Silber

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 19866 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Kardiales Troponin I (cTnI) ist ein spezifischer kardialer Biomarker zur Diagnose eines akuten Myokardinfarkts (AMI). Zur Früherkennung von AMI ist nach wie vor ein empfindlicher und einfacher Point-of-Care-Test (POCT) erforderlich. Um diesem Bedarf gerecht zu werden, haben wir einen Dip-Strip-Assay entwickelt, der auf einem Sandwich-Immunoassay in Verbindung mit einem Silberverstärkungssystem basiert. Zur Erhöhung der Empfindlichkeit wurden Vorinkubation und Silberverstärkung in den Tauchstreifen eingeführt. Aufgrund der katalytischen Reaktion der Silberverstärkungslösung änderte sich die rote Farbe der AuNPs zu Dunkelbraun, da Silberionen ausfielen und die AuNPs vergrößerten. Die erhaltenen Ergebnisse waren mit bloßem Auge leicht zu erkennen. Zur quantitativen Analyse wurde die Farbintensität der Ergebnisse mithilfe eines Smartphones mit RGB-Farbauswahlanwendung analysiert. Die Auswirkungen der Betriebsparameter (Volumen des AuNP-Ab-Konjugats, Probenvolumen, Inkubationszeit und Analysezeit) wurden untersucht und optimiert. Unter optimalen Bedingungen betrug die Nachweisgrenze (LOD) mit bloßem Auge 0,5 ng/ml. Der LOD mit Silberverstärkung war 50-fach niedriger als ohne. Bei der quantitativen Analyse mit dem Smartphone wurde eine lineare Erkennung im Bereich von 0,5–50 ng/ml (R2 = 0,9952) beobachtet, und der LOD betrug 0,12 ng/ml. Die entwickelte Methode wurde erfolgreich zum Nachweis von cTnI in Serumproben angewendet und erzielte analytische Wiederfindungen und %RSD im Bereich von 96,10–119,17 % bzw. 2,91–5,13 %. Darüber hinaus war dieser entwickelte Test nicht kreuzreaktiv mit den potenziell störenden Serumproteinen. Diese Ergebnisse zeigten das große Potenzial dieses Dip-Strip-Assays als alternatives POCT zum Nachweis von Serum-cTnI.

Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVDs) sind eine Gruppe von Herz- und Blutgefäßerkrankungen. Die Zahl und die Sterblichkeit von Herz-Kreislauf-Patienten nehmen jedes Jahr zu und es wird erwartet, dass dieser Trend auch in Zukunft anhält1,2. Eine Verstopfung der Herzkranzgefäße führt zu einer verminderten Durchblutung und einer unzureichenden Blutversorgung des Herzmuskels, was zu dessen Schädigung führt. Der geschädigte Herzmuskel wird sich verschlechtern und schließlich absterben. Diese Art von Herzschädigung wird als Myokardinfarkt (MI) bezeichnet. Wenn das Herz geschädigt ist, werden kardiale Biomarker wie Myoglobin, Kreatinkinase-Myokardband (CK-MB), kardiales Troponin T (cTnT) und kardiales Troponin I (cTnI) in den Blutkreislauf freigesetzt3. Derzeit gilt cTnI aufgrund seiner einzigartigen kardialen Isoform als der spezifischste kardiale Biomarker und der Goldstandard für die Diagnose von Herzinfarkt4,5. cTnI ist ein Protein, das sich zwischen Aktinfilamenten des normalen Herzmuskelgewebes befindet. Nach Einsetzen der Brustschmerzen sind die kardialen Troponinfragmente innerhalb von 4–9 Stunden im Blutkreislauf erhöht, wobei die vorherrschende Form der cTnC-cTnI-Komplex ist6. Seine Konzentration steigt weiter an, bis sie 12–24 Stunden später einen Höhepunkt erreicht und bis zu 10–14 Tage lang erhöht bleibt. Das Ausmaß des kardialen Troponin-Anstiegs hängt mit der Schwere oder Größe der Herzverletzung zusammen7,8. Dementsprechend ist die Messung des cTnI-Spiegels Teil einer klinischen Risikobewertung, die eine frühzeitige Diagnose, Prognose und Überwachung eines akuten Myokardinfarkts (AMI) ermöglicht, wobei ein cTnI-Spiegel von 0,4 ng/ml oder mehr als Hinweis auf einen AMI gilt9,10,11.

Heutzutage ist die herkömmliche Methode zur Messung kardialer Biomarker der Elektrochemilumineszenz-Immunoassay (ECLIA)12,13,14. Obwohl die Methode eine hohe Empfindlichkeit und Spezifität bietet, erfordert sie ein großes Tischerkennungssystem und erfahrene Bediener. Darüber hinaus sind die Instrumente sehr teuer und verursachen hohe Betriebskosten. Alternativ handelt es sich bei POCT-Geräten um tragbare Hilfsmittel, die dem medizinischen Personal dabei helfen, Patienten sofort zu versorgen. Lateral-Flow-Immunoassays (LFIAs) sind potenzielle Screening-Instrumente, die als POCTs eingesetzt werden. Dies liegt daran, dass es sich um kostengünstige und einfache Tests handelt, die mit minimalem Schulungsaufwand durchgeführt werden können. In den letzten Jahren wurde über LFIAs zur Messung von kardialem Troponin I unter Verwendung verschiedener Signalmarkierungen wie dualer Goldnanopartikel15, fluoreszierender Mikrokügelchen16, Quantenpunkte17, magnetischer Partikel18,19,20, enzymkatalysierter Markierung21,22, aufwärtskonvertierender Nanopartikel23,24 usw. berichtet ionendotierte Nanopartikel25. Diese Tests haben jedoch ihre eigenen Einschränkungen. Beispielsweise erfordern fluoreszierende Partikel ein Fluoreszenzlesegerät, und man muss sich Gedanken über Photostabilität und Quantenausbeute machen. Für die enzymkatalysierte Markierung beschreiben die Berichte Wechselwirkungen zwischen Enzym und Substrat und deren Analyse mithilfe chemiluminometrischer Detektoren. Diese Techniken werden durch die damit verbundenen Sensorlesegeräte erschwert, die einen hohen Betriebs- und Materialaufwand erfordern. Darüber hinaus sind die Verfahren zur Signalmarkierung von Antikörpern umständlich.

Kolloidale Goldnanopartikel (AuNPs) werden aufgrund ihrer Biokompatibilität, einfachen Synthese, Stabilität, Präzision und leistungsstarken optischen Eigenschaften häufig als Markierungen mit Antikörpern für kolorimetrische Immunoassays verwendet26. Allerdings sind sie normalerweise durch eine geringe Nachweisempfindlichkeit eingeschränkt. Mehrere Gruppen haben Signalverstärkung, einschließlich Silberverstärkung, eingesetzt, um die Empfindlichkeit dieser AuNP-basierten Immunoassays zu verbessern27,28,29. Diese Methode nutzt die katalytische Silberionenreduktion und die AuNPs fungieren als Kerne, was zur Ausfällung von Silberionen auf AuNP-Oberflächen führt. Die große Partikelgröße der AuNPs sorgt für die dunkle Farbe und erhöht sogar deren Intensität. Dadurch werden sie besser sichtbar und die Ergebnisse können mit bloßem Auge abgelesen werden. Für den kolorimetrischen Nachweis von cTnI28 wurde ein Poly(dimethylsiloxan) (PDMS)-Chip mit Silberverstärkung vorgeschlagen. Allerdings ist die Herstellung eines solchen Chips ein komplizierter Vorgang und das PDMS ist leicht verformbar, was manchmal zu einer ungenauen Musterplatzierung führt. Darüber hinaus werden bei der Immunogold-Silberfärbung zur Erhöhung der Empfindlichkeit für den cTnI-Nachweis 96-Well-Platten verwendet, ein Prozess, der geschultes Personal erfordert und zeitaufwändig ist29. In dieser Arbeit wurde die Silberverstärkungsmethode zur Erhöhung der Empfindlichkeit im Dip-Strip-Assay eingeführt.

Vor kurzem wurden POCT-Geräte mit kolorimetrischen Tests für eine einfache und schnelle Erkennung integriert30,31. Ihre Ergebnisse können einfach mithilfe einer Digitalkamera mit Bildverarbeitungsfunktion interpretiert werden, um die Farbintensität der Ergebnisse in Abhängigkeit von der Analytkonzentration zu quantifizieren. Heutzutage werden mit Digitalkameras ausgestattete Smartphones zunehmend als Datenanalysetools eingesetzt. Mit entsprechender Software werden sie zur Detektion und Quantifizierung für kolorimetrische Messungen eingesetzt. Einige Smartphones haben sich aufgrund ihrer Einfachheit, Tragbarkeit und geringen Kosten im Vergleich zu kommerziellen Instrumenten als tragbare Analysedetektoren etabliert32. Daher ist die Nutzung eines Smartphones eine alternative Möglichkeit zur quantitativen Messung.

In dieser Studie wurde ein AuNP-basierter Tauchstreifen, der einen Sandwich-Immunoassay in Verbindung mit Silberverstärkung nutzt, für den Einsatz als POCT-Gerät entwickelt und bietet einen einfachen und empfindlichen Assay, der keine komplizierten und teuren Geräte erfordert. Bei diesem Test hatten die positiven Ergebnisse eine dunkelbraune Farbe und waren mit bloßem Auge leicht zu erkennen. Die Nachweisempfindlichkeit wurde im Vergleich zum Test ohne Silberverstärkung um das 50-fache verbessert. Außerdem wurde eine Smartphone-basierte Kolorimetrie zur einfachen quantitativen Messung von cTnI in das System integriert. Das entwickelte Gerät wurde erfolgreich zur cTnI-Bestimmung in Serumproben mit guter Genauigkeit und Zuverlässigkeit eingesetzt.

Um AuNPs mit Antikörpern zu konjugieren, wurden die Auswirkungen der Konzentration des Antikörpers gegen kardiales Troponin I (Anti-cTnI) und des pH-Werts der AuNPs-Lösung untersucht. Die optimale Konzentration des Anti-cTnI-Antikörpers für die Konjugation mit AuNPs wurde anhand von Ergebnissen mit einer Reihe von Konzentrationen (0, 10, 50, 75, 100, 150, 175 und 200 µg/ml) bestimmt. Anschließend wurde 10 % NaCl zu der Mischung hinzugefügt, die Anti-cTnI-Antikörper und AuNPs enthielt. Die Ergebnisse sind in Abb. 1a dargestellt. Durch die Zugabe von NaCl wurde die AuNP-Aggregation induziert, was zu einer Farbänderung der AuNPs von Rot nach Blau führte. Bei niedrigen Konzentrationen an Anti-cTnI-Antikörpern war die Farbe der AuNPs aufgrund des Überschusses an freien AuNPs violett oder rotviolett. Dagegen kam es bei den hohen Konzentrationen an Anti-cTnI-Antikörpern aufgrund der ausreichenden Antikörperbindung zu keiner Farbveränderung der AuNP-Suspensionen. Die UV-sichtbaren Spektren von AuNPs (Abb. 1b) zeigten, dass die Absorption (λmax = 520 nm) mit zunehmender Anti-cTnI-Antikörperkonzentration zunahm und ein Plateau bei 175 µg/ml erreichte. Daher wurde eine Konzentration von 175 µg/ml Anti-cTnI-Antikörper als Konzentration ausgewählt, die im nächsten Experiment verwendet werden soll.

(a) Die Ergebnisse von AuNP-Lösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen an Anti-cTnI-Antikörpern nach Zugabe von 10 % NaCl. (b) Auftragung der bei 520 nm beobachteten Absorption gegen die Konzentration des Anti-cTnI-Antikörpers. (c) Diagramm der Absorptionsverhältnisse von AuNPs über den pH-Wert nach Zugabe von 10 % NaCl mit einer festen Anti-cTnI-Antikörperkonzentration von 175 µg/ml.

Da der pH-Wert die AuNP-Ab-Bindungsaktivität und -stabilität beeinflusst, wurde er durch Anpassen der pH-Werte von 5 bis 9 untersucht. Die Stabilität und Polydispersität der kolloidalen Lösung wurden durch Berechnen des Absorptionsverhältnisses bei λmax/580 nm und 600 nm/λmax bestimmt (λmax = 520 nm)27. Die Ergebnisse (Abb. 1c) zeigten, dass die größte Stabilität und die geringste Polydispersion bei pH 7 auftraten. Daher wurde dieser optimale pH-Wert für die anschließende Herstellung von mit Anti-cTnI-Antikörpern konjugierten AuNPs gewählt.

Zur Charakterisierung der mit Anti-cTnI-Antikörpern konjugierten AuNPs wurden UV-sichtbare Spektren und TEM-Bilder verwendet, um nackte und Ab-konjugierte AuNPs zu vergleichen. Wie in Abb. 2a gezeigt, besaßen unkonjugierte AuNPs ein Oberflächenplasmon-Extinktionsspektrum mit einem maximalen Peak bei 520 nm. Nach der Konjugation von AuNPs mit Anti-cTnI-Antikörper zeigten die UV-Vis-Spektren leicht erhöhte Absorptionsspektren mit leicht verschobenem Peak (auf 530 nm). Diese spektrale Verschiebung wurde durch eine Änderung der lokalisierten Oberflächenplasmonresonanz verursacht, die durch die Proteinadhäsionsschicht beeinflusst wird. Darüber hinaus zeigten TEM-Bilder (Abb. 2b), dass der durchschnittliche Durchmesser der AuNPs 20 nm betrug. Nach physikalischer Absorption des Antikörpers auf AuNPs erhöhte sich der durchschnittliche Durchmesser auf 25 nm. Diese Ergebnisse zeigten eine erfolgreiche Konjugation des Anti-cTnI-Antikörpers an die AuNPs33,34.

(a) Oberflächenplasmon-Extinktionsspektren (durch UV-sichtbare Spektren) von nackten und Ab-konjugierten AuNPs. (b) Transmissionselektronenmikroskopische Bilder von (i) AuNPs und (ii) Ab-konjugierten AuNPs.

Um den hochempfindlichen Nachweis von cTnI zu erhalten, der für die Diagnose von AMI erforderlich ist, wurde ein auf einem Sandwich-Immunoassay basierender Tauchstreifen mit Vorinkubations- und Signalverstärkungsschritten entwickelt, gekoppelt mit einer Smartphone-basierten kolorimetrischen Nachweisanwendung (Abb. 3b). In diesem entwickelten Assay wurde eine Vorinkubation des AuNP-Ab-Konjugats mit der Probe eingeführt, um die Bindung des AuNP-Ab-Konjugats an cTnI zu vervollständigen. Dieses Verfahren erhöht nachweislich die Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und Genauigkeit des Tests35. Nach dem Eintauchen des Tauchstreifens in die Mischung aus AuNP-Ab-Konjugat und cTnI-haltiger Probe wanderte das cTnI-AuNP-Ab-Konjugat durch Kapillarwirkung durch eine Nitrozellulosemembran.

(a) Schematische Darstellung des Tauchstreifens basierend auf einem Sandwich-Immunoassay. (b) Schematische Darstellung des Dip-Strip-Verfahrens. (c) Schematische Darstellung der Silberverstärkungsreaktion, die die Änderung der AuNP-Farbe zeigt.

In Gegenwart von cTnI band der immobilisierte Anti-cTnI-Antikörper spezifisch das cTnI-AuNP-Ab-Konjugat an der Testlinie. Währenddessen floss überschüssiges freies AuNP-Ab-Konjugat zur Kontrolllinie und reagierte mit dem Ziegen-Anti-Maus-Antikörper. Das Ergebnis war eine rote Farbe sowohl an der Test- als auch an der Kontrolllinie. Andererseits zeigten die Ergebnisse in Abwesenheit von cTnI nur die rote Farbe an der Kontrolllinie. Der Nachweis mit dieser Methode wies jedoch eine geringe Empfindlichkeit auf.

Um die Empfindlichkeit zu erhöhen, wurde der Tauchstreifen mit Silber verstärkt, basierend auf einer durch AuNPs katalysierten chromogenen Reaktion (Abb. 3c). Nachdem die Mischung aus Silbernitrat und Hydrochinonlösung auf den Tauchstreifen aufgetragen wurde, wurden die Silberionen durch Hydrochinon reduziert, um eine Hülle auf AuNPs zu bilden. Die rote Farbe der AuNPs veränderte sich offenbar aufgrund der auf den AuNP-Oberflächen ausgefällten Silberionen zu einer dunkelbraunen Farbe. Positive Ergebnisse (in Gegenwart von cTnI) zeigten eine dunkelbraune Farbe sowohl an der Test- als auch an der Kontrolllinie, während negative Ergebnisse (in Abwesenheit von cTnI) nur an der Kontrolllinie eine dunkelbraune Farbe anzeigten. Die Testergebnisse waren erkennbar und konnten mit bloßem Auge halbquantitativ interpretiert werden. Darüber hinaus konnten die Ergebnisse anhand der RGB-Intensität per Smartphone mit einer RGB-Anwendung quantifiziert werden.

Es wurden Parameter untersucht, die die Empfindlichkeit des Tauchstreifens beeinflussen könnten. Dazu gehörten das Volumen der mit Anti-cTnI-Antikörpern konjugierten AuNPs, das Probenvolumen, die Inkubationszeit und die Analysezeit. Um Ergebnisse zu erhalten, wurde die RGB-Intensität an der Testlinie nach dem Testen mit 250 ng/ml cTnI und anschließender Signalverstärkung per Smartphone mit einer RGB-Farbauswahlanwendung interpretiert.

Die Wirkung des AuNP-Ab-Konjugatvolumens wurde durch Zugabe von AuNP-Ab-Konjugat in Volumina von 3, 5, 7 oder 9 µL zu Proben, die 40 µL cTnI enthielten, und anschließende Inkubation für 60 Minuten optimiert. Die höchste RGB-Intensität (B/T-Verhältnis) wurde erhalten, wenn das Volumen des AuNP-Ab-Konjugats 7 µL betrug (Abb. 4a). Daher wurde diese Konzentration an AuNP-Ab-Konjugat für weitere Experimente verwendet.

Optimierung verschiedener Parameter, die den Dip-Strip-Immunoassay beeinflussen: (a) AuNP-Ab-Konjugatvolumen, (b) Probenvolumen, (c) Inkubationszeit und (d) Analysezeit. Datenpunkte stellen den Mittelwert von drei Replikaten (n = 3) dar, Fehlerbalken.

Probenvolumina (40, 60 und 80 µL) wurden vergleichend ausgewertet. Wie in Abb. 4b gezeigt, nahm die Farbintensität mit zunehmendem Probenvolumen von 40 auf 60 µL zu. Die höchste RGB-Intensität (B/T-Verhältnis) an der Testlinie wurde bei 60 µL gezeigt. Dann nahm die Farbintensität bei 80 µL ab. Der „Hook-Effekt“ trat auf, wenn das Probenvolumen aufgrund einer hohen Analytkonzentration über 60 µL betrug. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden 60 µL als optimales Probenvolumen für den Teststreifen ausgewählt.

Der Einfluss der Inkubationszeit auf die Antigen-Antikörper-Bindung wurde bei Raumtemperatur für 0, 15, 30, 45 und 60 Minuten untersucht. Wie in Abb. 4c gezeigt, nahm das B/T der RGB-Intensität an der Testlinie mit zunehmender Inkubationszeit zu und erreichte nach 45 Minuten einen Plateauzustand. Dies zeigte an, dass die Reaktion zwischen AuNP-Ab-Konjugat und cTnI abgeschlossen war. Wir haben daher 45 Minuten als optimale Inkubationszeit für den entwickelten Assay gewählt, eine kürzere Zeit als für das kommerzielle ELISA-Kit erforderlich.

Eines der wichtigsten Merkmale eines diagnostischen Tests ist die Analysezeit. In diesem Test bewirkte der Silberverstärker, dass sich die Farbe der Testlinie von Rot nach Dunkelbraun änderte. Die Analysezeit zur Ergebnisinterpretation wurde über 30 Minuten (bei 0, 5, 10, 15, 20, 25 und 30 Minuten) untersucht. Die Farbintensität nahm mit zunehmender Analysezeit von 0 auf 15 Minuten zu (Abb. 4d). Das höchste B/T der RGB-Intensität an der Testlinie wurde nach 15 Minuten erreicht und stieg nicht weiter an. Die Testergebnisse auf dem Streifen waren nach 15–30 Minuten stabil. Daher wurden 15 Minuten als optimale Analysezeit für das Teststreifenverfahren gewählt.

Die Leistung des entwickelten Tauchstreifens wurde unter den oben beschriebenen optimalen Bedingungen analysiert. Serumproben, die cTnI enthielten, wurden mittels Elektrochemilumineszenz analysiert, um die cTnI-Konzentration zu bestimmen. Die Ergebnisse wurden mit Seren erzielt, die mit cTnI in Konzentrationen von 0 bis 250 ng/ml versetzt waren (Abb. 5a). Die Farbintensität an der Testlinie wurde vor und nach der Signalverstärkung überwacht. Die mit bloßem Auge ohne und mit Silberanreicherung erreichte Nachweisgrenze (LOD) betrug 25 bzw. 0,5 ng/ml. Somit führte die Silberverstärkung zu einer 50-fachen Steigerung der Empfindlichkeit dieses entwickelten cTnI-Teststreifens.

(a) Bilder von cTnI, nachgewiesen bei Konzentrationen von 0–250 ng/ml (i) vor und (ii) nach der Silberverstärkung. (b) Diagramm der RGB-Intensität (B/T-Verhältnis) gegenüber der cTnI-Konzentration, interpretiert durch ein Smartphone mit RGB-Farbauswahlanwendung. (c) Kalibrierungskurve der cTnI-Konzentration im Bereich von 0–50 ng/ml. (d) Kalibrierungskurve der cTnI-Konzentration im Bereich von 50–250 ng/ml.

Für die quantitative Messung mit dem Smartphone war das interessierende Ergebnis die RGB-Intensität (B/T-Verhältnis) an der Testlinie, die mithilfe einer RGB-Farbauswahlanwendung ermittelt wurde. Die RGB-Intensität gegen die cTnI-Konzentration wurde aufgetragen (Abb. 5b). Es wurde festgestellt, dass die B/T-Verhältnisse der RGB-Intensität proportional mit der cTnI-Konzentration ansteigen. Als die cTnI-Konzentration jedoch 100 ng/ml erreichte, verlangsamte sich der Intensitätsanstieg und schien sich bei 250 ng/ml zu stabilisieren. Wie in Abb. 5c gezeigt, bestand eine gute lineare Beziehung zwischen der Signalintensität und der cTnI-Konzentration im Bereich von 0,5–50 ng/ml. Die lineare Gleichung und der entsprechende Korrelationskoeffizient waren Y(Linear) = 0,0113x + 1,0286 bzw. R2 = 0,9952, wobei Y die RGB-Intensität (B/T-Verhältnis) an der Testlinie und X die cTnI-Konzentration ist. Die Fehlerbalken des RSD werden aus drei unabhängigen Messungen abgeleitet. Der berechnete LOD (3,3 SD/Steigung) betrug 0,12 ng/ml, ein Wert, der unter dem cTnI-Grenzwert (0,4 ng/ml) liegt, der für die Diagnose eines akuten Myokardinfarkts (AMI) verwendet wird9,10,11. Darüber hinaus konnten aus der Kalibrierungskurve als Funktion der logarithmischen Trendlinie höhere cTnI-Konzentrationen (50–250 ng/ml) ermittelt werden (Abb. 5d). Die logarithmische Gleichung und ihr entsprechender Korrelationskoeffizient waren Y(Logarithmisch) = 1,4804ln(X) − 4,1308 bzw. R2 = 0,9827. Da mit dem Einsetzen von Brustschmerzen der Serum-cTnI-Spiegel innerhalb von 4 Stunden ansteigt, nach 12–24 Stunden seinen Höhepunkt erreicht und bis zu 10–14 Tage erhöht bleibt36, könnte unser entwickelter Dip-Strip-Assay möglicherweise zur Diagnose von AMI verwendet werden.

Die mögliche Kreuzreaktivität des entwickelten Assays wurde untersucht, um seine Spezifität in Gegenwart potenziell störender Substanzen im Serum zu bewerten. Die Tests wurden mit Albumin, Bilirubin und Cholesterin in Konzentrationen durchgeführt, die im normalen Bereich für Humanserum liegen (4000 mg/dl Albumin, 1 mg/dl Bilirubin und 200 mg/dl Cholesterin). Wie in Abb. 6 dargestellt, zeigten die Testergebnisse, dass die dunkelbraune Farbe an der Testlinie in Gegenwart von 100 ng/ml cTnI auftrat, jedoch nicht bei einer der anderen getesteten Substanzen. Darüber hinaus gibt es keine signifikanten Unterschiede in der Farbintensität der Testlinie interferenzhaltiger Proben im Vergleich zum Serum-Blindwert. Diese Ergebnisse zeigten, dass der entwickelte Dip-Strip-Immunoassay seine Spezifität für die cTnI-Bestimmung trotz der Anwesenheit von Albumin, Bilirubin und Cholesterin beibehielt. Bei der störenden Substanz kann Hämoglobin zu Störungen führen, wenn hämolysiertes Serum vorgelegt wird37,38. Die Ergebnisse der kardialen Troponin-I-Konzentration sollten daher bei leicht hämolysiertem Serum mit leicht erkennbarer rosa Farbe mit Vorsicht interpretiert werden, während mäßig oder stark hämolysiertes Serum verworfen werden sollte.

Balkendiagramm und Bilder des Kreuzreaktivitätstests nach Silberanreicherung zur Beurteilung der Farbintensität des B/T-Verhältnisses von Serumblindwert, cTnI, Albumin, Bilirubin und Cholesterin.

Um die Genauigkeit und Präzision des entwickelten Dip-Strip-Immunoassays zur cTnI-Bestimmung zu validieren, wurde der entwickelte Teststreifen zur Bestimmung von cTnI in einer Serumprobe verwendet. Die Seren wurden mit cTnI-Protein in den angegebenen Konzentrationen von 3, 11, 27 und 80 ng/ml versetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die analytische Wiederfindung und %RSD wurden im Bereich von 96,10–119,17 % bzw. 2,91–5,13 % erreicht. Dieser entwickelte Dip-Strip-Immunoassay ermöglichte somit den genauen und präzisen Nachweis von cTnI in Serumproben.

Für den Nachweis und die Quantifizierung von cTnI wurde ein einfacher und empfindlicher Sandwich-Immunoassay auf Dip-Strip-Basis in Verbindung mit silberverstärktem kolloidalem Gold entwickelt. Zur Signalverstärkung in den AuNPs des entwickelten Dip-Streifens wurde ein Silberverstärkungssystem eingesetzt. Die Ergebnisse waren mit bloßem Auge leicht zu erkennen (LOD 0,5 ng/ml). Darüber hinaus wurde ein Smartphone mit RGB-Farbauswahlanwendung aufgrund seiner Einfachheit, geringen Kosten und seines innovativen Ansatzes zur Quantifizierung der Ergebnisse bewertet. Mithilfe von Interpretationen basierend auf der RGB-Intensität wurde festgestellt, dass der LOD 0,12 ng/ml mit einer guten linearen Korrelation (R2 = 0,9952) im Bereich von 0,5 bis 50 ng/ml beträgt. Der entwickelte Assay zeigte ein ermutigendes Potenzial für den cTnI-Nachweis in menschlichem Serum. Es zeigte eine hervorragende Spezifität für den cTnI-Nachweis ohne Kreuzreaktivität mit wichtigen Plasmaproteinen. Daher ist dieser Ansatz für einen alternativen Test zur Analyse von cTnI bei Patienten mit Verdacht auf AMI sehr vielversprechend.

Ziegen-Anti-Maus-Immunglobulin G wurde von Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (West Grove, PA, USA) erhalten. Der monoklonale Antikörper gegen kardiales Troponin I (4T21cc–19C7cc) und der monoklonale Antikörper gegen kardiales Troponin I (4T21cc–560) wurden von HyTest Ltd. (Turku, Finnland) erworben. Der kardiale Troponin-IC-Komplex wurde von MyBioSource, Inc. (San Diego, CA, USA) erhalten. Albumin, Bilirubin, Cholesterin, Gold(III)-chlorid-Trihydrat (HAuCl4·3H2O), Humanserum, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), Silbernitrat und Tween 20 wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen. Rinderserumalbumin (BSA) wurde von Capricorn Scientific GmbH (Ebsdorfergrund, Deutschland) bezogen. Hydrochinon wurde von Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Tokio, Japan) gekauft. Zitronensäuremonohydrat und Natriumcitratdihydrat wurden von Bio Basic Inc. (Ontario, Kanada) bezogen. In den Experimenten wurden alle Chemikalien und Reagenzien in Analysequalität sowie Mill-Q-Wasser (18 MΩ-cm) verwendet.

Die AuNPs (20 nm) wurden unter Verwendung einer geringfügigen Modifikation eines zuvor beschriebenen Verfahrens synthetisiert39. Kurz gesagt, 100 ml 0,01 % HAuCl4, gelöst in Milli-Q-Wasser, wurden unter ständigem Rühren zum Kochen gebracht. Zwei ml 1 %iges Trinatriumcitrat wurden zugegeben und 5 Minuten lang gerührt (bis die rote Farbe erschien), dann wurde die Lösung unter kontinuierlichem Rühren auf Raumtemperatur abgekühlt. Schließlich wurden 20 nm AuNPs erhalten. Die AuNP-Lösung wurde zur weiteren Verwendung bei 4 °C in einer mit Folie abgedeckten Flasche aufbewahrt. Die synthetisierten AuNPs wurden durch UV-sichtbare Spektrometrie unter Verwendung eines NanoDrop 2000-Spektrophotometers (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) unter Verwendung eines JEM-2100-Elektronenmikroskops (JEOL Ltd., Tokio, Japan) charakterisiert dargestellt in Abb. 2b (i).

Die Anti-cTnI-Antikörper-konjugierten AuNPs wurden durch Mischen von 100 µL 175 µg/ml Anti-cTnI-Antikörper und 1 ml 20-nm-AuNPs bei pH 7 und anschließende Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Rühren hergestellt. Danach wurden der Lösung 100 µL 5 % BSA in 10 mM PBS pH 7,4 zugesetzt, um die unspezifische Bindung von AuNPs mit anderen Molekülen zu reduzieren. Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Mischung 45 Minuten lang bei 4 °C und 12.000 U/min zentrifugiert und anschließend der Überstand entfernt. Das Pellet wurde dann in 5 % BSA in 10 mM PBS, pH 7,4, auf ein Endvolumen von 100 µL resuspendiert. Diese gebrauchsfertige Anti-cTnI-Antikörper-konjugierte AuNP-Lösung wurde bei 4 °C gelagert. Anti-cTnI-Antikörper-konjugierte AuNPs wurden mit dem NanoDrop 2000-Spektrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) und dem JEM-2100-Elektronenmikroskop (JEOL Ltd., Tokio, Japan) charakterisiert, wie in Abb. 2b (ii) gezeigt.

Um die Nachweisempfindlichkeit zu erhöhen, wurde in dieser Studie eine Silberverstärkungsmethode eingesetzt. Die Silberverstärkungslösung wurde frisch hergestellt, indem 2 mg/ml Silbernitrat mit 5 mg/ml Hydrochinon in Citratpuffer pH 3,8 in einem Reagenzverhältnis von 1:1 (V:V) gemischt wurden.

Der entwickelte Teststreifen bestand aus drei Teilen, darunter einem Probenpad (Whatman FUSION 5), einem Nitrozellulosepad (Whatman AE99) und einem absorbierenden Pad (Whatman CF7), die nacheinander auf eine Plastikkarte (GE Healthcare, Pittsburgh, PA) geklebt wurden , USA), wie in Abb. 3a dargestellt. Um den Teststreifen für den cTnI-Nachweis vorzubereiten, wurden 1 µL 0,5 mg/ml Ziegen-Anti-Maus-Immunglobulin G und 1 µL 1 mg/ml Anti-cTnI-Antikörper auf dem Nitrozellulosepad an der Kontroll- bzw. Testlinie immobilisiert . Abschließend wurde der vorbereitete Teststreifen 2 Stunden lang getrocknet. (Der hergestellte Streifen hatte eine Breite von 4 mm.) Der gebrauchsfertige Teststreifen wurde versiegelt und bei 4 °C gelagert. Darüber hinaus war der Teststreifen über eine Lagerzeit von mindestens 3 Monaten stabil.

Das Testverfahren eines Tauchstreifens (basierend auf Sandwich-Immunoassay) zur cTnI-Bestimmung ist in Abb. 3b dargestellt. Sechzig µL Serumprobe oder cTnI-Standard wurden mit 7 µL Antikörper-konjugierten AuNPs (AuNP-Ab-Konjugat) gemischt und 45 Minuten lang in der Probenvertiefung inkubiert. Als nächstes wurde der Teststreifen in die Vertiefung getaucht. Nach 5 Minuten wurden 80 µL eines Laufpuffers (0,1 % Tween 20 in 10 mM PBS, pH 7,4) hinzugefügt, um Hintergrundgeräusche zu reduzieren. Anschließend wurden 80 µL der Silberverstärkungslösung hinzugefügt, um den Vorgang abzuschließen. Das Testergebnis wurde nach 15 Minuten durch bloßes Auge und Smartphone-Erkennung interpretiert. Ein negatives Ergebnis wurde dadurch angezeigt, dass vor bzw. nach der Verstärkung nur eine rote oder dunkelbraune Kontrolllinie vorhanden war. Im Falle eines positiven Ergebnisses erschienen sowohl Test- als auch Kontrolllinien, rot/rosa und dunkelbraun, jeweils vor und nach der Verstärkung. Die Intensität der Farbe an der Testlinie variierte direkt mit der cTnI-Konzentration. Die Konzentration der Probe konnte im Vergleich zum cTnI-Standard mit dem Auge abgeschätzt werden. Zur quantitativen Analyse wurde ein Bild von Testlinien mit einem Smartphone (Samsung S10) im Automatikmodus und ohne Blitz unter einem Kontrollleuchtkasten aufgenommen. Die mittleren Rot-Grün-Blau-Intensitätswerte (RGB) wurden mit einem Smartphone mit einer RGB-Farbauswahlanwendung analysiert. Dann wurde das Verhältnis der Hintergrundintensität pro Test (B/T) unter Verwendung der Gleichung berechnet: I (Intensität) = (R + G + B)/3. Der erhaltene Wert wurde verwendet, um die Konzentration von cTnI mit einer Kalibrierungskurve zu ermitteln.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Forschung wurde vom Royal Golden Jubilee (RGJ) Ph.D. finanziell unterstützt. Programm (Grant No. PHD/0062/2561), durch Thailand Research Fund (TRF) und den National Research Council of Thailand (NRCT). AA und OC danken dankbar für die Unterstützung des Forschungsprojekts durch den National Research Council of Thailand (NRCT): N41A640073.

Abteilung für Klinische Chemie, Fakultät für Medizintechnik, Mahidol University, 999 Phutthamonthon 4 Road, Salaya, Nakhon Pathom, 73170, Thailand

Napakporn Poosinuntakul, Theerawut Chanmee, Sureerut Porntadavity und Amara Apilux

Kompetenzzentrum für Elektrochemie und optische Spektroskopie, Fachbereich Chemie, Fakultät für Naturwissenschaften, Chulalongkorn-Universität, Bangkok, 10330, Thailand

Orawon Chailapakul

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NP und AA haben diese Forschung konzipiert; NP und AA haben die Experimente entworfen; NP führte die Experimente durch; NP und AA analysierten und interpretierten die Daten formal; Von NP und AA vorbereitete Forschungsmethodik; NP entwarf und schrieb das Manuskript und bereitete alle Abbildungen und Tabellen vor; NP, TC und AA untersuchten das Manuskript; SP, OC und AA überwachten diese Forschung; TC, SP und AA validierten das Manuskript; TC, SP, OC und AA haben das Manuskript überprüft und bearbeitet. Alle Autoren haben die eingereichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Korrespondenz mit Amara Apilux.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Poosinuntakul, N., Chanmee, T., Porntadavity, S. et al. Silberverstärkter kolloidaler Gold-Tauchstreifen-Immunoassay mit integrierter Smartphone-basierter Kolorimetrie zum empfindlichen Nachweis des Herzmarkers Troponin I. Sci Rep 12, 19866 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24458-1

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Eingegangen: 31. August 2022

Angenommen: 15. November 2022

Veröffentlicht: 18. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-24458-1

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