Visualisierung der Aktivität des enterischen Nervensystems durch Farbstoff

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 236 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Bei den Bildgebungstechnologien wurden große Fortschritte erzielt, aber die meisten methodischen Ansätze, die derzeit zur Untersuchung der enterischen neuronalen Funktionen verwendet werden, basieren auf exogenen Kontrastfarbstoffen, die die Zellfunktionen oder das Überleben beeinträchtigen können. In der vorliegenden Arbeit haben wir untersucht, ob die optische Vollfeld-Kohärenztomographie (FFOCT) zur Visualisierung und Analyse der Zellen des enterischen Nervensystems eingesetzt werden kann. Experimentelle Arbeiten an Whole-Mount-Präparaten unfixierter Mäusedärme zeigten, dass FFOCT die Visualisierung des Myentericus-Plexus-Netzwerks ermöglicht, während dynamische FFOCT die Visualisierung und Identifizierung einzelner Zellen in den Myentericus-Ganglien in situ ermöglicht. Analysen zeigten auch, dass das dynamische FFOCT-Signal durch externe Reize wie Veratridin oder Änderungen der Osmolarität verändert werden kann. Diese Daten legen nahe, dass die dynamische FFOCT von großem Interesse sein könnte, um Veränderungen in den Funktionen enterischer Neuronen und Glia im Normal- und Krankheitszustand zu erkennen.

Das enterische Nervensystem (ENS) ist ein integriertes neuronales Netzwerk im Magen-Darm-Trakt (GI). Das ENS besteht aus Neuronen und enterischen Gliazellen (EGC) und reguliert wichtige GI-Funktionen, darunter Motilität, Schleimhautsekretion, Zellproliferation, Gewebereparatur, aber auch Immunfunktionen1. Defekte in der Organisation und den Funktionen des ENS tragen zu verschiedenen gastrointestinalen Funktionsstörungen bei, die bei einem breiten Spektrum von Verdauungs- und Extraverdauungsstörungen beobachtet werden2.

In den letzten Jahren wurden mikroskopische Bildgebungstechniken entwickelt, um die Funktionen des ENS unter normalen und abnormalen Bedingungen besser zu verstehen. Fortschritte wurden beispielsweise durch die Kombination hochauflösender mikroskopischer Techniken mit fluorimetrischen Sonden wie kalziumempfindlichen oder spannungsempfindlichen Farbstoffen erzielt3. Einblicke in die Organisation und das Gefäßsystem des ENS wurden auch durch Technologien wie die Lichtblattmikroskopie und die optische Projektionstomographie ermöglicht, die die Analyse von Abschnitten von einigen Quadratzentimetern herausgeschnittenem Verdauungsgewebe ermöglichen4,5. Diese technischen Ansätze können jedoch nur ex vivo durchgeführt werden, da sie eine Gewebereinigung und eine immunhistochemische Färbung erfordern. Die In-vivo-Visualisierung des menschlichen ENS wurde mithilfe der konfokalen Sondenendomikroskopie (pCLE) erreicht. Da jedoch die Auflösung und die Eindringtiefe zu gering waren, war eine endoskopische Submukosadissektion6 oder eine Kresylviolettfärbung6 erforderlich, um ein klares Bild des ENS7 zu erhalten. In diesem Zusammenhang sind neuartige Technologien, die eine hohe räumliche Auflösung und eine farbstofffreie dynamische Bildgebung des ENS ermöglichen, von großem Interesse.

In diesem Zusammenhang kann die optische Kohärenztomographie (OCT) sehr nützlich sein, da sie die Abbildung innerer Gewebestrukturen durch interferometrische Analyse von rückgestreutem und reflektiertem Licht ermöglicht8. Diese schnelle und nichtinvasive Technologie basiert auf dem inhärenten Gewebekontrast, um eine volumetrische Rekonstruktion des Gewebes zu erstellen. Diese Bildgebungsstrategie wird am häufigsten zur Diagnose von Erkrankungen des menschlichen Auges eingesetzt9, aber in Kombination mit einer Glasfasersonde könnte das OCT Bilder im Herz-Kreislauf-, Atmungs- oder Verdauungssystem erfassen10. Im Darm wird die endoskopische OCT typischerweise zur Diagnose des Barrett-Ösophagus11 eingesetzt und es wurden vorläufige Daten für andere Indikationen wie entzündliche Darmerkrankungen und Darmkrebs12,13 erhoben. Die endomikroskopische In-vivo-OCT mit einer typischen Auflösung von mehreren zehn Mikrometern14 hat eine zu geringe Auflösung, um das ENS sichtbar zu machen, aber eine höhere Auflösung kann mit zwei Implementierungen dieser Technik erreicht werden: FFOCT15,16 und hochauflösendes SD-OCT17,18,19. In diesem Artikel präsentieren wir Ergebnisse, die mit dem FFOCT erzielt wurden, das 2D-En-Face-Bilder unter Verwendung von Objektiven mit hoher numerischer Apertur und sichtbarem Licht erfasst. Es ermöglicht die Erstellung von Bildern mit mikrometrischer und subzellulärer Auflösung und es können auch volumetrische Daten erfasst werden, indem die Aufnahmetiefe des OCT-En-Face-Bildes geändert wird. Seine Anwendung wurde hauptsächlich für die intraprozedurale Erkennung von Tumorrändern in verschiedenen Organen20, einschließlich des Gehirns21, untersucht. Es wurde auch für die Bildgebung der Augenstrukturen berichtet22,23. Trotz einiger früher Bemühungen24 gelang die Entwicklung einer endoskopischen Version des FFOCT bisher nicht. In Ex-vivo-Darmproben hat FFOCT seine Fähigkeit unter Beweis gestellt, den Plexus myentericus im Magen-Darm-Trakt von Mäusen und Menschen abzubilden25. Diese Bildgebungsmethode stellt jedoch die Neuronen und Gliazellen in den Darmganglien nicht dar, was teilweise auf die starken Rückstreusignale zurückzuführen ist, die von umgebenden Geweben wie Muskelzellen oder dem ENS erzeugt werden, und auf das Vorhandensein eines Speckle-Rauschens. Ein neues Tool namens dynamisches FFOCT (D-FFOCT) hat den Zellkontrast in komplexem Gewebe erheblich verbessert, indem es die zeitlichen Schwankungen des von Gewebe und Zellen zurückgestreuten Lichts analysiert26. Für die zeitliche Analyse der Mikrobewegung von Zellbestandteilen, die dem intrinsischen Kontrast des D-FFOCT zugrunde liegt, werden die OCT-Signale im Laufe der Zeit von derselben Bildebene gesammelt, was wiederum das zusätzliche Rauschen reduziert und die Bildqualität verbessert. Der dynamische Kontrast wurde auch in der hochauflösenden SD-OCT-Technologie implementiert, die im Vergleich zur En-Face-Bildgebungsebene des D-FFOCT27 Querschnittsbilder des Gewebes liefert. Mikro-OCT mit dynamischem Kontrast wurde zur Visualisierung der Mikroanatomie der Atemwege28, des Gebärmutterhalses und der Speiseröhre29 verwendet. Die jüngsten Bemühungen konzentrieren sich auf die weitere Verbesserung der Erfassungsgeschwindigkeit und Bildqualität von D-FFOCT und Mikro-OCT mit dynamischem Kontrast, um eine In-vivo-Bildgebung zu ermöglichen30,31,32. Gleichzeitig wurde die Mikro-OCT-Technologie erfolgreich auf ein endoskopisches Design übertragen33,34. Der vorläufige Entwurf eines Mikro-OCT-Endoskops mit dynamischem Kontrast wurde vorgestellt35, aber die Herausforderung der Gewebestabilisierung während der langen Datenerfassung, die zur Extraktion des dynamischen Kontrasts erforderlich ist, bleibt eine große Einschränkung. Die zellulären Mechanismen, die den zeitlichen Schwankungen der OCT-Signale zugrunde liegen, sind ebenfalls unbekannt, aber Veränderungen in der zellulären Stoffwechselaktivität könnten teilweise dafür verantwortlich sein, da die Hemmung der mitochondrialen Aktivität durch Rotenon oder der Glykolyse durch 2-Desoxy-D-Glucose die Intensität des OCT-Signals deutlich reduzierte26. Interessanterweise konnten einzelne Epithel- oder Immunzellen, die durch FFOCT nicht einzeln identifiziert werden konnten, durch D-FFOCT sichtbar gemacht werden36. Das ist ermutigend, aber bisher ist nichts über die Fähigkeit von D-FFOCT bekannt, das ENS abzubilden, oder über die biologischen Mechanismen, die den D-FFOCT-Signalen von den ENS-Zellen zugrunde liegen.

In der vorliegenden Studie wurden herausgeschnittene Dickdarmsegmente von erwachsenen Mäusen mittels FFOCT und D-FFOCT analysiert, um die Fähigkeit dieser Technologie zu demonstrieren, Neuronen und Gliazellen im Plexus myentericus abzubilden und Veränderungen in D-FFOCT-Signalen zu messen, die mit der neuronalen Elektrophysiologie verbunden sind Aktivität.

Um festzustellen, ob FFOCT zur Identifizierung myenterischer Ganglien ohne jegliche Farbstoffmarkierung verwendet werden kann, wurden Ganzkörperpräparate distaler Dickdarmsegmente von Mäusen auf einem Sylgard-Träger befestigt und mithilfe von FFOCT abgebildet. Die Bilder wurden in aufeinanderfolgenden Tiefen von 0,5 µm aufgenommen, beginnend auf der Ebene der äußeren Serosa. Die Längs- (Abb. 1a) und die kreisförmigen Muskelschichten (Abb. 1c) konnten eindeutig identifiziert werden, da ihre Fasern senkrecht zueinander stehen. Interessanterweise zeigten die zehn bis zwölf FFOCT-Bilder, die zwischen den beiden Muskelschichten aufgenommen wurden, ein dunkles Netzwerk, das durch refraktäre Regionen begrenzt war (Abb. 1b). Um zu bestätigen, dass diese dunklen Strukturen dem Plexus myentericus entsprachen, wurden zuvor durch FFOCT abgebildete Gewebeproben mit Antikörpern gegen Hu und S100β immungefärbt, um Neuronen bzw. enterische Gliazellen zu identifizieren (Abb. 1d – f). Mit diesen kombinierten Ansätzen konnten wir zeigen, dass FFOCT zur Identifizierung von Strukturen verwendet werden kann, die von Ganglien und interganglionären Faserbahnen gebildet werden, da das im FFOCT beobachtete dunkle Netzwerk mit der Hu/S100β-Färbung überlagert ist (Abb. 1f). Einzelne Neuronen und/oder Gliazellen im Plexus myentericus konnten jedoch mit der FFOCT nicht identifiziert werden.

a–c Der Dickdarm der Mäuse wurde mittels FFOCT auf der Ebene eines Längsmuskels, b des Plexus myentericus und c des kreisförmigen Muskels analysiert. Ausgewählte Bereiche des Plexus myentericus wurden durch d-FFOCT und durch e-Apotom nach der Immunmarkierung von Neuronen (Hu in Rot) und enterischen Gliazellen (S100b in Grün) sichtbar gemacht. Das zusammengeführte Bild (f) bestätigt, dass die durch FFOCT beobachteten dunklen Bereiche Ganglien und interganglionären Faserbahnen entsprechen. Maßstabsleiste: a–c 200 µm; d–f 100 µm.

Bei D-FFOCT werden die Bilder des ausgewählten Bereichs im Laufe der Zeit erfasst, was eine Analyse der Bewegungen in jedem Voxel ermöglicht und so zusätzlichen Kontrast liefert, der die Auflösung von Zellen und Zellkernen ermöglicht. Mit diesem Ansatz konnten wir zuvor einzelne Epithelzellen entlang des menschlichen Darms identifizieren36. Hier haben wir die Gewebeproben mittels D-FFOCT analysiert, um festzustellen, ob diese Technik zur Identifizierung einzelner Zellen innerhalb der Myenterialganglien verwendet werden kann.

Wie in Abb. 2 dargestellt, zeigte der Vergleich der FFOCT- und D-FFOCT-Bilder deutlich Strukturen, die nur im dynamischen Modus erkannt wurden (Abb. 2a–f). Bei einigen dieser Strukturen handelte es sich wahrscheinlich um einzelne Kerne, wie ihre Morphologie und ihre Lokalisierung in den Ganglien zeigen. Die vom Light-CT-Scanner erzeugten D-FFOCT-Bilder sind pseudofarbige RGB-Bilder, bei denen jeder Farbkanal auf der Fourier-Domänenanalyse der Mikrobewegungen basiert, die in drei verschiedenen Frequenzbereichen integriert sind. Die niedrigen [0–0,6 Hz], mittleren [0,6–5,4 Hz] und hohen [5,4–25 Hz] Frequenzen wurden in Blau, Grün bzw. Rot farblich gekennzeichnet (Abb. 2g–i). Um den Kontrast zu verbessern und Funktionsinformationen zu visualisieren und zu quantifizieren, wurden die RGB-Bilder entsprechend ihren drei Farbkanälen in monochrome Bilder aufgeteilt. Mit diesem Ansatz konnten wir aufgrund der Unterschiede in der Signalintensität und -amplitude innerhalb des Gewebes zwischen ganglionären und extraganglionären Strukturen unterscheiden. Erstens war die Amplitude aller Frequenzsignale in ganglionären Strukturen im Vergleich zu extraganglionären Strukturen signifikant höher (Abb. 2j). Darüber hinaus war in ganglionären Strukturen die Amplitude hochfrequenter Signale höher im Vergleich zu niederfrequenten Signalen. Dies war bei extraganglionären Strukturen nicht der Fall. Schließlich war in beiden Strukturen die Amplitude der Mittelfrequenzsignale höher als die der Nieder- und Hochfrequenzsignale.

a–d Mikroskopische Aufnahme der Region des Plexus myentericus im FFOCT (a, b) oder D-FFOCT (c, d). b und d stellen jeweils eine Vergrößerung des gepunkteten Bereichs in (a) und (c) dar. e, f Orthogonale Ansicht verschiedener Ebenen (x/y; x/z und y/z) von FFOCT (e) und D-FFOCT (f) Z-Stapelbildern (60 Bilder). Die Pfeilspitzen zeigen die Position des „En-Face-Bildes“ in der orthogonalen Ansicht an. g–i Die D-FFOCT-Aufnahme in (c) ist ein RGB-kodiertes Bild, in dem der blaue Kanal (g) die niedrigen Frequenzen [0–0,6 Hertz] darstellt, der grüne Kanal (h) mittleren Frequenzen [0,6–0,6 Hertz] entspricht. 5,4 Hertz] und der rote Kanal (i) zu hohen Frequenzen [5,4–25 Hertz]. j Die mittlere Intensität niedriger (blau), mittlerer (blaugrün) oder hoher (zinnoberroter) Frequenzen wurde in intra- und extraganglionären Regionen des Plexus myentericus bestimmt. Drei Tiere wurden verwendet, um die mittlere Intensität +/– SEM zu bestimmen, und fünf unabhängige Regionen wurden pro Tier analysiert. Statistik: zweiseitiger T-Test nach Mann und Whitney. *p < 0,05; ***p < 0,001. Maßstabsleiste: a, c, g–i, 125 µm; b, d, 30 µm; e–f, x/y 30 µm, x/z und y/z 12 µm. MP Plexus myentericus, Mu-Schleimhaut.

Als erster Ansatz zur Identifizierung der durch D-FFOCT im Plexus myentericus erkannten Strukturen wurde D-FFOCT mit standardmäßigen histologischen und immunfärbenden Methoden kombiniert, die derzeit zur Markierung von Kernen und zur Charakterisierung von Zellen des enterischen Nervensystems verwendet werden. Zu diesem Zweck wurden mit D-FFOCT abgebildete Gewebeproben fixiert und mit 4',6-Diamidino-2-phénylindol (DAPI) gefärbt, einem zelldurchlässigen Fluoreszenzfarbstoff, der an Desoxyribonukleinsäure (DNA) bindet. Die Überlagerung von D-FFOCT-Bildern mit konfokalen Hochleistungsmikroskopaufnahmen der DAPI-Färbung zeigte deutlich, dass die durch D-FFOCT im Plexus myentericus erkannten kernähnlichen Strukturen DAPI-markierten Kernen entsprechen (Abb. 3a – h). Interessanterweise konnten nicht alle Kerne mit D-FFOCT sichtbar gemacht werden. Von 261 DAPI-markierten Kernen, die in den Myenterialganglien gezählt wurden, wurden 27 durch D-FFOCT nicht sichtbar gemacht (weiße Pfeilspitze in Abb. 3e – h). Bemerkenswert ist, dass in extraganglionären Regionen kein D-FFOCT-Kern nachgewiesen wurde, während Zellen wie Muskelzellen vorhanden sein könnten. Diese Beobachtung lässt auf ein zell- oder morphologieabhängiges FFOCT-Signal schließen.

a–d Zusammengeführtes Bild (c, d) von D-FFOCT- (a) und DAPI-gefärbten konfokalen (b) Mikroaufnahmen. Die gleiche Region des Plexus myentericus der Maus wurde analysiert und verglichen. In d wurde nur das Hochfrequenzbild (rot) von D-FFOCT mit dem konfokalen DAPI-Bild (weiß) überlagert, um die Signalkolokalisierung deutlich zu erkennen. Maßstabsbalken: 25 µm. e–h Vergrößerung des gepunkteten Bereichs in (a–d). Die Pfeilspitze zeigt auf einen DAPI-positiven Kern, der von D-FFOCT nicht erkannt wird. Maßstabsleiste: 10 µm. i–k Mikroskopische Aufnahme derselben Ganglien, sichtbar gemacht durch D-FFOCT (i) oder durch Apotom nach Hu- (j) oder S100b- (k) Immunfärbung. Hu- und S100b-Zellen, die mit D-FFOCT-positiven Kernen überlappten, wurden mit Pfeilen bzw. Pfeilspitzen markiert. Maßstabsbalken: 25 µm. l–n Zusammengeführtes Bild von hochfrequenten D-FFOCT- (rot), Dapi- (weiß) und Hu- (l; grün) oder S100b- (m, gelb) konfokalen Mikroaufnahmen eines myenterischen Ganglien der Maus. In denselben Ganglien wurden D-FFOCT-positive (einfache Pfeilspitzen) und negative (doppelte Pfeilspitzen) Kerne angezeigt. Orangefarbene Pfeilspitzen und Doppelpfeilspitzen deuteten auf mit Hu kolokalisierte D-FFOCT-Kerne hin, wohingegen weiße Pfeilspitzen und Doppelpfeilspitzen auf mit S100b kolokalisierte D-FFOCT-Kerne hindeuteten. Maßstabsbalken: 25 µm. o Größen-Häufigkeitsverteilung der D-FFOCT-positiven Kerne, die zusammen mit Hu- oder S100b-Färbung lokalisiert wurden. 344 Kerne wurden in 13 Ganglien von 3 Mäusen analysiert (gepoolt im 10 µm2-Bereich). p Mittlere Fläche in µm2 neuronaler (Neu, n = 219) oder glialer (EGC; n = 125) D-FFOCT-positiver Kerne. Mittelwert +/− SEM; Statistik: zweiseitiger T-Test nach Mann und Whitney. q Mittlere Intensität neuronaler (Neu, n = 219) oder glialer (EGC, n = 125)) Kerne für die niedrigen (blau), mittleren (bläulich-grün) oder hohen (zinnoberroten) Frequenzen. Mittelwert +/− SEM; Statistik: zweiseitiger T-Test nach Mann und Whitney. *p < 0,05; **p < 0,01, ***p < 0,001.

Um Zellen mit D-FFOCT-positiven Kernen zu charakterisieren, wurden die Gewebe dann fixiert, mit Antikörpern gegen neuronale (Hu) oder gliale (S100β) Marker immungefärbt und mittels Apotom-Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Wie in Abb. 3i – k dargestellt, überlappte die große Mehrheit der durch D-FFOCT beobachteten kernähnlichen Strukturen mit der Hu- (Pfeile) oder S100β-Färbung (Pfeilspitze). Die Überlagerung von D-FFOCT-Bildern mit denen, die durch konfokale Mikroskopie nach Immunhistochemie und DAPI-Färbung erhalten wurden (Abb. 3l, m), ergab, dass D-FFOCT-Kernstrukturen in DAPI-positiven Hu-positiven Zellen nachgewiesen wurden (orangefarbene Pfeilspitzen in Abb. 3l). , N). Wie durch die orangefarbenen Doppelpfeilspitzen angedeutet, wiesen nur wenige DAPI-positive Hu-positive Neuronen keine D-FFOCT-Kernstrukturen auf. In Bezug auf die Gliazellen wurden D-FFOCT-Kernstrukturen in der großen Mehrheit der DAPI-positiven S100β-positiven Gliazellen nachgewiesen (weiße Pfeilspitzen in Abb. 3m, n), einige DAPI-positive S100β-positive Zellen waren jedoch von D nicht sichtbar -FFOCT (weiße Doppelpfeilspitzen in Abb. 3m, n). Die Zellzählung zeigte, dass durch D-FFOCT erkannte Kernstrukturen in 96 % der Neuronen (163 von 170 Kernen) und 78 % der EGC (71 von 91 Kernen) vorhanden waren, die DAPI-positive Kerne enthielten.

Um festzustellen, ob die Morphologie und/oder die RGB-Intensität der D-FFOCT-Kernstrukturen zur Unterscheidung von Kernen von Neuronen und Gliazellen verwendet werden können, wurde ihre Größenverteilung analysiert. Die Ergebnisse zeigten Gaußsche Verteilungen. Bei Gliazellen war der Peak im linken Teil des Histogramms lokalisiert, was den kleinen Kernen entsprach, während bei Neuronen der Peak eher rechts lag, was den großen Kernen entsprach (Abb. 3o). Diese Beobachtung wird durch die Tatsache gestützt, dass die mittlere Fläche der EGC-D-FFOCT-Kernstrukturen fast doppelt so groß war wie die mittlere Fläche der neuronalen D-FFOCT-Kernstrukturen (49,9 µm² +/- 15,8 gegenüber 89,9 µm² +/- 17,9). bzw. Mittelwert +/− SD) (Abb. 3p). Interessanterweise haben wir gezeigt, dass ein Grenzwert von 65 µm2 es uns ermöglicht, 78,4 % des EGC und 92,7 % der Neuronen in den Fraktionen unter bzw. über 65 µm2 zu unterscheiden. Die Amplituden der D-FFOCT-Frequenzen wurden verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass die mittlere Intensität aller Frequenzsignale in Neuronen im Vergleich zu Gliazellen signifikant größer war (Abb. 3q).

Um festzustellen, ob D-FFOCT-Signale durch die neuronale Aktivität moduliert werden können, wurden mit D-FFOCT Bilder der gesamten Ganglien vor und 30 Minuten nach der Zugabe von Veratridin, einem Na-Kanal-Aktivator, aufgenommen (Abb. 4a).

eine D-FFOCT-Aufnahme derselben Ganglien, sichtbar gemacht vor (T0) und nach einer 30-minütigen Behandlung mit 75 µM Veratridin (T1). Maßstabsbalken: 30 µm. b, c T1:T0-Verhältnis, ausgedrückt als Prozentsatz der mittleren Intensität für den niedrigen (blau), mittleren (blaugrün) oder hohen (zinnoberroten) Frequenzbereich nach einer Behandlung mit Vehikel (0,1 % Vol./Vol. DMSO) oder 75 µM Veratridin (Vera). Die mittlere Intensität wurde aus den gesamten Ganglien (b) oder aus der Kernstruktur (c) berechnet, wie im oberen Teil des Panels angegeben. d, e Gleiches Experiment wie in (c), aber die Kerne wurden nach ihrer Größe >65 µm (d) und <65 µm (e) unterteilt. Veratridin, n = 20 Ganglien von 4 Mäusen; DMSO, n = 20 (b, d) oder 18 (c, e) Ganglien von 4 Mäusen. Mittelwert +/− SEM; Statistik: zweiseitiger T-Test nach Mann und Whitney. *p < 0,05; **p < 0,01, ***p < 0,001.

Anschließend wurde die mittlere Intensität für den niedrigen, mittleren und hohen Frequenzbereich analysiert. Wie in Abb. 4b beobachtet, induzierte Veratridin im Vergleich zur Kontrolle einen Anstieg der Intensität hoch- und mittelfrequenter Signale und eine signifikante Verringerung der Intensität niederfrequenter Signale in den gesamten Ganglien (Abb. 4b, 5 Ganglien pro Tier). pro Bedingung, gesammelt von 4 Tieren, Kontrolle: DMSO 0,1 % Vol/Vol). Anschließend wurde der Einfluss von Veratridin auf D-FFOCT-Signale auf Einzelkernebene untersucht. Im Vergleich zur Kontrolle wurde in mit Veratridin behandelten Kernen ein Anstieg der Intensität sowohl der Mittel- als auch der Hochfrequenzsignale beobachtet, während bei den niedrigen Frequenzen keine Veränderung festgestellt wurde (Abb. 4c, 100–300 Kerne pro Tier bei 4 Tieren). Interessanterweise wurden einige D-FFOCT-Kernsignale, die unter Basalbedingungen nicht erkannt wurden, in mit Veratridin behandelten Kernen beobachtet (ergänzende Abbildung 1a, Pfeile). Um festzustellen, ob die Veränderungen in den D-FFOCT-Signalen vom Zelltyp abhängig waren, wurden die Ergebnisse als Funktion des Grenzwerts für die Kerngröße klassifiziert, der zwischen neuronalen (Kerngröße >65 µm2) und Gliazellen (Kerngröße <65) unterscheidet µm2). Im Vergleich zur Kontrolle erhöhte die Veratridin-Behandlung die Intensität sowohl mittel- als auch hochfrequenter Signale in der Zellpopulation mit Kerngrößen >65 µm2, die hauptsächlich Neuronen entsprachen, signifikant (Abb. 4d). Veratridin induzierte auch einen signifikanten Anstieg der Intensität hochfrequenter Signale in der Zellpopulation mit einer Kerngröße <65 µm2, die hauptsächlich aus Gliazellen besteht (Abb. 4e). Schließlich wurden die durch Veratridin induzierten Änderungen der D-FFOCT-Signale nach dem Auswaschen mit Krebs-Lösung umgekehrt (ergänzende Abbildung 1b, c).

Da die neuronale Aktivität die D-FFOCT-Signale in Neuronen- und Gliazellen modulierte, untersuchten wir, ob die pharmakologische Hemmung der basalen neuronalen Aktivität mit Tetrodotoxin (TTX) die D-FFOCT-Signale beeinflusst (Abb. 5a). Die Analyse der gesamten Ganglien nach der Behandlung mit TTX ergab, dass das Toxin die Intensität mittel- oder hochfrequenter Signale nicht veränderte, die Intensität niederfrequenter Signale jedoch deutlich reduzierte (Abb. 5b). Darüber hinaus wurde nach der Behandlung mit TTX keine signifikante Änderung der D-FFOCT-Frequenzsignale in Kernstrukturen beobachtet (Abb. 5c).

eine D-FFOCT-Aufnahme derselben Ganglien vor (T0) und nach einer 30-minütigen Behandlung mit 1 µM Tetrodotoxin (T1). Maßstabsbalken: 30 µm. b, c Verhältnis T1:T0 in Prozent der mittleren Intensität für den niedrigen (blau), mittleren (blaugrün) oder hohen (zinnoberroten) Frequenzbereich für eine Behandlung mit Vehikel (Krebs) oder Tetrodotoxin (TTX). Die mittlere Intensität wurde aus den gesamten Ganglien (b) oder aus der Kernstruktur (c) berechnet. Tetrodotoxin, n = 25 Ganglien von 5 Mäusen; Krebs, n = 15 Ganglien von drei Mäusen. Mittelwert +/− SEM; Statistik: zweiseitiger T-Test nach Mann und Whitney. **p < 0,01.

Beobachtungen, dass eine erhöhte neuronale Aktivität die D-FFOCT-Signale sowohl in neuronalen als auch in Gliakernen modulierte, veranlassten uns, die mutmaßlichen Mechanismen, die diesen Veränderungen zugrunde liegen, weiter zu untersuchen. Interessanterweise wurde gezeigt, dass die neuronale Aktivität mit Veränderungen der Kernmorphologie aufgrund von Veränderungen der Transkriptionsaktivität verbunden ist37. Zu den anderen Faktoren, von denen bekannt ist, dass sie die Kernmorphologie regulieren, gehört auch osmotischer Stress38,39. Insbesondere wurde gezeigt, dass Hyperosmolarität eine Kernschrumpfung oder eine Kontraktion der Kernmorphologie hervorruft und vermutlich seine Schwingungseigenschaften verändert, deren Modifikationen mit D-FFOCT nachgewiesen werden konnten.

Um diese Hypothese zu validieren, haben wir analysiert, ob eine Änderung des osmotischen Drucks einen Einfluss auf die D-FFOCT-Signale in ENS-Zellen hat (Abb. 6a). Interessanterweise führte eine zunehmende Mannitolkonzentration zu einer signifikanten Abnahme der Intensität der D-FFOCT-Signale für niedrige, mittlere und hohe Frequenzen in Ganglien (Abb. 6b), aber auch im Ganglionzellkern (Abb. 6c). Dieser Effekt war reversibel, da die D-FFOCT-Signale in Ganglien (ergänzende Abbildung 2b) und in Kernen (ergänzende Abbildung 2c) nach dem Auswaschen mit Krebs-Lösung auf ihren ursprünglichen Wert zurückkehrten (ergänzende Abbildung 2a).

eine D-FFOCT-Aufnahme derselben Ganglien vor (T0) und nach einer 30-minütigen Behandlung mit Vehikel (Krebs), 100, 200 oder 300 mM Mannitol (T1). Maßstabsbalken: 25 µm. b, c Verhältnis T1:T0 in Prozent der mittleren Intensität für niedrigen (blau), mittleren (blaugrün) oder hohen (zinnoberroten) Frequenzbereich für eine Behandlung mit Vehikel (Krebs, 0) oder 100, 200, 300 mM Mannitol. Die mittlere Intensität wurde aus den gesamten Ganglien (b) oder aus der Kernstruktur (c) berechnet. n = 15 Ganglien von 3 Mäusen. Mittelwert +/− SEM; Statistik: Für jede Farbe ein zweiseitiger Kruskal-Wallis-Test, gefolgt von einem Dunn-Test. *p < 0,05; **p < 0,01, ***p < 0,001.

In der vorliegenden Studie haben wir gezeigt, dass die Zeit-Frequenz-Analyse der OCT-Signale oder D-FFOCT die In-situ-Identifizierung von enterischen Neuronen und Gliazellen in Präparaten des Mausdarms ermöglicht. Die Häufigkeit von OCT-Signalen in Kernen enterischer Neuronen und Glia war höher als die in extraganglionären Regionen aufgezeichneten, und interessanterweise induzierten externe Reize wie neuronale Aktivierung oder Hyperosmolarität reversible Veränderungen der OCT-Signalschwankungen. In Zukunft könnte der Einsatz dieser Technik neue Erkenntnisse über Veränderungen der Darm- und Gliafunktionen bei Gesundheit und Krankheiten liefern.

Der FFOCT-Bildgebungsmodus zeigte schwach reflektierende Strukturen an der Schnittstelle zwischen Längs- und Ringmuskulatur, die durch Immunhistochemie als Plexus myentericus identifiziert wurden. Ähnliche Ergebnisse wurden zuvor bei Mäusen mithilfe der OCT-Techniken erzielt, was den Nachweis von Veränderungen in der Dichte myenterischer Ganglien in Tiermodellen der Hirschsprung-Krankheit ermöglichte25. Die FFOCT-Bildgebung zeigte auch hochbrechende Strukturen, die zu den Ganglien an der Schnittstelle zwischen den Längsmuskeln und den Ganglien des Myenteriums passten (Abb. 1a). Diese hochbrechenden Strukturen werden möglicherweise durch kollagenreiche Verbindungen gebildet, welche Moleküle für die Adhäsion der Ganglien an den Längsmuskeln wichtig sind40. Interessanterweise verändert sich die Zusammensetzung dieser extrazellulären Matrix bei pathologischen Erkrankungen wie einer entzündlichen Darmerkrankung41 oder der Hirschsprung-Krankheit42. Daher könnte FFOCT ein interessantes Werkzeug sein, um Veränderungen in der Zusammensetzung der extrazellulären Matrix zu erkennen. In diesem Zusammenhang haben wir kürzlich eine Verringerung der hochreflektierenden FFOCT-Signale in der Dickdarmschleimhaut von Patienten mit Spina bifida gezeigt, die mit einer signifikanten Abnahme der Intensität der Sirius-Rot-Färbung, einem Marker für Kollagenablagerungen, korrelierte43.

Im Gegensatz zu anderen Studien25 ermöglichte uns die FFOCT nicht, einzelne Zellen in den Myenterialganglien sichtbar zu machen. Diese Diskrepanz kann durch technologische Unterschiede wie Objektivlinse oder Lichtquellenintensität zwischen dem von uns verwendeten kommerziellen FFOCT-System (Light CT-Scanner, LLTech) erklärt werden. D-FFOCT bietet jedoch die Möglichkeit, einzelne Zellen über die gesamte Dicke des Gewebes abzubilden Darmgewebe, insbesondere in genau definierten Strukturen wie dem Plexus myentericus und der Epithelzellschicht. Daher wurde dieser technische Ansatz kürzlich verwendet, um Epithelzellen in menschlichen Biopsien aus den verschiedenen Teilen des Darmtrakts zu unterscheiden36. Darüber hinaus bietet D-FFOCT die Möglichkeit, die subzellulären Bewegungen zu integrieren und Bilder entsprechend der Intensität der ausgesendeten Frequenzen bereitzustellen. Subzelluläre Komponenten wie Kerne, die durch erhöhte mittlere und hohe Frequenzen gekennzeichnet sind, waren durch D-FFOCT in den Myenterialganglien deutlich sichtbar, und eine immunhistochemische Analyse zeigte, dass diese Kerne Neuronen oder Gliazellen entsprachen. Interessanterweise waren 96 % der intraganglionären Neuronen durch D-FFOCT sichtbar, während durch D-FFOCT in extraganglionären Regionen oder in den Muskelschichten nur wenige oder keine zellulären Elemente erkannt wurden. Da das D-FFOCT-Signal möglicherweise mit der Stoffwechselaktivität sich bewegender subzellulärer Strukturen zusammenhängt, könnte die Hypothese aufgestellt werden, dass diese Unterschiede die Folge unterschiedlicher Stoffwechselaktivität in den Zellen sind. Die Untersuchung der optimalen Frequenztrennung zwischen drei Farbkanälen könnte interessant sein, um die Visualisierung des ENS weiter zu verbessern. Darüber hinaus konnte nach der Immunfärbung eine gewisse Diskrepanz in der Form und Position der Kerne zwischen D-FFOCT und konfokalen Bildern beobachtet werden. Dies ist wahrscheinlich auf die Verformungen zurückzuführen, die durch den Fixierungs- und Färbeprozess zwischen den beiden Aufnahmen entstehen und die wir vernachlässigen, sowie auf den Registrierungsfehler an sich, der aufgrund der Bildauflösung nicht vermieden werden kann44. Tatsächlich wurde die Registrierung streng durchgeführt, ohne dass eine Verformung zulässig war, um eine voreingenommene Verformung der Formen zu vermeiden. Diese strenge Einschränkung ermöglichte es uns, mit Sicherheit zu behaupten, dass in D-FFOCT Kerne und nicht Zellen beobachtet werden konnten, führte jedoch zu der beobachteten kleinen Fehlpaarung.

In der vorliegenden Studie haben wir auch gezeigt, dass D-FFOCT-Signale in Neuronen und Gliazellen durch externe Reize verändert werden können. Wir haben zunächst gezeigt, dass Hyperosmolarität die FFOCT-Kernsignale auf reversible Weise verringert. Interessanterweise ist bekannt, dass Hyperosmolarität die Bindung von Protein an DNA verändert und einen reversiblen DNA-Kondensationsprozess induziert, der mit der Mitose vergleichbar ist45. Daher könnte die reversible Abnahme der D-FFOCT-Signale nach der Zugabe einer zunehmenden Mannitolkonzentration auf eine verringerte DNA-Bewegung aufgrund der Kern-DNA-Kondensation zurückzuführen sein. Neben der Osmolarität wollten wir den Einfluss der neuronalen Aktivität auf D-FFOCT-Signale bestimmen, da eine erhöhte neuronale Aktivität die Transkriptionsaktivität in Neuronen aktiviert, insbesondere über intrazelluläre Wege wie Mitogen-aktivierte Proteinkinasen46. Tatsächlich könnte eine Änderung der aktivitätsabhängigen Chromatinzustände einen Einfluss auf den Schwingungszustand des Kerns haben. Hier berichteten wir, dass die Stimulation der neuronalen Aktivität mit Veratridin einen Anstieg der mittel- und hochfrequenten D-FFOCT-Signale in den Kernen von Neuronen und Gliazellen in den Myenterialganglien auslöste. Obwohl Gliazellen nicht direkt durch Veratridin aktiviert werden, könnte der Anstieg des D-FFOCT-Signals die Folge von Neuro-Glia-Interaktionen nach neuronaler Aktivierung sein. Interessanterweise wurden nach der Behandlung mit Veratridin Kerne beobachtet, die unter Basalbedingungen nicht in den Myentericusganglien nachgewiesen wurden (ergänzende Abbildung 1). Eine solche Induktion wurde nach hyperosmolaren Reizen nicht beobachtet. Darüber hinaus sind die Gründe für die Tatsache, dass nach der Behandlung mit TTX keine signifikante Änderung der D-FFOCT-Frequenzsignale in Kernstrukturen beobachtet wurde, unbekannt. Dies könnte jedoch auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass die neuronale Aktivität unter Grundbedingungen gering ist, sodass die Zugabe von TTX nur kleine Aktivitätsänderungen hervorrufen würde, die mit unserem System nicht erkannt werden könnten. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die molekulare Basis der D-FFOCT-Signale in den Myenterialganglien zu verstehen. Unsere Daten legen jedoch nahe, dass Änderungen im Schwingungszustand der Kerne mit der Kondensation der Kern-DNA und/oder der Variation der Transkriptionsaktivität zusammenhängen könnten.

Unsere vorliegende Studie liefert den ersten Beweis dafür, dass D-FFOCT verwendet werden könnte, um die neuronalen und Gliazellen im Plexus myentericus in situ abzubilden und zu identifizieren. Veränderungen der Kernschwingungsfrequenzen als Reaktion auf physiologische und nichtphysiologische Reize legen nahe, dass D-FFOCT auch zur Analyse der Zellaktivität und zur Erkennung abnormaler Zellfunktionen nützlich sein könnte.

Männliche C57BL/6J Rj-Mäuse im Alter von 8–12 Wochen (Janvier Laboratory, Le Genest-Saint-Isle, Fr) wurden in einem 12-stündigen Hell/Dunkel-Zyklus mit ad libitum Zugang zu Futter und Wasser gehalten. Die Forscher waren von der französischen Veterinärbehörde akkreditiert und die Experimente wurden in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen des örtlichen Ausschusses für Tierpflege und -nutzung in Nantes (Frankreich) durchgeführt. Nach einer einwöchigen Anpassungsphase wurden die Tiere durch Genickbruch zur Gewebeentnahme getötet. Der gesamte Darm jeder Maus wurde schnell herausgeschnitten und in eine eiskalte Krebslösung gegeben (NaCl, 117 mM; KCl, 4,7 mM; MgCl2, 1,2 mM; NaH2PO4, 1,2 mM; NaHCO3, 25 mM; CaCl2, 2,5 mM; Glucose, 11 mM).

Darmgewebe von erwachsenen Mäusen wurden gesammelt, mit kalter Krebslösung gewaschen und in kleine Stücke geschnitten. Dann wurden Abschnitte des distalen Dickdarms in Längsrichtung entlang des Mesenteriums geöffnet, gestreckt und auf Sylgard (Dow Corning, Midland, MI) befestigt, das als Probenträger geeignet war.

FFOCT- und D-FFOCT-Bilder wurden mit dem Light-CT-Scanner (LLtech, Paris, Fr) erstellt, der auf einem Antivibrationstisch (CleanBench mit Gimbal Piston Vibration Isolation, Photon Lines SAS, St. Germain-en-Laye, Fr) platziert war. Die Sylgard-Trägerplatte wurde mit ausreichend Lösung in den Scannerhalter gelegt, um ein Austrocknen zu verhindern. Nach der Beleuchtung der Probe mit einer Halogenlichtquelle interferierte das von der Probe reflektierte Licht mit dem Referenzarmlicht im Linnik-Interferometer, bevor es von einer Megapixelkamera erfasst wurde. Zweidimensionale (2D) „en face“-Bilder wurden mit einem Sichtfeld von 1,25 mm × 1,25 mm und einer Voxelgröße von 1 µm × 1 µm × 1 µm aufgenommen. Das System ermöglichte die Erkundung der Probentiefe bis zu einer Tiefe von etwa 150 µm. Für D-FFOCT wurden 1000 Bilder bei 300 Hz gesammelt (Ausgabe von Interferometerbildern alle 3,3 ms für 3,3 s). Um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern, wurde ein nicht überlappender Durchschnitt von vier Bildern als Tiefpassfilter angewendet, um höhere Frequenzen wirksam zu dämpfen und dadurch Rauschen zu unterdrücken und gleichzeitig mehr Photonen zu messen. Um das Signal-Rausch-Verhältnis im kommerziellen Light-CT-Scanner zu maximieren, sind die RGB-Integrationsbänder auf den niederfrequenten Blaukanal (0–0,6 Hz), den mittelfrequenten Grünkanal (0,6–5,4 Hz) und den Hochfrequenzkanal voreingestellt -Frequenz-Rotkanal (5,4–25 Hz).

Nach der FFOCT-Bildgebung wurden die Dickdarmproben 3 Stunden lang bei Raumtemperatur in 4 % Paraformaldehyd in PBS fixiert, gewaschen und bis zur Verwendung in PBS NaN3 (1 g pro Liter) gelagert. Die Permeabilisierung wurde durch 48- bis 36-stündige Inkubation der Gewebe in PBS NaN3, ergänzt mit 10 % Pferdeserum, 3 % Triton X100 und 0,05 % Saponin, bei 4 °C unter Rühren erreicht. Anschließend wurden die Proben 24 Stunden lang in permeabilisiertem Puffer mit den Primärantikörpern Anti-Hu (menschlicher monoklonaler Antikörper im Verhältnis 1:500, Gabe) und Anti-S100b (polyklonaler Kaninchen-Antikörper im Verhältnis 1:3, Dako Agilent, Santa Clara, USA) inkubiert Raumtemperatur unter Rühren. Nach dem Waschen wurden die Proben 5 Stunden lang in permeabilisiertem Puffer mit sekundären Antikörpern, Ziegen-Anti-Kaninchen-Cy5, verdünnt auf 1:500 (Jackson Immuno Research, Cambridge House, UK) und Esel-Anti-Mensch-Cy3, verdünnt auf 1/500 (Jackson Immuno Research), inkubiert ) bei Raumtemperatur unter Rühren. Nach dem Waschen wurde eine nukleare Gegenfärbung für 10 Minuten bei Raumtemperatur unter Verwendung von DAPI (1:1000 in PBS Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA) durchgeführt und die Proben zwischen Objektträger und Deckobjektträger mit einem lichtbeständigen Eindeckmedium (Prolong gold antifade, Thermofisher) befestigt , Waltham, USA).

Die Proben wurden mit dem fluoreszierenden AxioZoom.V16 (Zeiss, Marly le Roi, Fr) in Verbindung mit Apotome2 betrachtet. Konfokale Bilder wurden auch mit dem konfokalen Mikroskop Nikon A1 RSi (Nikon SAS, Champigny sur Marne, Fr) mit zwei Objektiven 60x und 20x aufgenommen. Bilder von FFOCT und Apotome wurden mit dem „Align Image by line ROI“-Plugin T. 3D D-FFOCT (Fidschi-Software)47 ausgerichtet, während konfokale 3D-Bilder mit der ICY-Software48 wie unten beschrieben ausgerichtet wurden.

Bilder von D-FFOCT wurden mit ec-clemv244 unter ICY ausgerichtet.

Um den Gehalt an D-FFOCT auf zellulärer Ebene genau zu beurteilen, wurde die Registrierung in 3D durchgeführt, um die Posenänderung der Probe zwischen den beiden Systemen zu berücksichtigen, und unter der strikten Annahme, dass die Gewebeverformung auf dieser Skala vernachlässigbar sein wird. Nach der D-FFOCT-Bildgebung (ergänzende Abbildung 3a) wurden die Proben auf dem konfokalen Nikon A1R mit 20-facher Vergrößerung abgebildet, um ein Referenzbild zu erhalten, das die Identifizierung des interessierenden Bereichs erleichtert (ergänzende Abbildung 3e). Anschließend wurde ein Stapel in einem beliebigen Sichtfeld mit 60-facher Vergrößerung aufgenommen (ergänzende Abbildung 3f). Die maximale Intensitätsprojektion des 20x wurde zunächst manuell im D-FFOCT registriert, wobei die interessierende Struktur verwendet und die Einschränkung so eingestellt wurde, dass keine Skalierung oder Verformung in der Transformation erfolgt (nur Rotation und Translation zulässig). Dies ergibt die 2D-Transformationsmatrix von 20x bis D-FFOCT. Auch wenn die Anzahl der Pixel in beiden Bildern sehr unterschiedlich war, verwendete ec-clemv2 die Pixelgröße, um die Transformation in Mikrometereinheiten zu berechnen, basierend auf den von den Instrumenten bereitgestellten Bildmetadaten, was uns ermöglichte, die Transformation auf starre Grenzen zu beschränken. Die Projektion mit maximaler Intensität der 60-fachen konfokalen Erfassung wurde mithilfe des Autofinder-Teils von ecclemv2 automatisch in der Projektion mit maximaler 20-facher Intensität gefunden. unter Verwendung eines maßgeschneiderten Eisprotokolls. Dies ergibt die 2D-Transformation von 60x auf 20x. Diese Transformationen wurden kombiniert, um mithilfe der kaskadierten Transformationsfunktion von ecclemv2 zu berechnen, und wurden invertiert, um die D-FFOCT-zu-60x-2D-Transformation zu erhalten. Diese Transformation wurde auf den D-FFOCT-Vollstapel angewendet und diente als Initialisierung für die starre 3D-Registrierung, die auf dem manuell ausgewählten Zentrum dessen basierte, von dem angenommen wurde, dass es mit einigen Kernen übereinstimmt (etwa 10 Punkte, die in beiden Bildern in 3D lokalisiert sind). Die starre Einschränkung ermöglichte es uns, die Bilder nicht zu verformen und die gute Übereinstimmung der nicht für die Registrierung verwendeten Kerne zu überprüfen.

Um jede Kerngröße von Neuronen- und Gliazellen zu unterscheiden und zu quantifizieren, wurden D-FFOCT-Bilder und Apotombilder mit dem Algorithmus „Align Image by line ROI Plugin“ von FIJI überlagert.

Für die Kernanalyse wurden aus den D-FFOCT-Bildern mithilfe des WEKA-Plugins in Fidschi Masken erstellt. Es wurde berichtet, dass die Masken die roten, grünen und blauen Bilder aufspalteten. Anschließend wurde der 2D-ROI mit den Parametern mittlere Intensität für jedes Kompartiment analysiert. Wir haben den Mittelwert der Intensität von 125 Gliakernen und 219 Neuronenkernen bestimmt.

Nach der Markierung der zu analysierenden Bereiche wurde jede auf Sylgard fixierte Gewebeprobe vor der Behandlung (T0) mit D-FFOCT abgebildet. Anschließend wurde die Probe von der Trägerplatte entnommen, in Zellkulturplatten mit 6 Vertiefungen gegeben und mit 75 µM Veratridin (Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA) und 1 µM TTX (Bio-Techne SAS, Noyal-Châtillon sur Seiche) behandelt , Frankreich), 100 mM, 200 mM und 300 mM D-Mannitol (Sigma-Aldrich), 0,1 % (Vol./Vol.) DMSO (Veratridin-Kontrolle) oder Krebs (TTX- und Mannitol-Kontrolle) für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Rühren (200 U/min). Anschließend wurde jede auf Sylgard fixierte behandelte Gewebeprobe mit dem gleichen Druck und der gleichen Lokalisierung (X, Y) in den Scannerhalter zurückgebracht, um durch D-FFOCT (T1) abgebildet zu werden. Jede Gewebeprobe wurde dann zweimal jeweils 15 Minuten lang gewaschen und erneut mittels D-FFOCT (T2) abgebildet.

Die D-FFOCT-Bilder der Ganglien, die vor der Behandlung (T0), nach der chemischen Behandlung (T1) und nach dem Waschen (T2) aufgenommen wurden, wurden mithilfe der „Align-Funktion“ in Fidschi ausgerichtet.

Für die Analyse der gesamten Ganglien wurden die bei T0 beobachteten Ganglien manuell umgeben, um eine Maske zu erstellen, die Berichten zufolge die bei T0, T1 und T2 aufgenommenen roten, grünen und blauen Bilder aufteilte und die mittlere Intensität in den gesamten Ganglien misst. Blau entspricht niedriger Frequenz (LF, 0–0,6 Hz), Grün entspricht mittlerer Frequenz (MF, 0,6–5,4 Hz) und Rot entspricht hoher Frequenz (HF, 5,4–25 Hz).

Für die Kernanalyse wurden Masken aus den bei T0 mit dem WEKA-Plugin49 in Fidschi aufgenommenen Bildern erstellt (ergänzende Abbildung 4). Es wurde berichtet, dass die Masken die roten, grünen und blauen Bilder aufspalteten. Die mittlere Intensität jedes Kerns wurde zu T0, T1 und T2 berechnet. Wenn die Ergebnisse in Prozent von T0 ausgedrückt wurden, wurden die Werte für jeden Kern berechnet und Mittelwerte pro Ganglien verwendet.

Die Anzahl der unabhängigen Experimente wird in den Legenden der Abbildungen angegeben. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des nichtparametrischen zweiseitigen Mann-Whitney-T-Tests oder des zweiseitigen Kruskal-Wallis-Tests gefolgt von einem Dunn-Test bestimmt. Alle statistischen Analysen wurden mit GraphPad Prism (GraphPad Prism 8.0, GraphPad Software Inc) durchgeführt und Unterschiede mit einem p-Wert von 0,05 oder weniger wurden als statistisch signifikant angesehen. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Numerische Daten, die während dieser Studie generiert oder analysiert wurden, sind in diesem veröffentlichten Artikel (und seiner ergänzenden Datendatei) enthalten. Die in der aktuellen Studie präsentierten mikroskopischen Aufnahmen sind im [OMERO]-Repository verfügbar [https://omero.os-bird.glicid.fr/webclient/?show=project-315 Login: Gast_Benutzerpasswort: Willkommen!1].

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Referenzen herunterladen

Diese Arbeit wurde von Mibiogate (Convention 2016-11179) von „Région Pays de la Loire“ und der Fondation SantéDige unterstützt. Wir danken der IBISA MicroPICell-Einrichtung (Biogenouest), Mitglied der nationalen Infrastruktur France-Bioimaging, unterstützt von der französischen Nationalen Forschungsagentur (ANR-10-INBS-04). PP-G. wird vom ANR CROCOVAL (ANR-18-CE45-0015) unterstützt.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Michel Neunlist, Philippe Naveilhan.

Nantes Université, CHU Nantes, Inserm, TENS, The Enteric Nervous System in Darm and Brain Diseases, IMAD, Nantes, Frankreich

Tony Durand, Lara Laboudie, Emmanuel Coron, Isabelle Neveu, Michel Neunlist und Philippe Naveilhan

Universität Nantes, CNRS, INSERM, Thorax-Institut, F-44000, Nantes, Frankreich

Perrine Paul Gilloteaux

Universität Nantes, Universitätsklinikum Nantes, Inserm, CNRS, SFR Health, Inserm UMS 016, CNRS UAR 3556, F-44000, Nantes, Frankreich

Perrine Paul Gilloteaux

Wyss Center for Bio and Neuroengineering, Campus Biotech, Genf, Schweiz

Michalina Gora

ICube Laboratory, CNRS, Universität Straßburg, Straßburg, Frankreich

Michalina Gora

Abteilung für Gastroenterologie und Hepatologie, Universitätsklinikum Genf (HUG), rue Gabrielle Perret-Gentil 4, 1211, Genf, 1205, Schweiz

Emmanuel Coron

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MN, PN und TD tragen zum Design, der Konzeption und der Interpretation des Werkes bei; TD, LL, PP-G. und PN erfassten, analysierten und interpretierten die Daten; TD, PN und MN haben den MS entworfen; PP-G., MG, EC und IN kritische Überarbeitung des Manuskripts.

Korrespondenz mit Michel Neunlist.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Chao Ren und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Chao Zhou und Manuel Breuer.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Durand, T., Paul-Gilloteaux, P., Gora, M. et al. Visualisierung der Aktivität des enterischen Nervensystems durch farbstofffreie dynamische optische Vollfeld-Kohärenztomographie. Commun Biol 6, 236 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04593-9

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Eingegangen: 19. August 2022

Angenommen: 14. Februar 2023

Veröffentlicht: 02. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04593-9

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