Plex-isobaren Tandem-Massen-Tags (TMT) (Thermo Scientific) markiert. Die Markierungsreaktion wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur durchgeführt, gefolgt von einem Abschrecken mit 100 mM Tris.HCl (pH 8,0). Die verdauten und markierten Peptide wurden gepoolt und mit C18 SEP-PAK (Waters) entsalzt, gefolgt von einer pTyrsoine-Anreicherung unter Verwendung des PTMScan® Phospho-Tyrosine Rabbit mAb (P-Tyr-1000)-Kits (Cell Signaling Technology), siehe Abb. 4c. Kurz gesagt, die entsalzten Peptide wurden in 1,4 ml Immunaffinitätsreinigungspuffer (IP-Puffer) rekonstituiert, der 50 mM MOPS pH 7,2, 10 mM Natriumphosphat und 50 mM NaCl enthielt. Anti-Phosphotyrosin-Antikörper (p-Tyr-1000, Cell Signaling Technology) wurde mit Peptidlösung gemischt und auf einem Rotator 2 Stunden lang bei 4 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Perlen zwei- bzw. dreimal mit IP-Puffer und Wasser gewaschen. Die Phosphotyrosinpeptide wurden mit 0,1 % TFA eluiert. Die eluierten Peptidproben wurden mit C18 STAGE-Spitzen entsalzt, vakuumgetrocknet und vor der LC-MS-Analyse bei –80 °C aufbewahrt. Aus dem Durchfluss wurde eine Quantifizierung des gesamten Proteoms durchgeführt, die als Referenz für pTyr-Proteombefunde diente.

Die Phosphotyrosinpeptide und nicht phosphorylierten Peptide wurden auf dem Orbitrap Fusion Lumos Tribrid (Thermo Scientific, San Jose, CA, USA) in Verbindung mit dem Nanoflow-Flüssigkeitschromatographiesystem Easy-nanoLC 1200 (Thermo Scientific) analysiert. Die Peptide aus jeder Fraktion wurden in 10 % Ameisensäure rekonstituiert und auf eine Acclaim PepMap100 Nano Trap-Säule (100 μm × 2 cm) (Thermo Scientific) geladen, die mit 5 μm großen C18-Partikeln mit einer Flussrate von 5 μl pro Minute gefüllt war. Die Peptide wurden bei einer Flussrate von 250 nl/min unter Verwendung eines linearen Gradienten von 10–35 % Lösungsmittel B (0,1 % Ameisensäure in 95 % Acetonitril) über 95 Minuten auf der EASY-Spray-Säule (50 cm × 75 µm ID, PepMap RSLC) aufgelöst C18 und 2 µm C18-Partikel) (Thermo Scientific) und wurde an einer EASY-Spray-Ionenquelle angebracht, die mit einer Spannung von 2,0 kV betrieben wurde. Die massenspektrometrische Analyse wurde datenabhängig mit vollständigen Scans im Bereich von m/z 350 bis 1500 durchgeführt. Sowohl MS als auch MS/MS wurden mit dem Orbitrap-Massenanalysator erfasst und gemessen. Vollständige MS-Scans wurden mit einer Auflösung von 120.000 bei m/z 200 gemessen. Vorläuferionen wurden mithilfe einer Kollisionsdissoziationsmethode mit höherer Energie fragmentiert und mit einer Massenauflösung von 30.000 bei m/z 200 nachgewiesen.

MaxQuant 1.5 wurde zur Quantifizierung und Identifizierung anhand einer Maus-RefSeq-Datenbank (Version 78) verwendet, ergänzt durch häufig beobachtete Kontaminanten. Die verwendeten Suchparameter sind wie folgt: (a) Trypsin als proteolytisches Enzym (mit bis zu zwei fehlenden Spaltungen); (b) Peptidmassenfehlertoleranz von 10 ppm; (c) Fragmentmassenfehlertoleranz von 0,02 Da; (d) Carbamidomethylierung von Cystein (+57,02 Da) und TMT-Tags (+229,16 Da) an Lysinresten und Peptid-N-Termini als feste Modifikation und Oxidation von Methionin (+15,99 Da) und Phosphorylierung von Serin/Threonin/Tyrosin (+79,96). Da) als variable Modifikationen. Es waren zwei fehlende Spaltungen zulässig und die Option „Übereinstimmung zwischen Läufen“ war aktiviert. Peptide und Proteine ​​wurden mit einer Falscherkennungsrate von 1 % gefiltert. Proteine ​​mit einem q-Wert von weniger als 0,05 werden als differenziell exprimiert mit statistischer Signifikanz betrachtet.

Herzmorphologie und -funktion wurden durch transthorakale Echokardiographie unter Verwendung eines hochauflösenden Hochfrequenzsystems (Vevo 2100, VisualSonics, Kanada), ausgestattet mit einer 40-MHz-Ultraschallsonde, bei wachen Mäusen beurteilt22,53. Die mechanische und chemische Brusthaarentfernung erfolgte durch Rasur und Verwendung eines handelsüblichen Enthaarungsmittels. Die über eine Rektalsonde überwachte Kerntemperatur wurde mithilfe einer Heizlampe bei 36,5–37 °C gehalten. Parasternale Lang- und Kurzachsenansichten des Herzens wurden sowohl im B- als auch im M-Modus mit optimierten Bildraten aufgenommen. Enddiastolischer (LVIDd, mm) und end-systolischer (LVIDs, mm) LV-Innendurchmesser, enddiastolische Wandstärke sowohl des interventrikulären Septums (IVS, mm) als auch der LV-Hinterwand (LVPW, mm), LV-Auswurffraktionen ( EF, %) und fraktionierte Verkürzung (FS, %) wurden im M-Modus in der Längsachsenansicht gemessen. Die relative Wandstärke (RWT), ein Maß für die Hypertrophie, wurde als IVSd+LVPWd/LVID berechnet. Es wurden gepulste Doppler-Aufzeichnungen am Mitraleinfluss, am linksventrikulären Ausfluss und am Basalseptum aufgezeichnet. Digitale Bilder wurden offline mit der im Handel erhältlichen Vevo LAB-Software (VisualSonics, Kanada) gespeichert und analysiert. Alle Messungen wurden von einem erfahrenen Echokardiographietechniker durchgeführt, der gegenüber den Versuchsgruppen blind war.

Die Dichte der Banden wurde mit der ImageJ-Software gemessen und die Fläche unter der Kurve, die den Banden von pSRC, SRC, GAPDH, TnI und Gesamt-pTyr entspricht, wurde berechnet. Anschließend wurden die Verhältnisse pTyr/TnI, SRC/GAPDH, pSRC/GAPDH und pSRC/SRC berechnet und die Verhältnisse zwischen den Gruppen mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA verglichen.

Um die Auswirkungen von AG-825 auf die Kardiomyozyten-Unordnung zu charakterisieren, haben wir die Webgrafik-Benutzerinterphase CytoSpectre32 verwendet, um die lokale Ausrichtung von Kardiomyozyten über histologische Schnitte hinweg zu bestimmen. In zufällig ausgewählten Regionen wurde die kreisförmige Varianz des mittleren Orientierungswinkels der Myozyten berechnet. Der statistische Vergleich zwischen Gruppen (Ntg+Vehicle, Ntg+AG825, TgErbB2+Veh, TgErbB2 + AG825) wurde mit einer einfaktoriellen ANOVA durchgeführt.

Die statistische Analyse des markierungsfreien Datensatzes wurde mit der Perseus-Software54 durchgeführt. Peptide mit weniger als 50 % Nachweis wurden gefiltert und die fehlenden Werte der Intensitäten der Erinnerungspeptide wurden mit k-nächsten Nachbarn aufgefüllt. Anschließend wurden die log2-Intensitäten durch Mediansubtraktion, ANOVA und Berechnungen der Falscherkennungsrate normalisiert. Eine Heatmap wurde verwendet, um die unbeaufsichtigte hierarchische Clusterbildung von Proteinen mit einem p-Wert <0,05 durch den ANOVA-Test zu visualisieren. Für die statistische Analyse der gesammelten TMT-markierten Proteomikdaten folgten wir mit wenigen Modifikationen dem Arbeitsablauf von Foster et al.21. Zunächst wurde die Partek-Software verwendet, um die p-Werte, q-Werte, Faltungsänderung und das Verhältnis jeder Peptidintensität zu berechnen. Phosphosite mit weniger als 50 % fehlenden Dichtewerten wurden einer statistischen Analyse unterzogen und die erinnernden fehlenden Werte wurden mit den k-nächsten Nachbarn aufgefüllt. Anschließend erfolgte eine Normalisierung der Log2-Dichten durch Mediansubtraktion und die Bestimmung der Faltungsänderung, des Verhältnisses und der statistischen Signifikanz (q- und p-Werte) für jedes der ausgewählten Phosphosite des Datensatzes. Die Vulkandiagramme wurden mit GraphPad Prism 7® erstellt. Unbeaufsichtigte PCA wurde in beiden Datensätzen separat mit der Partek®-Software verwendet. Der Datensatz wurde zusammen mit jeder Komponente hinsichtlich der pTyr-Häufigkeit getrennt (normalisiert, Mittelwert = 0, Varianz = 1).

Es erfolgte eine Normalisierung auf das vollständige Proteom durch log2-Intensitätssubtraktion, gefolgt von einem zweiseitigen t-Test und der moderierten p-Werte- und q-Werte-Berechnung unter Verwendung eines von Herbrich et al.55 entwickelten Algorithmus; Für diese Analyse wurde R-Software verwendet.

Der hypergeometrische p-Wert wurde verwendet, um die signifikant angereicherten Prozesse in den Proteinen und Phosphositen zu identifizieren, die zwischen Fall- und Kontrollproben unterschiedlich phosphoryliert sind. Zu diesem Zweck wurde MsigDB23 zur Analyse der Pfade auf Proteinebene und PTMsigDB24 zur Analyse der Prozesse auf Standortebene verwendet. Die Population/der Hintergrund, für den die Anreicherung berechnet wird, ist auf alle Proteine ​​beschränkt, deren Standorte im Phosphoproteomics-Experiment quantifiziert werden, und nicht auf alle allgemein bekannten Proteine/Phosphosites.

Die KSEA versucht, Kinasen zu identifizieren, deren Ziele in einem bestimmten Zustand deutlich veränderte Phosphorylierungsniveaus aufweisen. KSEA bewertet jede Kinase k mit einem Satz von Substraten S wie folgt:

wobei \({\bar{P}}_{S}\) den durchschnittlichen log2 der Faltungsänderung aller Substrate der Kinase k bezeichnet und \(\bar{P}\) und σ den Durchschnitt und den Standard darstellen Abweichung von log2 der Faltungsänderung aller identifizierten Phosphosite im Datensatz. KSEA wurde an den identifizierten Modulen durchgeführt, indem S auf die Substrate im Modul und nicht auf alle Substrate im Datensatz beschränkt wurde. Die von PhosphoSitePLUS30 bereitgestellten Daten wurden als Referenz für Kinase-Substrat-Assoziationen verwendet. Dieses Tool ist auf der Website von Dr. M. Ayati verfügbar: https://faculty.utrgv.edu/marzieh.ayati/software.html

Zunächst wurden Netzwerke erstellt, in denen Knoten Proteine ​​und Kanten den von BioGRID22,56 erhaltenen PPI darstellen. Den Proteinen wurde in den Netzwerken eine Bewertung zugewiesen, indem die durchschnittliche Faltungsänderung der Phosphosite auf jedem einzelnen Protein berechnet wurde, das aus Experimenten einzeln erhalten wurde (d. h. Ntg, TgErbB2 und R403Q-αMyHC Tg). Anschließend wurde MoBaS22 angewendet, um Teilnetzwerke hochgradig verbundener und unterschiedlich phosphorylierter Proteine ​​zu identifizieren. Zur Visualisierung von Subnetzwerken werden die Proteine ​​basierend auf der durchschnittlichen Faltungsänderung dieses Proteins unter verschiedenen Bedingungen gefärbt. Wenn ein Protein in einem Datensatz in einem anderen Datensatz nicht identifiziert wird, wird der Knoten grau dargestellt.

Eine einfaktorielle ANOVA wurde verwendet, um Unterschiede zwischen Gruppen zu vergleichen und die Echokardiographiedaten zu analysieren. Für die Wirkung von AG-825 oder Vehikelbehandlungen vor und nach der Behandlung haben wir einen T-Test verwendet.

Die Experimente wurden in Replikaten durchgeführt (siehe Abschnitt „Methoden“). Mascot (Version 2.3) wurde zur Peptididentifizierung aus MS-Rohdaten und MaxQuant (Version 1.5) zur Quantifizierung verwendet. Die statistische Analyse wurde mit R (Version 4.0), Partek Genomics Suit (Version 7.0), GraphPad Prism 7.0 und Perseus (Version 1.5) durchgeführt. Weitere Einzelheiten zur Datenverarbeitung finden Sie im Abschnitt „Methoden“.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Massenspektrometrie-Proteomikdaten wurden über das PRIDE57-Partner-Repository mit der Datensatzkennung PXD036506 beim ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt. Ergänzende Daten 1 enthalten die numerische Quelle der in den Abbildungen dargestellten Diagramme. 1 und 7. Ergänzende Abbildung 6 enthält die unbeschnittenen Western Blots von Abbildung 1.

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Das beschriebene Projekt wurde durch die Grant-Nummer K01-HL13368-01 an GARC, 5 T32 HL 7227-43, T32HL125239-05, T32HD044355 von NIH, R01 HL63038, R01 HL114910-01 und AHA 15GRNT25720026 an AMM, R01 HL136 unterstützt 91 bis NP, R01 HL088649 an KG und R01LM012980 an MA. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten des NIH dar. Wir danken Dr. Leslie Leinwand für die Unterstützung der transgenen Mäuse R403Q-αMyHCTg. Die National Science Foundation of China (81870364) und die Research Foundation for the Scientific Development of Longgang District of Shenzhen (LGKCYLW2021000020) sowie die Natural Science Foundation of Guangdong Province of China (2022A1515012468) unterstützten MX

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Mingguo Xu, Kevin C. Bermea, Marzieh Ayati.

Abteilung für Pädiatrie/Abteilung für Kardiologie, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA

Mingguo Xu, Kevin C. Bermea, Amir Heravi, Allen D. Everett, Anne M. Murphy und Genaro A. Ramirez-Correa

Abteilung für Pädiatrie, Drittes Volkskrankenhaus des Bezirks Longgang, Shenzhen, 518115, China

Mingguo Xu

Fakultät für Informatik/College of Engineering and Computer Science, University of Texas Rio Grande Valley School of Medicine, Edinburgh, Texas, USA

Marzieh Ayati

Abteilung für Neurologie/Institut für Zelltechnik, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA

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Abteilung für Anästhesiologie, Qilu-Krankenhaus, Cheeloo College of Medicine, Shandong-Universität, Ji'nan, China

Xiaomei Yang

Abteilung für Molekularwissenschaft/UT Health Rio Grande Valley, McAllen, TX, USA

Andres Medina & Genaro A. Ramirez-Correa

Abteilung für Pädiatrie/Abteilung für Hämatologie, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA

Zongming Fu

Abteilung für Kardiologie, Qilu-Krankenhaus, Cheeloo College of Medicine, Shandong-Universität, Ji'nan, China

Xinyu Zhang

Abteilung für biologische Chemie/McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA

Chan Hyun Na

Abteilung für molekulare und vergleichende Pathobiologie, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA

Kathleen Gabrielson

Medizinische Abteilung/Abteilung für Kardiologie, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA

D. Brian Foster & Nazareno Paolocci

Abteilung für Biomedizinische Wissenschaften, Universität Padua, Padua, Italien

Nazarener Paolocci

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MX, AM, HBK, XY, XF, AH, NP, AMM und GARC haben das Manuskript geschrieben, AMM und GARC haben die Studie entworfen und die Arbeit überwacht.

Korrespondenz mit Anne M. Murphy oder Genaro A. Ramirez-Correa.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Brian Delisle und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Tami Martino und Joao Manuel de Sousa Valente. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Xu, M., Bermea, KC, Ayati, M. et al. Eine Veränderung der Tyrosinphosphorylierung des Herzproteoms und des EGFR-Signalwegs trägt zur hypertrophen Kardiomyopathie bei. Commun Biol 5, 1251 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04021-4

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Eingegangen: 09. November 2020

Angenommen: 22. September 2022

Veröffentlicht: 15. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04021-4

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