Neuartiges Modell der Kortikalis

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 7809 (2023) Diesen Artikel zitieren

1316 Zugriffe

5 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Menschliche kortikale Organoide (hCOs), die aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) gewonnen werden, bieten eine Plattform zur Untersuchung von Mechanismen der menschlichen Gehirnentwicklung und von Krankheiten in komplexen dreidimensionalen Geweben. Bei den derzeitigen hCO-Entwicklungsmethoden fehlen jedoch wichtige nicht-neurale Gewebe, wie etwa die umgebende Hirnhautschicht, die sich nachweislich für die normale Kortikogenese und Gehirnentwicklung als wesentlich erwiesen haben. Hier erzeugten wir zunächst hCOs aus einer einzelnen Rosette, um bis zum 5. Tag homogenere Organoide mit einer einheitlichen Größe von etwa 250 µm zu erzeugen. Anschließend nutzten wir ein 3D-Co-Kultursystem, um Gehirnorganoide mit einer dünnen Schicht meningealer Zellen zu verkapseln Frühstadien der kortikalen Entwicklung. Eine Immunfärbungsanalyse wurde durchgeführt, um verschiedene Marker der kortikalen Schicht in verschiedenen Entwicklungsstadien anzuzeigen. Die Echtzeitüberwachung der Organoidentwicklung mit IncuCyte zeigte eine verbesserte Morphologie und eine erhöhte Wachstumsrate im Laufe der Zeit. Wir fanden heraus, dass meningeal eingekapselte Organoide eine bessere laminare Organisation zeigten, indem sie eine höhere REELIN-Expression durch Cajal-Retzius-Neuronen zeigten. Das Vorhandensein meningealer Zellen führte zu einer stärkeren Expansion der TBR2-Intermediator-Vorläuferzellen (IPCs), der tiefen kortikalen Schicht (CTIP2) und der oberen kortikalen Schicht (BRN2). Schließlich steigerten meningeal eingekapselte Organoide die Bildung äußerer radialer Gliazellen und Astrozyten, was durch eine stärkere Expression von HOPX- bzw. GFAP-Markern veranschaulicht wurde. Diese Studie stellt eine neuartige 3D-Co-Kulturplattform vor, um die kortikale Gehirnstruktur in vivo genauer nachzuahmen und es uns zu ermöglichen, die Mechanismen besser zu untersuchen, die den neurologischen Entwicklungsstörungen während der Embryonalentwicklung zugrunde liegen.

Das menschliche Gehirn besteht aus mehreren Zelltypen, darunter Neuronen, Astrozyten, Mikroglia und Oligodendrozyten. Aktuelle zerebrale Organoidsysteme, die aus pluripotenten Stammzellen abgeleitet sind, stellen wichtige In-vitro-Modelle zur Rekapitulation des sich entwickelnden menschlichen Kortex dar und ermöglichen es uns, die Gehirnentwicklung sowohl im gesunden als auch im kranken Zustand zu untersuchen1,2,3,4,5. Aktuelle In-vitro-Modellsysteme unterliegen jedoch mehreren Einschränkungen, die ihre Reproduzierbarkeit und Anwendbarkeit beeinträchtigen können. Eine dieser Einschränkungen ist die Variabilität von Charge zu Charge, die aufgrund von Unterschieden in der Ausgangszellpopulation, den Kulturbedingungen und den Selbstorganisationseigenschaften der Zellen entstehen kann6,7. Die Beseitigung dieser Einschränkung ist von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung von Organoiden als zuverlässige Modelle für die Untersuchung des menschlichen Gehirns. Die Einführung eines auf einer einzelnen Rosette basierenden Ansatzes hat es uns ermöglicht, konsistentere und reproduzierbarere Organoide zu erzeugen, was zu homogeneren und definierteren Organoiden führt, die Aspekte der frühen Gehirnentwicklung besser nachahmen.

Eine weitere Einschränkung des Organoidmodells ist das Fehlen einer vollständigen Zellvielfalt im menschlichen Gehirn8. Obwohl Organoide einige der im menschlichen Gehirn vorkommenden Zelltypen erzeugen können, sind nicht alle Zelltypen vertreten. Dies kann die ordnungsgemäße Signalübertragung einschränken, die erforderlich ist, um die Entwicklungs- und Architekturaspekte des menschlichen Gehirns mit angemessener Komplexität vollständig nachzubilden. Um diese Einschränkung zu überwinden, besteht unser Ansatz darin, Meningealzellen als wichtigen Zelltyp einzubeziehen, der eine entscheidende Rolle bei der Gehirnentwicklung spielt. Meningen, eine Art nicht-neuronale Gehirnzellen, sind bereits in den sehr frühen embryonalen Stadien der kortikalen Entwicklung vorhanden und scheinen für die normale Kortikogenese und die Bildung von Gehirnstrukturen notwendig zu sein9,10,11,12. Jüngste Studien haben eine nicht-parenchymale Nische der NSC-Population innerhalb der Hirnhäute identifiziert, die neurale Vorläufermarker exprimiert, die in vitro und in vivo neue Neuronen erzeugen können13,14. Während der Gehirnentwicklung spielen die Hirnhäute eine entscheidende Rolle bei der hCO-Entwicklung, indem sie verschiedene morphogene Faktoren freisetzen, die für die Kortikogenese notwendig sind. In-vitro-Studien haben gezeigt, dass meningeale Zellen FGF-215, IGF216,17, CXCL1218,19,20,21 und Retinsäure22,23,24 absondern können, die für eine ordnungsgemäße Kortikogenese unerlässlich sind. In-vivo-Studien haben auch gezeigt, dass Hirnhäute eine Vielzahl von Signalmolekülen absondern, darunter Sonic Hedgehog (Shh), das eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung des ventralen Vorderhirns spielt, und die Familie der Knochenmorphogenetischen Proteine (BMP), die die dorsal-ventrale Funktion regulieren Strukturierung des Neuralrohrs25. Zu den weiteren von der Hirnhaut ausgeschiedenen Faktoren gehören Mitglieder der Familie der Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGF), Wnt und Notch, die an der Regulierung der Zellproliferation, -differenzierung und des Überlebens in verschiedenen Entwicklungsprozessen, einschließlich der Neurogenese, beteiligt sind1,26,27,28, 29. Es wird vermutet, dass mit Laminin angereicherte Bereiche in den Hirnhäuten für die Regulierung der Freisetzung dieser Faktoren wesentlich sind. Daher scheint das Vorhandensein von Hirnhäuten für die Entwicklung von Gehirnorganoiden von entscheidender Bedeutung zu sein30.

Es wurde bereits gezeigt, dass eine Kokulturmethode zur Kombination verschiedener Hirnregionen innerhalb eines einzigen organoiden Gewebes komplexe Interaktionen zwischen verschiedenen Regionen modellieren und neurologische Entwicklungsdefekte untersuchen kann31. Mithilfe fluoreszierender Reporter wurde beispielsweise gezeigt, dass CXCR4-abhängige GABAerge Interneurone vom ventralen zum dorsalen Vorderhirn wandern. Dies wurde zur Untersuchung neurologischer Erkrankungen und zum Testen potenzieller Therapien verwendet32. Allerdings hat niemand die Verwendung von Hirnhautzellen in Kombination mit Gehirnorganoiden untersucht, um die Wirkung dieser Zellen auf die Entwicklung von Gehirnorganoiden zu untersuchen. In dieser Studie nutzten wir ein Co-Kultursystem, um kortikale Gehirnorganoide in Kombination mit Meningealzellen zu erzeugen, und untersuchten die Rolle von Meningealzellen beim Fortschreiten der laminaren Organisation der frühen Gehirnentwicklung in einem Modellsystem.

In dieser Studie wurden drei Zelllinien induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) verwendet. CC1 und CHD2 wurden aus Hautbiopsien verschiedener Personen gewonnen und PCDH19-WT (im Handel erhältliche Vorhautfibroblasten) wurden zuvor von Labormitarbeitern erzeugt und20,21. Alle iPSC-Zelllinien wurden mit vorheriger Genehmigung des Institutional Review Board of Michigan Medicine durchgeführt. iPSCs wurden auf einer 1:200-Verdünnung einer mit Geltrex beschichteten (Fisher Scientific) 30-mm-Schale und in TeSR™-E8™ (StemCell Technologies) gezüchtet. Die Zellen wurden routinemäßig einmal pro Woche passagiert und vor der 35. Passagenummer für alle Experimente verwendet.

Menschliche Meningealzellen stammen direkt aus menschlichen Leptomeningen und sind im Handel erhältlich (ScienCell-Katalog Nr. 1400). Leptomeningeale Zellen wurden bei der ersten Passage kryokonserviert und gefroren geliefert. Jedes Fläschchen enthält > 5 × 105 Zellen in 1 ml Volumen. HMC wurden durch Immunfluoreszenz charakterisiert; Sie sind alle positiv für Fibronektin und negativ für GFAP und α-Glattmuskel-Aktin. 5 × 105 Zellen/ml wurden in Passage Null gekauft (1 ml/Fläschchen), in Meningealzellmedium MenCM expandiert, bestehend aus 500 ml Basalmedium, 10 ml fötalem Rinderserum und 5 ml Meningealzellwachstumszusatz und 5 ml Penicillin/Streptomycin-Medium (ScienCell-Katalog Nr. 1404) und wurden bis zur dritten Passage verwendet.

Zur Erzeugung kortikaler Organoide wurden undifferenzierte iPSC mit einer Konfluenz von 70–80 % verwendet. Um mit der Plattenvorbereitung zu beginnen, wurden 30 µl 100 % konzentriertes Geltrex in die Mitte jeder Vertiefung einer Platte mit 12 Vertiefungen getropft und 20 Minuten lang im Inkubator belassen, um sich als Blase zu verfestigen. Anschließend wurde Geltrex, verdünnt in DMEM/F12 (1:100), verwendet, um den Rest der Oberfläche um die Geltrex-Blase herum zu beschichten. iPSC-Zellen wurden dann von Accutase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) auf Geltrex-beschichteten Platten dissoziiert, und 8 × 10 Zellen in TeSRTM-E8TM-Medium wurden um die Blase herum und nicht direkt in die Blase gegeben und 24 Stunden lang im Inkubator belassen siedeln. Dann wurde das Zellmedium wie in 22 beschrieben mit einigen Modifikationen in Neurales Induktionsmedium 3N Vitamin A mit 1 µM Dorsomorphin und 10 µM SB431542 geändert. (Details zum 3N-Medium finden Sie in der Zusatzdatentabelle 1). Das Medium wurde jeden Tag durch 2 ml frisches Medium ausgetauscht. Nach 24 Stunden begannen einzelne Rosetten in der Nähe der Geltrex-Blase zu entstehen, wobei beobachtet wurde, dass die Größe der Rosetten jeden Tag zunahm. Die einzelnen Rosetten, die der Geltrex-Feststoffblase am nächsten waren, waren erkennbar größer als andere Rosetten. Nach 5 Tagen wurden diese größeren Einzelrosetten manuell entnommen und einzeln in einzelne Vertiefungen einer 96-Well-Rundbodenplatte mit neuronalem Induktionsmedium aus 3N + Vitamin A überführt. Das Medium wurde 3 Tage lang jeden zweiten Tag aufgefrischt.

Am vierten Tag nach der Zellpassage wurden meningeale Zellen mit Accutase (Innovative Cell Technologies) abgelöst und in Suspension zu einzelnen Rosetten hinzugefügt (iPSC-Zelltag 8?). Um die optimale Anzahl meningealer Zellen für die gemeinsame Inkubation mit iPSC-Zellen zu bestimmen, erhielt die Hälfte der Vertiefungen 8 × 103 meningeale Zellen und die andere Hälfte ließ als Kontrolle keine meningealen Zellen übrig. Das Medium bestand zu 50 % aus Meningealzellmedium und zu 50 % aus 3N + Vitamin A. Meningeales Medium, das 2 % FBS enthielt und jeweils zur Hälfte mit 3 N versetzt war, senkte die FBS-Konzentration auf 1 %. Dieses FBS-haltige Medium wurde nur 3 Tage lang (zwischen den Tagen 9 und 11) zugegeben und die gleichen Bedingungen wurden als Kontrollbedingungen berücksichtigt. Am 9. Tag wurde die Co-Kultur von Organoiden und Meningealzellen dann zur Inkubation und Bildgebung in ein IncuCyte Zoom-System (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, USA) gegeben. Die Bildgebung erfolgte in den ersten drei Tagen (Tage 9–11) alle drei Stunden und dann bis zum 42. Tag alle acht Stunden. Ab Tag 12 wurde das Medium einmal täglich mit 3N + Vitamin A + 10 ng/ml BDNF + aufgefrischt 10 ng/ml NT3. Am Ende des 42. Tages wurden die Organoide mit dem gleichen Medium auf 48-Well-Rundbodenplatten übertragen und aufgrund der Einschränkungen der IncuCyte-Bildgröße ohne IncuCyte in den Inkubator gestellt. Organoide wurden an den Tagen 42, 56 und 70 zur weiteren bildgebenden Analyse fixiert.

Organoide wurden in kaltem 4 % Paraformaldehyd (PFA) in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) 20 Minuten lang fixiert und dann zweimal 5 Minuten lang in PBS gewaschen. Fixierte Organoide wurden dann über Nacht bei 4 °C in 30 % Saccharose in PBS inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Organoide aus der Saccharose entnommen und in Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature Compound (OCT, Sakura) eingebettet und eingefroren, bei 20 µm Dicke kryogeschnitten und auf Superfrost Plus-Objektträgern (Fisher Scientific) gesammelt. Die Objektträger wurden 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 0,1 % Triton-X100 (Sigma) gespült, um die Durchlässigkeit zu erhöhen, und die Schnitte wurden dann in ICC-Blockierungspuffer (PBS mit 0,05 % Tween-20, 5 % normales Ziegenserum und 1 % BSA) inkubiert ) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Anschließend wurden die Schnitte über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern inkubiert. Antikörperspezies, Verdünnung, Name des Lieferanten und Katalognummern sind in Tabelle 2 mit ergänzenden Daten enthalten. Die Zellen wurden dann dreimal für jeweils 10 Minuten mit PBST (0, 05 % Tween 20 in PBS) gewaschen und anschließend mit in der Blockierungslösung verdünnten Sekundärantikörpern inkubiert 90 Minuten bei Raumtemperatur. Die Objektträger wurden dann einmal 10 Minuten lang mit PBST gewaschen und 5 Minuten lang in PBS mit BisBenzimid inkubiert, um die Kerne zu markieren. Abschließend wurden die Objektträger dreimal jeweils 10 Minuten lang in PBST gewaschen und dann in Glycergel-Eindeckmedium montiert, mit konfokaler Mikroskopie abgebildet (unten beschrieben) und über Nacht zur weiteren Bildgebung trocknen gelassen.

Das IncuCyte Zoom-System ist eine Plattform, die die Echtzeitbildgebung von Sphäroiden mithilfe von markierungsfreier oder zweifarbiger Fluoreszenz ermöglicht, um die Morphologie zu beobachten und das Sphäroidwachstum im Laufe der Zeit zu untersuchen. Dabei überwachte das System das Rosettenwachstum. Die Morphologie und der durchschnittliche Querschnitt jedes Organoids zu verschiedenen Zeitpunkten der Differenzierung wurden mithilfe der IncuCyte Zoom-Systemsoftware beobachtet und analysiert. Alle IncuCyte-Daten wurden aus fünf unabhängigen Experimenten mit mindestens sechs Proben in jeder Bedingung erhalten.

Die Schnitte wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop Leica TCS SP5 aufrecht + invertiert (Leica Microsystems, Mannheim, Deutschland) unter Verwendung eines sequentiellen Scanverfahrens untersucht. Konfokale Bilder wurden mit 10-fach- und 20-fach-Objektiven aufgenommen und die Daten von ImageJ analysiert. Konfokale Bilder wurden mit den konfokalen Mikroskopen Zeiss LSM 700, LSM 780 oder Zeiss LSM 800 aufgenommen, die mit einem motorisierten Tisch und der Software Zen Black oder Blue Edition ausgestattet waren. Gekachelte Bilder wurden mit dem Zen Tiles and Positions-Modul zusammengestellt. Für die Hellfeld-Bildgebung wurde ein EVOS-Mikroskop (Advanced Microscopy Group) verwendet. Alle Bilder wurden in Adobe Photoshop zusammengestellt, wobei die Bildanpassungen auf das gesamte Bild angewendet und auf Helligkeit, Kontrast und Pegel beschränkt wurden. Die in den Abbildungen als Vergleich dargestellten Bilder wurden mit identischen Einstellungen parallel aufgenommen und verarbeitet.

Für alle statistischen Analysen wurde Prism Version 8.4.2 (GraphPad) verwendet. Für alle anderen Studien wurde der signifikante Unterschied zwischen den Testgruppen mithilfe eines zweiseitigen, ungepaarten Student-t-Tests bewertet. Ein AP-Wert < 0,05 wurde als statistisch unterschiedlich angesehen. Diese Experimente wurden viermal mit drei verschiedenen Zelllinien wiederholt. (CC1 n = 2, PCDH19 n = 1 & CDH2 n = 1). Für alle wurden Immunfärbungen durchgeführt. Obwohl es bei verschiedenen Zelllinien geringfügige Unterschiede in der Organoidgröße gab, wie in den Zusatzdaten S1 gezeigt, zeigten alle Zelllinien den gleichen Trend in Bezug auf Differenzierungsstadien und unterschiedliche Marker. In dieser Studie wurden Daten von allen drei Zelllinien gesammelt und verwendet. Aus jedem Experiment wurden mindestens n = 4 Organoide ausgewählt (n = insgesamt 4 biologische Replikate und n = 12 Anzahl der Organoide, die in den Abbildungslegenden ausführlich erwähnt werden). Somit stellt jedes Diagramm den Durchschnitt und die Standardabweichung nach der Analyse von 18 einzelnen Organoiden dar.

Alle Experimente und Methoden wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Von allen Probanden wurde eine Einverständniserklärung eingeholt und alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften von REC durchgeführt.

Wir haben eine Methode entwickelt, um aus allen drei iPSCs (CC1, PCDH19-WT, CHD2) einzelne neuronale Rosettenstrukturen zu erzeugen, um die kortikale Gehirnregion zu replizieren. Neuralen Rosetten allein fehlt die Fähigkeit, sich räumlich in verschiedene neuronale Schichten zu organisieren, sie sind jedoch der Ausgangspunkt für 3D-Gehirnorganoide23 und können nützliche Stellvertreter für die Identifizierung potenziell unterstützender Zellen für Co-Kultursysteme sein. Für verschiedene Wachstumsfaktoren und Inhibitoren haben wir die von Yichen Shi33 beschriebenen Methoden modifiziert. Kurz gesagt, iPSCs wurden mit dualer SMAD-Hemmung (Dorsomorphin und SB431542) behandelt, einer bewährten Methode zur Gewinnung neuronaler Vorläuferzellen aus iPSCs. Ein schematisches Diagramm der Kulturmethode ist in (Abb. 1a) dargestellt. Ab dem zweiten Tag begannen sich einzelne Rosetten nahe der Grenzfläche zwischen der festen Geltrex-Blase und dem verdünnten Geltrex/DMEM zu erheben (Abb. 1b) und wuchsen im Laufe der Zeit. Die Daten wurden aus vier unabhängigen Experimenten mit GFP-markierten CC1-Zellen entnommen (Abb. 1d) und die Gesamtzahl von n = 18 Rosetten analysiert. Der mittlere Rosettendurchmesser der CC1-Zelllinie betrug am zweiten Tag 170 ± 20 µm und stieg am fünften Tag auf > 250 µm (Abb. 1c). Die morphologische Beobachtung zeigte klar definierte Lumenstrukturen in der Mitte der Rosetten (Abb. 1c, g). Insgesamt hatten einzelne Rosetten vom 3. bis zum 5. Tag eine mehr als 1,8-fache Größenzunahme, was sich als signifikant erwies (p < 0005). (Abb. 1f). Diese Daten wurden mit zwei zusätzlichen iPSC-Linien (PCDH19 und CHD2) bestätigt. Die Daten dieser beiden Linien sind in (Ergänzende Abbildung S1) dargestellt. Um die Entstehung neuronaler Rosetten zu charakterisieren, führten wir eine Zeitverlaufsanalyse verschiedener Marker neuronaler Stamm-/Vorläuferzellen (NPC) durch. Nur zwei Tage nach der dualen SMAD-Induktion zeigten iPSC-abgeleitete Rosetten die Expression der neuroektodermalen Marker PAX6 und NESTIN NPCs sowie des apikalen Membranmarkers PKC-Z (Abb. 1e1). Am fünften Tag wurde eine gut definierte polarisierte neuroepitheliale Struktur mit ausgeprägter Expression von PAX6- und NESTIN-NPCs in der ventrikulären Zone (VZ) und einer starken Expression anhaftender Verbindungsmarker von N-Cadherin und PKC-Z in der apikalen Region beobachtet, die dieser ähnelte Neuralrohre (Abb. 1e2, g).

Erzeugung und Charakterisierung einzelner neuronaler Rosetten. (a) Schematische Darstellung der Kulturmethode zur Erzeugung menschlicher kortikaler Organoide, (b) Entstehung und Wachstum einzelner Rosetten über fünf Tage an der Grenzfläche zwischen der Blase und verdünntem Geltrex, (c) repräsentatives Bild einer einzelnen Rosette zeigt die durchschnittliche Größe jeder Rosette einzelne Rosette, die etwa 255 µm groß ist, (d) repräsentatives Bild von GFP-markierten Rosetten, (f) quantitative Analyse des einzelnen Rosettenwachstums in Mikrometern vom zweiten bis fünften Tag. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die statistische Analyse zeigte einen signifikanten Unterschied in der Größe von Tag 3 bis 4 und von Tag 4 bis 5 (****p < 001, n = 4 unabhängige Experimente und n = 4 Rosetten wurden aus jedem Experiment ausgewählt), (e1, e2) Immunfärbung von Einzelne Rosetten an Tag 2 und Tag 5 für NPCs (PAX6 und NETIN) und apikale Membran (NCAD/APKC), (g) Einzelne Rosetten exprimieren PAX6 und N-Cadherin, Maßstab 100 µm, und (h) repräsentative IncuCyte Zoom-Bilder von Organoidwachstum in 96-Well-Platten zu verschiedenen Zeitpunkten von Tag 9 bis Tag 22. (i) Quantifizierung der Größe einzelner Rosetten, nachdem sich die Rosetten an ihre dreidimensionale Umgebung gewöhnt haben, beginnend am Tag 9 (n = 3 unabhängige Experimente aus CC1-Zelllinien und n = insgesamt 9 Organoide). Fehlerbalken ± SD. Maßstabsbalken 400 µm.

Einzelne Rosetten wurden am 5. Tag auf 96-Well-Rundbodenplatten übertragen und morphologische Veränderungen über 14 Tage mit dem IncuCyte Zoom-System analysiert. Von jeder Rosette wurden alle 12 Stunden Bilder aufgenommen. Rosetten zeigten im Laufe der Zeit ein Größenwachstum, wobei sich die Querschnittsfläche der Rosetten vom 9. bis zum 24. Tag nahezu vervierfachte (Abb. 1h). Die Quantifizierung der Größe einzelner Rosetten, nachdem sich die Rosetten an ihre dreidimensionale Umgebung gewöhnt hatten, beginnend am 9. Tag, zeigte eine Vergrößerung des Größendurchmessers um > 800 µm bis zum 24. Tag (Abb. 1i). Unser Ansatz, kortikale Organoide aus einzelnen Rosetten zu erzeugen, scheint schnell homogene Organoide zu erzeugen und gut definierte organisierte neuroepitheliale Rosetten zu ergeben.

Um das Protokoll weiter zu bewerten, untersuchten wir, ob unsere Methode verschiedene kortikale Regionen erzeugen und den menschlichen fetalen Kortex rekapitulieren kann (Abb. 2b). Wir führten zu verschiedenen Zeitpunkten eine immunhistochemische Analyse spezifischer kortikaler Marker durch. Am 21. Tag beobachteten wir eine deutliche Expression der Neuro-Vorläufermarker PAX6 und BLBP, des Vorderhirnmarkers FOXG1 und das Auftreten des neuronalen Markers TUJ1 (Abb. 2a). Frühere Studien haben gezeigt, dass TBR2 ein entscheidender Faktor für die Spezifizierung intermediärer basaler Vorläuferzellen (IPCs) in einem sich entwickelnden Kortex ist. Es ist bekannt, dass TBR2 die Morphogenese jeder kortikalen Schicht reguliert34,35,36. Am 42. Tag trennten sich die Zellen innerhalb des Organoids in VZ in verschiedene PAX6-Vorläufer mit prominenten TBR2-IPCs in der subventrikulären Zone (SVZ) (Abb. 2c). Am Tag 42 wurden außerdem deutliche Expressionen des Vorderhirnmarkers FOXG1 und des neuronalen Markers TUJ1 beobachtet (Abb. 2d). Darüber hinaus begann die MAP2-Expression, ein Indikator für die Neuronenpopulation, am 42. Tag und stieg bis zum 70. Tag signifikant an (P < 0,005) (Abb. 2e, f).

Immunfärbung für regionsspezifische Marker und neuronale Zellidentitäten. (a) Einzelne Rosetten, die am 21. Tag immungetestet wurden, zeigten die Expression von Markern für allgemeine radiale Glia (RG) (PAX6 und BLBP) sowie des Vorderhirnmarkers FOXG1 und des neuronalen Markers TUJ1. (b) Schematischer Ausdruck verschiedener Gehirnregionen. (c) Die Immunfärbung von Organoiden am Tag 42 zeigte eine klare Expression von RG (PAX6) in VZ und IPC (TBR2) in iSVZ. (d) Vorderhirnmarker FOXG1 und neuronaler Marker TUJ1, identifiziert in der VZ am Tag 42. (e) Zerebrale Organoide wurden am Tag 42 (W6) und 70 (W10) gemeinsam auf die neuronalen Marker MAP2 und PAX 6 angefärbt. (f) Die Quantifizierung der MAP2-Expression zeigte einen signifikanten Unterschied zwischen W10 und W8 (P < 0,005). (g) Zerebrale Organoide wurden gleichzeitig auf neuroepithelialen Marker (NESTIN) und äußeren RG-Marker (HOPX) angefärbt. (h) Die Quantifizierung der relativen Dicke von HOPX zeigte einen signifikanten Unterschied zwischen drei verschiedenen Zeitpunkten, W6, W8 und W10 (P < 0,005). (i) Gehirnorganoide wurden für den Neuronenmarker der unteren Schicht (CTIP2) und die äußere Schicht gemeinsam gefärbt Der Neuronenmarker (SATB2) an den Tagen 42, 56 und 70 (j, k) zeigte eine statistische Quantifizierung der relativen Dicke jeder Schicht zwischen drei verschiedenen Zeitpunkten, W6, W8 und W10 (P < 0,005). (n = 4 biologische Replikate insgesamt, n = 2 CC1, n = 1 PCDH19 und n = 1 CHD2, n = 12 Gesamtzahl der Organoide wurden analysiert). Fehlerbalken ± SD. Der Maßstabsbalken beträgt für alle Figuren 100 µm.

Wir haben die Expression von HOPX in unserem Zellkultursystem weiter untersucht. Beim Menschen ist SVZ, ein wichtiger Faktor für das neokortikale Wachstum des Menschen, in innere und äußere Abschnitte unterteilt, die als iSVZ bzw. oSVZ bezeichnet werden37. Jüngste Studien haben gezeigt, dass das Vorhandensein äußerer radialer Gliazellen (oRGC) für die Bildung der meisten kortikalen Neuronen in der oSVZ-Schicht verantwortlich ist, ähnlich dem sich entwickelnden menschlichen Kortex in den Schwangerschaftswochen 15–2038. HOPX ist einer der wichtigen charakteristischen Marker von oRGCs4,39. Am 42. Tag stellten wir eine sehr geringe HOPX-Expression fest, am 56. Tag wurde jedoch ein deutliches Auftreten von HOPX sowohl in der ventrikulären Zone (VZ) als auch im SVZ festgestellt. Bis zum 70. Tag war die HOPX-Expression signifikant erweitert (P < 0,005) und wurde stärker in der äußeren subventrikulären Zone (oSVZ-ähnliche Region) nachgewiesen, die von der inneren SVZ-Region (iSVZ) getrennt zu sein schien (Abb. 2g, h). Darüber hinaus gibt es am Tag 42 eine deutliche Expression von Marker-CTIP2-Neuronen der unteren Schicht, die über dem VZ und SVZ gebildet werden und der Präplatte (PP) ähneln, wobei die Expression vom Tag 56 (W8) bis zum Tag 70 (W10) signifikant zunahm (p < 0,005). ) (Abb. 2g). Schließlich trat der Oberschichtmarker SATB2 um den 42. Tag herum auf und nahm zwischen W8 und W10 signifikant zu (p < 0,005) (Abb. 2g). Zusätzliche verkleinerte Bilder ganzer menschlicher kortikaler Organoide (hCOs) für alle Marker sind in den ergänzenden Abbildungen dargestellt. S2 und S3. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass unser aus einzelnen Rosetten erzeugtes Organoidsystem die menschliche kortikale Entwicklung und die strukturierte Expression entscheidender menschlicher Entwicklungsmarker in vivo nachahmt.

Um die In-vitro-Bildung menschlicher kortikaler Organoide besser nachzuahmen, verwendeten wir außerdem menschliche Hirnhautzellen in Co-Kultur mit unserer Einzelrosettenbildungsmethode, um die Wirkung nicht-neuronaler Zellen bei der Unterstützung der Entwicklung des menschlichen Gehirns zu untersuchen. Für dieses Experiment wurden menschliche Leptomeninges-Meningealzellen verwendet. Es hat sich gezeigt, dass meningeale Zellen die Quelle von Entwicklungssignalen sind, die die kortikale Differenzierung und Reifung regulieren14. Es hat sich auch gezeigt, dass Signale aus verschiedenen Hirnhautschichten entscheidend für die ordnungsgemäße Bildung verschiedener Gehirnregionen sind40,41,42. Beispielsweise regulieren neurogene Signale wie Retinsäure aus der mittleren Meningealschicht die Bildung kortikaler Neuronen22. Wir wollten herausfinden, ob die Co-Kultur meningealer Zellen und das Vorhandensein von Leitmerkmalen dieser Zellen ein besseres Gerüst für die RG-Migration bieten und die Reifung des neuralen Organoids in separate diskrete Schichten fördern können. Zu diesem Zweck fügten wir am 9. Tag einzelne meningeale Zellen (~ 8000) zu isolierten Einzelrosetten in Platten mit rundem Boden und 96 Vertiefungen hinzu und überwachten deren Anheftung nach 2, 3 und 6 Stunden. Intervalle durch IncuCyte Zoom. Es sollte erwähnt werden, dass zunächst unterschiedliche Meningealzellzahlen untersucht wurden, um die optimale Zellzahl für diese Experimente zu definieren, und es wurde gezeigt, dass die Zugabe weiterer Zellen (16.000, 32.000 und 100.000 Meningealzellen) zu kleineren Rosetten führte, möglicherweise aufgrund der weniger Platz für das Wachstum von Organoiden (Ergänzende Abbildung S4a, b). Daher wurden 8000 Meningealzellen als optimale Zellzahl für die Co-Kultivierung mit Organoiden ausgewählt. Ein schematisches Diagramm des experimentellen Ablaufs ist in (Abb. 3a) dargestellt. Wir haben beobachtet, dass sich die meisten Meningealzellen in den ersten 24 Stunden an den einzelnen Rosetten festsetzen und diese bedecken (Abb. 3b1) und (Ergänzungsvideo 1). Der Kontrollzustand ohne Meningealzellen ist in Abb. 3b2 dargestellt. Visuelle Beobachtungen über 12 Tage zeigten deutlich, dass hCOs in Gegenwart von Meningealzellen, die wir „hCOMs“ nannten, im Vergleich zu hCOs eine besser definierte und rundere Kugelform aufwiesen (Abb. 3d) und (ergänzende Abb. S5). Darüber hinaus zeigte der Vergleich der beiden Bedingungen bei der Echtzeitüberwachung der einzelnen Organoide, dass bei hCOs im Vergleich zu hCOMs mehr Ablagerungen vom Rand der Organoide in das Medium freigesetzt wurden (rote Pfeile, Abb. 3b2). Durch Medienwechsel wurden die Trümmer abgewaschen. Darüber hinaus zeigte eine weitere Quantifizierungsanalyse mit der IncuCyte Zoom-Software, dass die Größe des Organoids über 21 Tage bei hCOMs im Vergleich zu Kontroll-hCOs deutlich zunahm (> 1,5-fache Veränderung) (Abb. 3c). Daten aus vier separaten Experimenten und einer Gesamtzahl von 18 Organoiden für die CC1-Zelllinie wurden analysiert und die Ergebnisse unter Verwendung von zwei zusätzlichen Zelllinien (PCDH19 und CHD2) in der ergänzenden Abbildung S6 repliziert. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass unser neuartiges Co-Kultursystem, das menschliche iPSCs und meningeale Zellen zusammen verwendet, die Morphologie und den Phänotyp der kortikalen Organoidbildung effizient verbessern und deren Wachstum in einem bestimmten Zeitverlauf steigern kann.

3D-Co-Kultursystem zur Erzeugung menschlicher Gehirnorganoide. (a) Das Schema zeigt die Hauptschritte der Erzeugung menschlicher kortikaler Organoide (hCO) aus iPSCs und der Kokultivierung mit meningealen Zellen ab Tag 9. (b1,b2) Repräsentative Bilder des Wachstums von Organoiden in IncuCyte Zoom mit 6 Bildern am Tag von Kokultur (Tag 9) und weitere Bilder am 18. und 21. Tag sowie repräsentative Bilder von hCO ohne meningeale Zellen. (c) Das Größenwachstum von Organoiden mithilfe der Quantifizierungssoftware IncuCyte Zoom zeigte einen bemerkenswerten Unterschied im Wachstum von Organoiden zwischen Tag 5 und 23. (d) Repräsentatives Bild zur Darstellung der Morphologie von hCOMs vs. hCOs unter Verwendung eines Hellfeldmikroskops, Maßstabsleiste 400 µm (n = 4 biologische Replikate insgesamt, n = 2 CC1, n = 1 PCDH19 und n = 1 CHD2, n = 12 Anzahl). Organoide wurden analysiert). Rote Pfeile kennzeichnen Ablagerungen, die beim Medienwechsel weggespült werden. Der Maßstabsbalken beträgt 400 µm für Hellfeldbilder.

Um kortikale Organoide in hCOs mit hCOMs weiter zu vergleichen, führten wir zu unterschiedlichen Zeitpunkten eine Expressionsanalyse von Markern für verschiedene neuronale Subtypen durch. Am Ende der Wochen 6 und 10 beobachteten wir, dass in hCOMs im Vergleich zu hCOs mehr Neuronen den tiefschichtigen kortikalen Neuronenmarker CTIP2 in einem größeren Bereich exprimierten (Abb. 3a), und Quantifizierungsmessungen zeigten, dass dieser Unterschied nach 10 Wochen signifikant war (Abb . 4b). Am Ende der sechsten Woche beobachteten wir auch gut definierte VZ-ähnliche Strukturen mit gepackten PAX6-NPCs in der Nähe des Lumens und TBR2-IPCs, die sich oberhalb des VZ bildeten, was an die Präplatte (PP) in der menschlichen kortikalen Entwicklung sowohl in hCOs als auch in hCOMs erinnert . Allerdings waren TBR2-IPCs in hCOMs deutlich stärker ausgedehnt (P < 0,005) (Abb. 4). Es wurde gezeigt, dass BRN2 eine entscheidende Rolle bei der Positionierung neokortikaler Neuronen spielt35 und ein Marker für äußere Neuronen der Schicht III ist. Nachdem wir die verstärkte Expansion basaler Vorläuferzellen in der SVZ-Region beobachtet hatten, untersuchten wir die Vergrößerung von Neuronen, die BRN2 exprimieren, weiter und stellten fest, dass es in den hCOMs im Vergleich zu hCOs signifikant erweitert war. (p < 0,005) (Abb. 4e,f). Verkleinerte Bilder jeder Figur sind in den ergänzenden Abbildungen S2 und S3 dargestellt. Zusammengenommen zeigen unsere Daten, dass kortikale Organoide, die in unserem neuartigen 3D-Kokultursystem gezüchtet wurden, eine klar definierte kortikale Laminierung zeigten.

Das Co-Kultursystem führte zu einer besseren Entwicklung der Kortikogenese, (a) Immunfärbung für den Marker CTIP2 der unteren Schicht und den Marker SATB2 der oberen Schicht in hCOMs im Vergleich zu hCOs nach 6 Wochen und 10 Wochen. (b) Relative Dicke der Kortikalisplatte (CP) in Woche 6 und Woche 10 in hCOs und hCOMs. Für jede kortikale Struktur wurden drei Messungen im 45°-Winkel durchgeführt, um den Mittelwert zu erhalten. Die relative CP-Dicke ist das Verhältnis der CP-Dicke zur Gesamtdicke von der Ventrikeloberfläche zur Pia-Oberfläche. Die CP-Dicke war nach 10 Wochen bei hCOMs im Vergleich zu hCOs statistisch signifikant größer, p < 0,05. Fehlerbalken ± SD, alle Maßstabsbalken: 100 µm, (c) auf PAX6 und IPC-Marker TBR2 immungefärbte kortikale Organoide zeigten eine vergleichsweise erweiterte SVZ-Fläche in hCOMs im Vergleich zu hCOs, und (d) die statistische Quantifizierung der TBR2-Expression zeigte einen signifikanten Unterschied in hCOMs vs. hCOs in W6 (P < 0,005). (e) Kortikale Organoide, die auf den Oberschichtmarker BRN2 immungefärbt waren, zeigten bei hCOMs im Vergleich zu hCOs eine größere und definiertere Fläche. (f) Die statistische Quantifizierung der BRN2-Expression zeigte einen signifikanten Unterschied zwischen hCOMs und hCOs in W10 (n = 4 biologische Replikate insgesamt, n = 2 CC1, n = 1 PCDH19 und n = 1 CHD2, n = 12 Anzahl der Organoide wurden analysiert ). Fehlerbalken ± SD. Maßstabsbalken, 100 µm.

Wir führten weitere Immunfärbungstests durch, um andere neuronale Marker für andere Schichten zu untersuchen. HOPX, ein Marker für die äußere radiale Gliaschicht (oSVZ), war in hCOMs im Vergleich zu hCOs stärker ausgedehnt (Abb. 5a). Die Bildanalyse zeigte, dass dieser Anstieg signifikant war (Abb. 5b). Am Tag 70 beobachteten wir einen vergrößerten Bereich der REELIN-Expression in der Randzone (MZ) bei hCOMs im Vergleich zu hCOs. REELIN ist im kortikalen MZ vorhanden und wird von Cajal-Retzius-Neuronen sezerniert. REELIN ist die Schlüsselkomponente bei der Entwicklung der radialen Organisation der Kortikalisplatte36 und eine Störung der REELIN-Expression hat nachweislich Auswirkungen auf die ordnungsgemäße laminare Organisation des Neokortex37. Am 70. Tag beobachteten wir, dass die Dicke der REELIN-exprimierenden Schicht bei hCOMs im Vergleich zu hCOs deutlich erhöht war (Abb. 5c). Um diese Expansion zu charakterisieren, haben wir die Dicke der Reelin-Schicht sowohl in hCOs als auch in hOMs gemessen und die Daten zeigten eine nahezu zweifache Verstärkung der Randzone im Co-Kultursystem (Abb. 5d). Verkleinerte repräsentative Abbildungen sind in der ergänzenden Abbildung S3 dargestellt.

Organisation und Markerexpression verschiedener Vorläuferzonen, (a,b) Beispielbilder der Immunfärbung der oRGC-Marker HOPX nach 10 Wochen in hCOMs und hCOs und die Quantifizierung der relativen Dicke des oSVZ-Bereichs in Woche 10 zeigen einen signifikanten Anstieg der hCOMs im Vergleich zu hCOs (p < 0005) (n > 10 kortikale Strukturen aus 4 unabhängigen Experimenten). Fehlerbalken ± SD, alle Maßstabsbalken: 100 µm, (c,d) repräsentative Immunfärbungsbilder für den vorplattierten Cajal-Retzius-Marker REELIN nach 10 Wochen in hCOMs und hCOs und Quantifizierung der relativen Dicke des MZ-Bereichs in Woche 10. Für jeden Kortikalisstruktur wurden drei Messungen im 45°-Winkel durchgeführt, um den Mittelwert zu erhalten. Die MZ-Dicke war nach 10 Wochen in hCOMs im Vergleich zu hCOs statistisch signifikant vergrößert (p < 0,0005) (n = 4 biologische Replikate insgesamt, n = 2 CC1, n = 1 PCDH19 und n = 1 CHD2, n = 10 Anzahl der Organoide). analysiert). Fehlerbalken ± SD, Maßstabsbalken: 100 µm.

Als nächstes untersuchten wir, ob Signalsignale von Hirnhautzellen die Verstärkung der menschlichen NP-Proliferation auf die kortikale Bildung in einem 3D-zerebralen Organoidsystem beeinflussen können. Vorhandene humangenetische Erkenntnisse deuten stark darauf hin, dass Wachstumsfaktorsignale wie FGF die kortikale Bildung des Menschen regulieren. In der aktuellen Studie enthielten sowohl Kontroll- als auch Co-Kultur-menschliche Organoide Neuroepithelien, die auf stereotype Weise organisiert waren und an den sich früh entwickelnden Kortex erinnerten, wo sich Ki67+-NPs an der apikalen Oberfläche der ventrikulären Zone vermehrten. Im Vergleich zu den Kontrollen enthielten hCOMs in Woche 10 mehr Ki67+-Zellen als in Woche 8, wo sie im Kontrollzustand im Laufe der Zeit von Woche 8 bis 10 abnahmen (ergänzende Abbildung S7). Die verstärkte Proliferation hielt an und war bei den hCOMs in Woche 8 bis 10 am deutlichsten, bei den Kontroll-hCOs nahm sie jedoch mit der Zeit ab. Der sich entwickelnde Kortex von Menschen und anderen gyrenzephalen Säugetieren beherbergt eine größere VZ und SVZ, die aus wesentlich mehr radialen Gliazellen und intermediären Vorläuferzellen bestehen. 43 Daher deutet die erhöhte Proliferation von IPC in unserem Co-Kultursystem auf ein besseres In-vitro-Modell des Menschen hin Kortikogenese mit verbesserter Expansionsfähigkeit, die das menschliche kortikale Gehirn besser rekapituliert. Basierend auf Quantifizierungsdaten war der Unterschied in der Ki67+-Expression zwischen hCOs und hCOMs jedoch nicht signifikant.

Als nächstes fragten wir, wie sich unser Co-Kultursystem auf die Differenzierung von Astrozyten auswirkt. Astrozyten stellen den zahlreichsten Zelltyp im Gehirn von Säugetieren dar und spielen nachweislich eine wichtige Rolle im ZNS, wie z. B. das Neurotransmitter-Recycling44, die Kontrolle der Synapsenbildung45 und die Funktion46. Studien haben auch gezeigt, dass die Hirnhäute wichtige Quellen für Astrozyten-induzierende Faktoren im sich entwickelnden Gehirn sind. Unsere Immunfärbungsergebnisse zeigten die Expression von Astrozyten am Tag 56 und am Tag 70 sowohl in hCOs als auch in hCOMs, die in hCOMs zu einem gewissen Grad stärker war. (Ergänzende Abbildung S8).

Die Fähigkeit von hiPSCs, gehirnähnliche 3D-Konstrukte zu erzeugen, ermöglicht es uns, eine neuartige personalisierte neurologische Modellierungsplattform zu entwickeln und die Mechanismen zu untersuchen, die der Entwicklung und Krankheit des menschlichen Gehirns zugrunde liegen. Trotz der aktuellen fortschrittlichen Technologien in der Entwicklung von Gehirnorganoiden bleiben viele technische Herausforderungen bestehen. In dieser Studie haben wir eine effiziente Methode entwickelt, die auf der Bildung einzelner Rosetten aus iPSCs basiert, die nach 5 Tagen eine Größe von etwa 250 µm erreichen können. In nur fünf Tagen zeigten diese Rosettenstrukturen eine röhrenförmige Zytoarchitektur im apikalen Bereich, die PKC-Z und N-CADHERIN sowie die neuralen Vorläufermarker PAX6 und NESTIN im basalen Bereich exprimierten. Unsere Ergebnisse zeigten, dass diese Organoide nach 21 Tagen Vorderhirn- und Nervenmarker exprimieren. Darüber hinaus könnte unsere Immunfärbungsanalyse in verschiedenen Zeitverläufen die histologische Organisation und das Expressionsmuster für wichtige Entwicklungsmarker innerhalb des sich entwickelnden menschlichen Kortex effizient rekapitulieren.

Es ist wichtig anzumerken, dass die meisten experimentellen Methoden in der Literatur mit der Herstellung von Organoiden beginnen, indem sie von Anfang an mehrere Rosetten erzeugen, von denen jede als unabhängiges Morphogenesezentrum fungiert4,5,47. Die Herstellung einzelner Rosetten hat in letzter Zeit größere Aufmerksamkeit erregt48,49. Protokolle auf der Basis einzelner Rosetten umfassen die manuelle Isolierung und Kultivierung wohlgeformter neuronaler Rosetten, die mithilfe von Wachstumsfaktoren und anderen Signalmolekülen induziert werden. Dieser Ansatz ermöglicht eine konsistentere und reproduzierbarere Organoidbildung, was zu homogeneren und definierteren Organoiden führt, die Aspekte der frühen Gehirnentwicklung besser nachahmen. Dieser Ansatz ist jedoch arbeitsintensiver und weniger skalierbar. Im Gegensatz dazu beinhalten andere Techniken, wie zum Beispiel auf Embryoidkörpern basierende Protokolle, die Aggregation pluripotenter Stammzellen zu dreidimensionalen Strukturen ohne manuelle Manipulation. Dieser Ansatz ist einfacher und weniger arbeitsintensiv und ermöglicht die Erzeugung einer großen Anzahl von Organoiden für Hochdurchsatzstudien, führt jedoch zu variableren Organoiden.50,51. Hier zeigen wir, dass unsere Organoidbildungsmethode bei wiederholten Experimenten einzelne Rosetten mit geringerer Größenvariabilität bilden und die Konsistenz in Morphologie und Phänotyp von Vorderhirnorganoiden 250 ± 20 µm erhöhen kann. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass unsere Methode zwar auf der Bildung einer einzelnen Rosette im ersten Stadium der Differenzierung basiert, die Präparation von Organoiden am Tag 42 jedoch mehrere VZs zeigte, was zeigt, dass mit zunehmender Reifung der hCOs mehr VZs beobachtet werden können (ergänzende Abbildung). 9).

Wir haben unsere Methode mit einem 3D-Kokultursystem unter Verwendung von Meningealzellen und zusammengesetzten iPSC-abgeleiteten hCOMs weiterentwickelt, um die Wirkung der Kokultur mit Meningealzellen auf die Morphologie und den Phänotyp kortikaler Gehirnorganoide zu bewerten. Zahlreiche Studien haben die entscheidende Rolle der Hirnhäute als Quelle mehrerer trophischer Faktoren gezeigt, darunter FGF215, insulinähnlicher Wachstumsfaktor17,52, CXCR1219 und Retinsäure22,23. In Anbetracht der Tatsache, dass frühere Studien eindeutig die entscheidende Rolle der Meningen bei der Entwicklung von Neuronen, der Produktion intermediärer Vorläuferzellen und der Verlängerung des Neuroepithels22 gezeigt haben, wollten wir Meningealzellen in unserer Organoidkultur nutzen, um festzustellen, ob wir die Kortikogenese und die Bildung von Gehirnstrukturen verbessern können. Tatsächlich haben wir beobachtet, dass das Vorhandensein von Hirnhautzellen und möglicherweise Signalfaktoren dieser Zellen die Differenzierung und Reifung einzelner Rosetten erheblich verbessert und die Morphologie und den kortikalen Phänotyp unserer Vorderhirnorganoide verbessert hat. In-vivo-Studien haben gezeigt, dass Meningen SDF1 absondern, das die tangentiale Wanderung von Cajal-Retzius-Zellen und kortikalen Interneuronen entlang der kortikalen Randzone steuert und so deren korrekte Verteilung während der Kortikogenese sicherstellt42,53. In unserem In-vitro-Co-Kultursystem beobachteten wir deutlich größere und klar definierte Randzonenbereiche, die sich durch eine erhöhte REELIN-Expression zeigten, was darauf hindeutet, dass die Sekretion von Faktoren aus Meningealzellen eine besser definierte Randzone und damit eine verstärkte Kortikogenese erzeugte. Wir beobachteten auch erweiterte Bereiche von IPC TBR2, dem Tiefschichtmarker CITIP2 und dem Oberschichtmarker BRN2. Darüber hinaus wurde die oSVZ-Schicht, die das Hauptmerkmal eines menschlichen kortikalen Organoids darstellt und es von Nagetieren trennt, in unserem Co-Kultursystem stark erweitert und gut definiert. Darüber hinaus haben wir eine frühere Reifung von Astrozyten in unserem System beobachtet, und dies steht im Einklang mit früheren Studien, die zeigten, dass Hirnhäute wichtige Quellen für Astrozyten-induzierende Faktoren im sich entwickelnden Gehirn sind54. Es ist wichtig zu erwähnen, dass Organoide während der Organoidbildung zwischen dem 9. und 11. Tag 1 % FBS ausgesetzt waren. Studien haben gezeigt, dass FBS die GFAP-Expression reaktivieren und erhöhen kann55. Wenn man jedoch bedenkt, dass sich die ersten Astrozyten um den 40. Tag herum differenzieren, was etwa 15 vollständigen Medienwechseln nach der Exposition gegenüber 1 % FBS entspricht, könnte dies darauf hindeuten, dass reife Astrozyten, die am Tag 70 beobachtet wurden, weniger wahrscheinlich als Folge der mittleren Wirkung erzeugt wurden. Es waren jedoch weitere Experimente erforderlich, um herauszufinden, ob eine erhöhte GFAP-Expression aufgrund der Anwesenheit von FBS in den Medien beobachtet wurde oder ob sie als Ergebnis einer stärkeren Differenzierung und Reifung exprimiert wurde. Außerdem wäre es für zukünftige Studien aussagekräftiger, andere Astrozytenmarker wie Glutaminsynthetase, BLBP (Gehirnlipid-bindendes Protein), S100β sowie Vimentin und CD49f zu verwenden. Darüber hinaus wird im Idealfall empfohlen, meningeale Zellen aus denselben pluripotenten Stammzelllinien (PSC) abzuleiten, die zur Erzeugung kortikaler Organoide verwendet werden, um die genetische und epigenetische Kompatibilität aufrechtzuerhalten, die für eine ordnungsgemäße Differenzierung und Entwicklung erforderlich ist. Unser Forschungslabor konzentrierte sich jedoch nicht auf die Unterscheidung meningealer Zellen von iPSCs und wurde in unserer Studie nicht berücksichtigt. Es ist auch wichtig, die möglichen langfristigen Auswirkungen der meningealen Kokultur auf die hCO-Entwicklung zu berücksichtigen, zu denen Veränderungen der Genexpression, Zellproliferation und Differenzierung gehören könnten. Diese Effekte können die Entwicklung und Reifung von hCOs und ihre Fähigkeit, neurologische Störungen genau zu modellieren, beeinflussen. Es sind jedoch weitere Untersuchungen erforderlich, um die spezifischen langfristigen Auswirkungen der meningealen Kokultur auf die hCO-Entwicklung zu bestimmen. Die Analyse der funktionellen Eigenschaften meningealer hCOs, einschließlich ihrer Fähigkeit, elektrische Aktivität zu erzeugen und auf äußere Reize zu reagieren, könnte wertvolle Informationen zum Verständnis ihres Potenzials als Modelle für die Untersuchung neurologischer Störungen und die Arzneimittelentwicklung liefern. Elektrophysiologische Aufzeichnungen und Calcium-Bildgebung sind potenzielle Methoden zur funktionellen Charakterisierung von hCOs. Diese Ansätze werden in unseren zukünftigen Studien berücksichtigt.

Unser Co-Kultursystem hat die laminare Architektur der Rosettenorganoide deutlich verbessert und bessere Vergleiche von Organoiden mit nativem menschlichem Gewebe ermöglicht. Meningeale Zellen spielen in vivo eine entscheidende Rolle bei der Gehirnentwicklung, unter anderem bei der Bildung und Reifung des Neocortex. Im Fall von hCOMs kann die Einbeziehung meningealer Zellen in das 3D-Kokultursystem eine physiologisch relevantere Umgebung schaffen, die den In-vivo-Zustand besser nachbildet. Meningeale Zellen sezernieren Wachstumsfaktoren und Zytokine, die die neurale Entwicklung, Zellproliferation und -differenzierung regulieren, was die Entwicklung bestimmter neuronaler Subtypen und deren Expressionsniveaus in hCOMs fördern kann50,56. Dies könnte erklären, warum hCOMs im Vergleich zu hCOs höhere Expressionsniveaus bestimmter neuronaler Subtypmarker zeigten. Es sind jedoch weitere Studien erforderlich, um die Rolle meningealer Zellen bei der Entwicklung kortikaler Organoide vollständig zu verstehen. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die mTOR-Signalübertragung die Architektur des sich entwickelnden menschlichen Kortex regulieren kann, indem sie die Zytoskelettorganisation von oRG-Zellen und dem radialen Glia-Gerüst aufrechterhält53. Somit bietet unser Co-Kultursystem mit einer besser definierten und verbesserten Schicht von orGs ein besseres In-vitro-Modell zur Rekapitulation des In-vivo-Zustands sowie eine verbesserte Zytoarchitektur und Laminierung des sich entwickelnden Gehirns.

Darüber hinaus könnte in zukünftigen Studien die Hinzufügung eines weiteren Zelltyps, beispielsweise Endothelzellen, in Kombination mit Hirnhautzellen in Betracht gezogen werden, um die Vaskularisierung von Gehirnorganoiden zu ermöglichen. Beim Tissue Engineering ist die Erzeugung vaskularisierter Organoide von entscheidender Bedeutung für deren nachhaltiges Wachstum und die Nachahmung der komplexen In-vivo-Mikroumgebung. Pluripotenten, aus Stammzellen gewonnenen Organoiden fehlt das Gefäßsystem, und aktuelle Strategien zur Organoidvaskularisierung reproduzieren die gemeinsame Entwicklung in vivo nicht vollständig. Um dieser Herausforderung zu begegnen, entwickelten Forscher einen 3D-gedruckten Mikrofluidikchip, um aus menschlichen pluripotenten Stammzellen gewonnene Organoide mit Gefäßzellen auf räumlich bestimmte Weise gemeinsam zu kultivieren. On-Chip-Perizyten und Endothelzellen organisierten sich selbst zu organisierten Gefäßnetzwerken und integrierten sich mit zerebralen Organoiden, wodurch ein integriertes neurovaskuläres Organoid entstand57,58. Darüber hinaus könnten mikrofluidische Kanäle aus abbaubaren Materialien die organoide Angiogenese weiter verbessern und die In-vivo-Mikroumgebung besser nachahmen59. Dies wird eine bessere Plattform für die Modellierung verschiedener neurologischer Störungen bieten, insbesondere von neurologischen Entwicklungsstörungen, die Anomalien in der kortikalen Entwicklung beinhalten, wie z. B. Autismus-Spektrum-Störung (ASD), Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätsstörung (ADHS), geistige Behinderung (ID), Entwicklungsverzögerung, Schizophrenie und Epilepsie sowie weitere zukünftige therapeutische Anwendungen. Durch die Rekapitulation der komplexen zellulären Interaktionen, die während der kortikalen Entwicklung auftreten, könnten diese Modelle neue Einblicke in die zugrunde liegenden Mechanismen dieser Störungen liefern und bei der Entwicklung neuer Therapiestrategien helfen.

Alle relevanten Daten sind im Manuskript enthalten. Die im Artikel beschriebenen Materialien, Daten und Protokolle sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Lancaster, MA et al. Zerebrale Organoide modellieren die Entwicklung und Mikrozephalie des menschlichen Gehirns. Nature 501(7467), 373–379 (2013).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Paşca, AM et al. Funktionelle kortikale Neuronen und Astrozyten aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in 3D-Kultur. Nat. Methoden 12(7), 671–678 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Pașca, SP Der Aufstieg dreidimensionaler menschlicher Gehirnkulturen. Nature 553(7689), 437–445 (2018).

Artikel ADS PubMed Google Scholar

Qian, X. et al. Gehirnregionspezifische Organoide unter Verwendung von Mini-Bioreaktoren zur Modellierung der ZIKV-Exposition. Zelle 165(5), 1238–1254 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Watanabe, M. et al. Selbstorganisierte Gehirnorganoide mit menschenspezifischen Merkmalen sagen wirksame Medikamente zur Bekämpfung der Zika-Virus-Infektion voraus. Cell Rep. 21(2), 517–532 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yin, X. et al. Entwicklung von Stammzellorganoiden. Cell Stem Cell 18(1), 25–38 (2016).

Artikel MathSciNet CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brassard, JA & Lutolf, MP Engineering der Selbstorganisation von Stammzellen zum Aufbau besserer Organoide. Cell Stem Cell 24(6), 860–876 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jalink, P. & Caiazzo, M. Gehirnorganoide: Den Bedarf an einem menschlichen Modell neurologischer Störungen decken. Biologie (Basel) 10(8), 740 (2021).

CAS PubMed Google Scholar

Hartmann, D., Ziegenhagen, MW & Sievers, J. Meningeale Zellen stimulieren die neuronale Migration und die Bildung radialer Glia-Faszikel aus der äußeren Körnerschicht des Kleinhirns. Neurosci. Lette. 244(3), 129–132 (1998).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sievers, J. et al. Meningeale Zellen organisieren die oberflächlichen Glia limitans des Kleinhirns und produzieren Komponenten sowohl der interstitiellen Matrix als auch der Basalmembran. J. Neurocytol. 23(2), 135–149 (1994).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Krisch, B., Leonhardt, H. & Oksche, A. Kompartimente und perivaskuläre Anordnung der Hirnhäute, die die Großhirnrinde der Ratte bedecken. Zellgeweberes. 238(3), 459–474 (1984).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Halfter, W. et al. Eine entscheidende Funktion der Pialbasalmembran bei der kortikalen Histogenese. J. Neurosci. 22(14), 6029–6040 (2002).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nakagomi, T. & Matsuyama, T. Leptomeninges: Eine neuartige Stammzellnische mit neurogenem Potenzial. Stammzelluntersuchung. 4, 22 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Decimo, I. et al. Meningen: Von der Schutzmembran zur Stammzellnische. Bin. J. Stammzellen 1(2), 92–105 (2012).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mercier, F. & Hatton, GI Connexin 26 und der grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor werden hauptsächlich in den subpialen und subependymalen Schichten im erwachsenen Gehirnparenchym exprimiert: Rollen bei der Stammzellproliferation und der morphologischen Plastizität? J. Comp. Neurol. 431(1), 88–104 (2001).

3.0.CO;2-D" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F1096-9861%2820010226%29431%3A1%3C88%3A%3AAID-CNE1057%3E3.0.CO%3B2-D" aria-label="Article reference 15" data-doi="10.1002/1096-9861(20010226)431:13.0.CO;2-D">Artikel CAS PubMed Google Scholar

Stylianopoulou, F. et al. Expression des Gens für den insulinähnlichen Wachstumsfaktor II im Plexus choroideus und den Leptomeningen des Zentralnervensystems erwachsener Ratten. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. 85(1), 141–145 (1988).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brar, A. & Chernausek, S. Lokalisierung der Expression des insulinähnlichen Wachstumsfaktor-bindenden Proteins 4 im sich entwickelnden und erwachsenen Rattengehirn: Analyse durch In-situ-Hybridisierung. J. Neurosci. Res. 35(1), 103–114 (1993).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Stumm, R. et al. Muster von SDF-1α- und SDF-1γ-mRNAs, Migrationswege und Phänotypen von CXCR4-exprimierenden Neuronen im sich entwickelnden Telencephalon der Ratte. J. Comp. Neurol. 502(3), 382–399 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Reiss, K. et al. Der aus Stromazellen stammende Faktor 1 wird von Hirnhautzellen sezerniert und wirkt als chemotaktischer Faktor auf neuronale Stammzellen der äußeren Körnerschicht des Kleinhirns. Neurowissenschaften 115(1), 295–305 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Berger, O. et al. Expression von SDF-1 und CXCR4 während der Reorganisation des postnatalen Gyrus dentatus. Entwickler Neurosci. 29(1–2), 48–58 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Borrell, V. & Marín, O. Meningen kontrollieren die tangentiale Migration von aus Häm stammenden Cajal-Retzius-Zellen über CXCL12/CXCR4-Signalisierung. Nat. Neurosci. 9(10), 1284–1293 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Siegenthaler, JA et al. Retinsäure aus der Hirnhaut reguliert die Bildung kortikaler Neuronen. Zelle 139(3), 597–609 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, J. et al. Die Hirnhäute sind eine Retinsäurequelle für das sich spät entwickelnde Hinterhirn. J. Neurosci. 23(20), 7610–7620 (2003).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Choe, Y., Siegenthaler, JA & Pleasure, SJ Eine von den Hirnhäuten initiierte Kaskade morphogener Signale steuert die Bildung des Corpus callosum. Neuron 73(4), 698–712 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hebert, JM, Mishina, Y. & McConnell, SK BMP-Signale sind lokal erforderlich, um die dorsale telenzephale Mittellinie zu strukturieren. Neuron 35(6), 1029–1041 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lehtinen, MK et al. Die Liquor cerebrospinalis bietet eine proliferative Nische für neurale Vorläuferzellen. Neuron 69(5), 893–905 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Haubst, N. et al. Molekulare Analyse der Pax6-Funktion: Die spezifischen Rollen der gepaarten Domäne und der Homöodomäne bei der Gehirnentwicklung. Entwicklung 131(24), 6131–6140 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Eiraku, M. et al. Selbstorganisierende Morphogenese des Optikbechers in der dreidimensionalen Kultur. Nature 472(7341), 51–56 (2011).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Decimo, I. et al. Meningen: Eine weit verbreitete Nische neuronaler Vorläufer für das Gehirn. Neurowissenschaftler 27(5), 506–528 (2021).

Artikel PubMed Google Scholar

Lancaster, MA et al. Gesteuerte Selbstorganisation und kortikale Plattenbildung in Organoiden des menschlichen Gehirns. Nat. Biotechnologie. 35(7), 659–666 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Holloway, EM, Capeling, MM & Spence, JR Biologisch inspirierte Ansätze zur Steigerung der Komplexität menschlicher Organoide. Entwicklung 146(8), 166173 (2019).

Artikel Google Scholar

Bagley, JA et al. Fusionierte zerebrale Organoide modellieren Interaktionen zwischen Gehirnregionen. Nat. Methoden 14(7), 743–751 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shi, Y. et al. Entwicklung der menschlichen Großhirnrinde von pluripotenten Stammzellen zu funktionellen erregenden Synapsen. Nat. Neurosci. 15(3), 477-486S1 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sessa, A. et al. Tbr2 steuert die Umwandlung der radialen Glia in basale Vorläufer und steuert die neuronale Amplifikation durch indirekte Neurogenese im sich entwickelnden Neokortex. Neuron 60(1), 56–69 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Martinez-Cerdeno, V., Noctor, SC & Kriegstein, AR Die Rolle intermediärer Vorläuferzellen bei der evolutionären Expansion der Großhirnrinde. Großhirn. Cortex 16 (Suppl 1), i152–i161 (2006).

Artikel PubMed Google Scholar

Englund, C. et al. Pax6, Tbr2 und Tbr1 werden nacheinander von radialen Gliazellen, intermediären Vorläuferzellen und postmitotischen Neuronen im sich entwickelnden Neokortex exprimiert. J. Neurosci. 25(1), 247–251 (2005).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Smart, IH et al. Einzigartige morphologische Merkmale der proliferativen Zonen und postmitotischen Kompartimente des Nervenepithels, die beim Affen zum quergestreiften und extrastriatischen Kortex führen. Großhirn. Cortex 12(1), 37–53 (2002).

Artikel PubMed Google Scholar

Pollen, AA et al. Molekulare Identität menschlicher äußerer radialer Gliazellen während der kortikalen Entwicklung. Zelle 163(1), 55–67 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lui, JH, Hansen, DV & Kriegstein, AR Entwicklung und Evolution des menschlichen Neocortex. Zelle 146(1), 18–36 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ito, Y. et al. Die bedingte Inaktivierung von Tgfbr2 in der kranialen Neuralleiste führt zu Gaumenspalten- und Schädeldachdefekten. Entwicklung 130(21), 5269–5280 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Mehrara, BJ et al. Die Expression des grundlegenden Fibroblasten-Wachstumsfaktors und des transformierenden Wachstumsfaktors Beta-1 in der sich entwickelnden Dura mater korreliert mit der Bildung von Kalvarienknochen. Plast. Rekonstr. Surg. 104(2), 435–444 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Borrell, V. & Marin, O. Meninges kontrollieren die tangentiale Migration von aus Häm stammenden Cajal-Retzius-Zellen über CXCL12/CXCR4-Signalisierung. Nat. Neurosci. 9(10), 1284–1293 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hansen, DV et al. Neurogene radiale Glia in der äußeren subventrikulären Zone des menschlichen Neokortex. Nature 464(7288), 554–561 (2010).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Sloan, SA et al. Die Reifung menschlicher Astrozyten wird in 3D-Sphäroiden der Großhirnrinde erfasst, die aus pluripotenten Stammzellen stammen. Neuron 95(4), 779-790e6 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Allen, NJ et al. Die Astrozyten-Glypicane 4 und 6 fördern die Bildung erregender Synapsen über GluA1-AMPA-Rezeptoren. Nature 486(7403), 410–414 (2012).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tsai, YJ et al. Auswirkungen einer regionalen und Ganzkörper-Hypothermiebehandlung vor und nach einer Verletzung des Nervus medianus auf neuropathische Schmerzen und Glia-Aktivierung im Keilbeinkern der Ratte. Anaesthesiology 116(2), 415–431 (2012).

Artikel PubMed Google Scholar

Birey, F. et al. Zusammenbau funktionell integrierter Sphäroide des menschlichen Vorderhirns. Nature 545(7652), 54–59 (2017).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Knight, GT et al. Technische Induktion der Entstehung singulärer neuronaler Rosetten in hPSC-abgeleiteten Geweben. Elife 7, e37549 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Tidball, AM et al. Selbstorganisierende Einzelrosetten-Gehirnorganoide aus menschlichen pluripotenten Stammzellen. bioRxiv 2022.02.28.482350 (2022).

Lancaster, MA & Knoblich, JA Erzeugung zerebraler Organoide aus menschlichen pluripotenten Stammzellen. Nat. Protokoll. 9(10), 2329–2340 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Boisvert, EM et al. Eine statische, selbstgesteuerte Methode zur Erzeugung von Gehirnorganoiden aus menschlichen embryonalen Stammzellen. J. Vis. Exp. 4(157), 60379 (2020).

Google Scholar

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Paredes, MF et al. Stroma-abgeleiteter Faktor 1 (CXCL12) reguliert die laminare Position von Cajal-Retzius-Zellen in normalen und dysplastischen Gehirnen. J. Neurosci. 26(37), 9404–9412 (2006).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kawamura, Y. et al. Synergistische Induktion der Astrozytendifferenzierung durch Faktoren, die von den Hirnhäuten im sich entwickelnden Mausgehirn abgesondert werden. FEBS Lett. 591(22), 3709–3720 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Herrera, F., Chen, Q. & Schubert, D. Synergistische Wirkung von Retinsäure und Zytokinen auf die Regulierung der Expression saurer Glia-Fibrillenproteine. J. Biol. Chem. 285(50), 38915–38922 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, H. Modellierung neurologischer Erkrankungen mit Organoiden des menschlichen Gehirns. Vorderseite. Synaptische Neurosci. 10, 15 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Salmon, I. et al. Entwicklung neurovaskulärer Organoide mit 3D-gedruckten Mikrofluidik-Chips. Lab Chip 22(8), 1615–1629 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Shirure, VS, Hughes, CCW & George, SC Engineering vaskularisierter Organoid-on-a-Chip-Modelle. Annu. Rev. Biomed. Ing. 23, 141–167 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hoang, P. & Ma, Z. Biomaterialgesteuertes Stammzell-Organoid-Engineering zur Modellierung von Entwicklung und Krankheiten. Acta Biomater. 132, 23–36 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Referenzen herunterladen

Ich möchte auch der Abteilung für Neurologie der University of Michigan für die Bereitstellung von Einrichtungen zur Durchführung der Experimente danken. Ich möchte Dr. Kamran Avanaki vom Biomedical Engineering Department der University of Illinois in Chicago für seine aufschlussreichen Empfehlungen bei der Überarbeitung des Manuskripts danken.

National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, unter Grant KL2TR002002.

Abteilung für Neurologie, University of Michigan Medical Center, Ann Arbor, MI, 48109, USA

Elmira Galilian

Abteilung für Ingenieurwissenschaften in der Medizin, Abteilung für Medizin, Harvard Medical School, Brigham and Women's Hospital, Cambridge, MA, 02139, USA

Su Ryon Shin

Abteilung für Augenheilkunde und visuelle Wissenschaften, University of Illinois at Chicago, Chicago, IL, 60612, USA

Elmira Galilian

Richard und Loan Hill Department of Bioengineering, University of Illinois at Chicago, Chicago, IL, 60607, USA

Elmira Galilian

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

EJ entwarf, überwachte und führte alle Teile der Studien durch und verfasste das Manuskript. SRS hat wissenschaftliche Unterstützung geleistet, die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Korrespondenz mit Elmira Jalilian.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Jalilian, E., Shin, SR Neuartiges Modell des kortikal-meningealen Organoid-Kokultursystems verbessert die Organoid-Zytoarchitektur des menschlichen kortikalen Gehirns. Sci Rep 13, 7809 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35077-9

Zitat herunterladen

Eingegangen: 23. Januar 2023

Angenommen: 12. Mai 2023

Veröffentlicht: 14. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35077-9

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.

Nachricht