Monozyten

Scientific Reports Band 5, Artikelnummer: 15857 (2015) Diesen Artikel zitieren

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Nicotinamid-Phosphoribosyltransferase (Nampt) katalysiert den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt im Salvage-Weg für die Biosynthese von Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD+) und reguliert dadurch die Deacetylaseaktivität von Sirtuinen. Hier zeigen wir die akkommodierende Regulierung von myokardialem NAD+ durch aus Monozyten gewonnenes extrazelluläres Nampt (eNampt), das für die hämodynamische Kompensation von Drucküberlastung wesentlich ist. Obwohl die intrazelluläre Nampt (iNampt)-Expression in drucküberlasteten Herzen verringert war, blieben die myokardiale NAD+-Konzentration und die Sirt1-Aktivität erhalten. Im Gegensatz dazu wurde iNampt in Milz und Monozyten hochreguliert und das zirkulierende eNampt-Protein und Nicotinamidmononukleotid (NMN), ein wichtiger Vorläufer von NAD+, waren signifikant erhöht. Die pharmakologische Hemmung von Nampt durch FK866 oder die Depletion von Monozyten/Makrophagen durch Clodronat-Liposomen störte den homöostatischen Mechanismus der myokardialen NAD+-Spiegel und der NAD+-abhängigen Sirt1-Aktivität, was bei drucküberlasteten Mäusen zu einer Anfälligkeit für Kardiomyozyten-Apoptose und Herzdekompensation führte. Diese biochemischen und hämodynamischen Defekte wurden durch die systemische Verabreichung von NMN verhindert. Unsere Studien decken eine entscheidende Rolle von Monozyten-abgeleitetem eNampt bei der Anpassung des Myokards an Drucküberlastung auf und verdeutlichen eine mögliche Intervention zur Kontrolle von Myokard-NAD+ gegen Herzinsuffizienz.

Nicotinamidadenindinukleotid (NAD+) ist ein Oxidoreduktase-Cofaktor für viele Stoffwechselreaktionen wie Glykolyse, Fettsäure-β-Oxidation, den TCA-Zyklus und mitochondriale oxidative Phosphorylierung1. NAD+ fungiert auch als essentielles Substrat für Enzyme wie Poly(ADP-Ribose)-Polymerasen2 und Sirtuine3. Sirtuine sind NAD+-abhängige Enzyme, die die Deacetylierung von Histonen und einer Vielzahl von Proteinen in mehreren Zellkompartimenten katalysieren, und die Sirtuine von Säugetieren (bestehend aus Sirt1-Sirt7) fungieren als zentrale Regulatoren für die Aufrechterhaltung der Energiehomöostase und die Prävention altersbedingter Krankheiten4. Dementsprechend ist eine strenge Regulierung der intrazellulären NAD+-Spiegel entscheidend für das Überleben von Zellen und Organismen unter pathophysiologischen Bedingungen. NAD+ kann de novo synthetisiert werden, der Großteil von NAD+ wird jedoch über den Salvage-Weg aus seinen Vorläufern Nicotinsäure, Nicotinamid (NAM) oder NAM-Ribose5 synthetisiert. In Säugetierzellen ist die Umwandlung von NAM in NAM-Mononukleotid (NMN) durch NAM-Phosphoribosyltransferase (Nampt) der geschwindigkeitsbestimmende Schritt dieses Weges6. Interessanterweise existiert Nampt nicht nur als intrazelluläre Form (iNampt), sondern auch als extrazelluläre Form (eNampt) in einem enzymatisch aktiven Dimer7 und eNampt, früher Prä-B-Zell-Kolonie-verstärkender Faktor oder Visfatin genannt, wird von Adipozyten produziert und sezerniert. mononukleäre Zellen, Hepatozyten und Kardiomyozyten7-9. Im Plasma von Mäusen ist eine hohe Konzentration an NMN vorhanden, und die durch eNampt vermittelte extrazelluläre Produktion von NMN reguliert die intrazelluläre NAD+-Biosynthese in Stoffwechselgeweben wie Leber und weißem Fettgewebe bei Mäusen, die durch eine fettreiche Ernährung an Diabetes leiden10.

Im Herzen wurde das Expressionsniveau des Nampt-Proteins unter pathologischen Bedingungen wie Ischämie, Ischämie/Reperfusion und Drucküberlastung herunterreguliert11. Es besteht jedoch Kontroverse darüber, ob Nampt für die Pathophysiologie des Herzens vorteilhaft oder schädlich ist9,11,12 und es bleibt unklar, wie die myokardiale NAD+-Biosynthese durch iNampt und eNampt unter pathologischen Bedingungen reguliert wird. Hier zeigen wir, dass die myokardiale NAD+-Konzentration trotz verminderter iNampt-Expression bei Mäusen nach transversaler Aortenverengung (TAC) erhalten bleibt. Mechanistisch gesehen trägt das aus Monozyten gewonnene eNampt zur Erhaltung der myokardialen NAD+-Spiegel bei, die für die funktionelle Kompensation bei Drucküberlastung ausreichen. Unsere Studien liefern mechanistische Einblicke in die gewebeübergreifende Regulation der Herzhomöostase unter Beteiligung von aus dem Knochenmark stammenden Monozyten und weisen auf eine therapeutische Strategie zur Manipulation dieses Signalwegs zur Behandlung von Herzinsuffizienz hin.

Wir untersuchten zunächst den Einfluss der Nampt-abhängigen NAD+-Biosynthese auf die Stressreaktion auf Verletzungen in kultivierten Kardiomyozyten neugeborener Ratten. Doxorubicin (DOX), ein Anthrazyklin-Krebsmedikament, wirkt durch mehrere Mechanismen kardiotoxisch, darunter ein Anstieg des oxidativen Stresses, eine myofibrilläre Verschlechterung und eine intrazelluläre Ca2+-Dysregulation13. Die Stimulation mit DOX verringerte die NAD+-Konzentration und die enzymatische Aktivität von Sirt1 signifikant und erhöhte umgekehrt die Acetylierung von Kernproteinen in Kardiomyozyten, was durch die gleichzeitige Behandlung mit FK866, einem selektiven Nampt-Inhibitor14, noch verstärkt wurde (Abb. 1a–c). Es wurde berichtet, dass Sirt1 die Mitochondrienfunktion und Energienutzung reguliert und Kardiomyozyten vor Zelltod und Degeneration schützt15,16. Konsequenterweise wurde die DOX-induzierte Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen und der Expressionsniveaus von Genen, die für die Mitochondrienfunktion relevant sind, wie Sod2, Ppargc1a, Pparg und mt-Co3, durch die Behandlung mit FK866 weiter verstärkt (Abb. 1d, e). Umgekehrt erhöhte die Behandlung von DOX-stimulierten Kardiomyozyten mit NMN die NAD+-Konzentration und die enzymatische Aktivität von Sirt1 signifikant, verringerte die Acetylierung von Kernproteinen und stellte die Lebensfähigkeit der Zellen sowie die Expressionsniveaus mitochondrialer Gene wieder her (Abb. 1f – j). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Nampt-abhängige Biosynthese von NAD+ vor DOX-induzierter Kardiotoxizität in kultivierten Zellen schützt.

Schutzfunktion der Nampt-abhängigen Biosynthese der NAD+- und Sirt1-Aktivierung gegen DOX-induzierte Toxizität in neugeborenen Kardiomyozyten von Ratten.

(a) NAD+-Konzentrationen in Kardiomyozyten, die mit Mock (n = 7), DOX (n = 7) oder DOX + FK866 (n = 11) behandelt wurden. **P < 0,01. (b) Sirt1-Deacetylase-Aktivität in Kardiomyozyten, die mit Schein (n = 4), DOX (n = 5) oder DOX + FK866 (n = 5) behandelt wurden. *P < 0,05, **P < 0,01. (c) Immunoblot-Analyse von acetyliertem Lysin (Ac-K) und Histon H3 in der Kernfraktion von Kardiomyozyten, die mit Mock, DOX oder DOX + FK866 behandelt wurden. Die Quantifizierungen von Ac-K/Histon H3 werden als Balkendiagramme angezeigt (n = 8, in jeder Gruppe). **P < 0,01. (d) Zelllebensfähigkeit in Kardiomyozyten, die mit Schein, DOX oder DOX + FK866 behandelt wurden (n = 6, in jeder Gruppe). **P < 0,01. (e) Die mRNA-Spiegel von Mitochondrien-assoziierten Genen in Kardiomyozyten, die mit Schein (n = 7), DOX (n = 7) oder DOX + FK866 (n = 5) behandelt wurden. *P < 0,05 gegenüber Schein, **P < 0,01 gegenüber Schein, #P < 0,05 gegenüber DOX, ##P < 0,01 gegenüber DOX. (f) NAD+-Konzentrationen in Kardiomyozyten, die mit Schein (n = 4), DOX (n = 3) oder DOX + NMN (n = 4) behandelt wurden. *P < 0,05, **P < 0,01. (g) Sirt1-Deacetylase-Aktivität in Kardiomyozyten, die mit Schein (n = 4), DOX (n = 5) oder DOX + NMN (n = 5) behandelt wurden. *P < 0,05, **P < 0,01. (h) Immunblot-Analyse von Ac-K und Histon H3 in Kardiomyozyten, die mit Schein, DOX oder DOX + NMN behandelt wurden. Die Quantifizierungen von Ac-K/Histon H3 werden als Balkendiagramme angezeigt (n = 8, in jeder Gruppe). *P < 0,05, **P < 0,01. (i) Zelllebensfähigkeit in Kardiomyozyten, die mit Schein, DOX oder DOX + NMN behandelt wurden (n = 6, in jeder Gruppe). **P < 0,01. (j) Die mRNA-Spiegel von Mitochondrien-assoziierten Genen in Kardiomyozyten, die mit Schein (n = 7), DOX (n = 5) oder DOX + NMN (n = 5) behandelt wurden. **P < 0,01 gegenüber Schein, #P < 0,05 gegenüber DOX, ##P < 0,01 gegenüber DOX.

Um den pathophysiologischen Zusammenhang zwischen Nampt-abhängiger NAD+-Biosynthese und Herzinsuffizienz zu untersuchen, haben wir Mäuse durch die Produktion von TAC einer Drucküberlastung ausgesetzt. In diesem Modell konnten wir eine adaptive Herzhypertrophie mit erhaltener systolischer Funktion bei 2 W und maladaptiver Herzinsuffizienz bei 8 W nach der Operation induzieren (Ergänzungstabelle 1). 8 Wochen nach der Operation waren die mRNA- und Proteinspiegel von Nampt in TAC-operierten Herzen im Vergleich zu scheinoperierten Herzen signifikant verringert (Abb. 2a, b). Überraschenderweise blieben jedoch die enzymatische Aktivität sowie die mRNA- und Proteinspiegel von Sirt1 und der Acetylierungsgrad des Forkhead-Box-Proteins O1 (FoxO1) zwischen TAC- und scheinoperierten Herzen unverändert (Abb. 2c – f). Trotz der Abnahme der iNampt-Proteinspiegel blieb die NAD+-Konzentration in TAC-betriebenen Herzen erhalten, wie durch direkte Messung mit einem HPLC-System gezeigt wurde (Abb. 2g). Wir fanden auch heraus, dass die NMN-Konzentration in TAC-operierten Herzen signifikant höher war als in scheinoperierten Herzen (Abb. 2h). Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine Erhöhung der myokardialen NMN-Versorgung einen Rückgang der iNampt-abhängigen NMN-Synthese kompensieren könnte, um die konstante Konzentration von NAD+ in TAC-betriebenen Herzen zu erreichen.

Kompensierte myokardiale NAD+-Konzentration und Sirt1-Aktivität trotz verringerter Nampt-Expression in TAC-operierten Herzen.

(a) Die mRNA-Spiegel von Nampt in Herzen bei 8 Wochen nach TAC oder Scheinoperation (n = 5). (b) Immunoblot-Analyse von Nampt in Herzen 8 Wochen nach der Operation. Die Quantifizierungen des Nampt/GAPDH werden als Balkendiagramme angezeigt (n = 5). (c) Die mRNA-Spiegel von Sirt1 im Herzen 8 Wochen nach der Operation (n = 5). (d) Immunblot-Analyse von Sirt1 in Herzen 8 Wochen nach der Operation. Die Quantifizierungen von Sirt1/GAPDH werden als Balkendiagramme angezeigt (n = 5). (e) Sirt1-Deacetylase-Aktivität im Herzen 8 Wochen nach der Operation (TAC, n = 5; Schein; n = 8). (f) Immunoblot-Analyse von acetyliertem FoxO1 (Ac-FoxO1) und FoxO1 in Herzen 8 Wochen nach der Operation. Die Quantifizierungen von Ac-FoxO1/FoxO1 werden als Balkendiagramme angezeigt (n = 4). (g) NAD+-Konzentrationen (TAC, n = 10; Schein, n = 11) und (H) NMN-Konzentrationen (TAC, n = 5; Schein, n = 4) in Herzen 8 Wochen nach der Operation. *P < 0,05, **P < 0,01, NS, nicht signifikant.

Bei TAC-operierten Mäusen waren sowohl die Plasmaspiegel von eNampt-Protein als auch von NMN im Vergleich zu scheinoperierten Mäusen signifikant erhöht (Abb. 3a, b), was darauf hindeutet, dass der Anstieg der eNampt-abhängigen Biosynthese von Plasma-NMN zum Anstieg beitragen könnte in myokardialen NMN-Spiegeln bei TAC-operierten Mäusen. Darüber hinaus induzierte die Behandlung neonataler Kardiomyozyten von Ratten mit TAC-gesteuertem Mausserum eine signifikant höhere Deacetylaseaktivität von Sirt1 als die mit scheinoperiertem Mausserum (Abb. 3c), was darauf hindeutet, dass ein Anstieg der eNampt-abhängigen Biosynthese von Plasma-NMN für die Aktivierung ausreichend war von Sirt1 im Myokard.

CD11b + Monozyten als mögliche Quellen für erhöhtes eNampt-Protein im peripheren Blut von TAC-operierten Mäusen.

(a) Immunoblot-Analyse von eNampt im Plasma bei 8 W nach TAC- (n = 16) oder Scheinoperation (n = 17). Die Quantifizierungen des eNampt werden als Balkendiagramme angezeigt. (b) NMN-Konzentrationen im Plasma bei 8 W nach der Operation (n = 6). (c) Sirt1-Deacetylaseaktivität in neugeborenen Kardiomyozyten von Ratten, die mit Serum von Mäusen bei 8 W nach TAC- (n = 10) oder Scheinoperation (n = 3) behandelt wurden. (d) Die mRNA-Spiegel von Nampt in mononukleären Zellen, die bei 8 W nach TAC- (n = 8) oder Scheinoperation (n = 9) aus peripherem Blut isoliert wurden. (e) Die mRNA-Spiegel von Nampt in CD11b- und CD11b+-Zellen im peripheren Blut (n = 3). Die Daten werden als fache Induktion über CD11b-Zellen angezeigt. (f) Die mRNA-Spiegel von Nampt in CD11b+-Zellen im peripheren Blut bei 8 Wochen nach TAC- (n = 10) oder Scheinoperation (n = 5). *P < 0,05.

In einem Versuch, nach möglichen Quellen für erhöhte Plasma-eNampt-Werte zu suchen, untersuchten wir die Expressionsniveaus des Nampt-Proteins in Mausgeweben nach TAC- oder Scheinoperationen. Unter den untersuchten Geweben zeigte nur die Milz nach der TAC-Operation einen signifikanten Anstieg der Nampt-Expression (ergänzende Abbildung 1). Wir fanden auch heraus, dass die Expressionsniveaus von Nampt-mRNA in mononukleären Zellen, die aus dem peripheren Blut von TAC-operierten Mäusen isoliert wurden, signifikant erhöht waren (Abb. 3d). Um zu bestimmen, welche Subpopulation möglicherweise zur erhöhten Nampt-Expression in peripheren mononukleären Zellen beiträgt, trennten wir Zellen von peripheren mononukleären Zellen nicht operierter Mäuse mithilfe des myelomonozytischen Abstammungsmarkers CD11b (ergänzende Abbildung 2a) und stellten fest, dass die Nampt-mRNA-Expression in CD11b + -Zellen signifikant höher war als in CD11b-Zellen (Abb. 3e). Darüber hinaus waren die Nampt-mRNA-Expressionen in CD11b + -Zellen von TAC-operierten Mäusen signifikant höher als die von scheinoperierten Mäusen (Abb. 3f). Aus peripheren mononukleären Zellen isolierte CD11b+-Zellen zeigten hohe Expressionsniveaus von Emr1-mRNA (ergänzende Abbildung 2b) und wurden daher als CD11b+-, F4/80+-Monozyten angesehen. Da die Milz ein Reservoir für extramedulläre Monozyten ist, die als Reaktion auf Myokardischämie mobilisiert werden17, spekulierten wir, dass Monozyten die mögliche Quelle für erhöhtes Plasma-eNampt-Protein sein könnten.

Um die funktionelle Bedeutung von Nampt bei der hämodynamischen Kompensation von Drucküberlastung zu untersuchen, verabreichten wir TAC- oder scheinoperierten Mäusen intraperitoneal FK866 oder Mock. Da bereits 1 Woche nach der TAC-Operation eine Abnahme der kardialen iNampt-Expression und eine Zunahme der Plasma-eNampt-Expression beobachtet wurden (ergänzende Abbildung 3), begannen wir am Tag der Operation mit der Verabreichung von FK866. Die echokardiographische Untersuchung ergab, dass die Verabreichung von FK866 über eine Woche bei TAC-operierten Mäusen einen signifikanten Anstieg der linksventrikulären enddiastolischen Dimension (LVEDD) und eine signifikante Abnahme der fraktionierten Verkürzung (FS) hervorrief, während diese Parameter bei scheinoperierten Mäusen unverändert blieben (Ergänzungstabelle 2). Infolgedessen starben etwa 65 % der TAC-operierten Mäuse innerhalb von 1 Woche nach der Behandlung mit FK866 (Abb. 4a). Bei TAC-operierten Mäusen führte die Behandlung mit FK866 zu einer signifikanten Abnahme der myokardialen Konzentration von NAD+ (Abb. 4b) und der Deacetylaseaktivität von Sirt1 (Abb. 4c) sowie zu einem Anstieg des Acetylierungsniveaus von FoxO1 (Abb. 4d), obwohl diese Veränderungen der Fall waren bei scheinoperierten Mäusen nicht beobachtet (Abb. 4b – d). Infolgedessen führte die durch FK866 induzierte Reduktion von NAD+ zu einem signifikanten Rückgang der Expressionsniveaus von Genen, die für die Mitochondrienfunktion relevant sind, wie Tfam, Pparg und Esrra (Abb. 4e) und zu einem signifikanten Anstieg der Anzahl TUNEL-positiver Kardiomyozyten ( Abb. 4f,g). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die funktionelle Hemmung von Nampt den homöostatischen Mechanismus der myokardialen NAD+-Spiegel und der NAD+-abhängigen Sirt1-Aktivität störte und dadurch eine kardiale Dekompensation bei drucküberlasteten Mäusen induzierte.

Herzdekompensation durch Behandlung mit FK866 bei drucküberlasteten Mäusen.

(a) Kaplan-Meier-Überlebenskurven von Mäusen, die mit FK866 (FK) oder Scheinoperation behandelt wurden, nach TAC- oder Scheinoperation (Schein + Schein, n = 5; Schein + FK, n = 5; TAC + Schein, n = 8; TAC +). FK, n = 17). (b) NAD+-Konzentrationen im Herzen 7 Tage nach der Operation (Schein + Schein, n = 3; Schein + FK, n = 3; TAC + Schein, n = 8; TAC + FK, n = 5). (c) Sirt1-Deacetylase-Aktivität im Herzen 7 Tage nach der Operation (Schein + Schein, n = 4; Schein + FK, n = 4; TAC + Schein, n = 7; TAC + FK, n = 5). (d) Immunblot-Analyse von Ac-FoxO1 und FoxO1 in Herzen 7 Tage nach der Operation (Schein + Schein, n = 3; Schein + FK, n = 3; TAC + Schein, n = 7; TAC + FK, n = 5 ). Die Quantifizierungen von Ac-FoxO1/FoxO1 werden als Balkendiagramme angezeigt. (e) Die mRNA-Spiegel mitochondrienassoziierter Gene im Herzen 7 Tage nach der Operation (TAC + Mock, n = 12; TAC + FK, n = 6). (f) TUNEL-Färbung (grün) mit Kernfärbung mit DAPI (blau) und WGA-Färbung (rot), die die Umrisse von Kardiomyozyten in Mäusen zeigt, die mit FK866 oder Schein 4 Tage nach der TAC-Operation behandelt wurden. Maßstabsbalken, 40 μm. (g) Quantifizierung von TUNEL-positiven Kardiomyozyten im Herzen 4 Tage nach der Operation (TAC + Schein, n = 6; TAC + FK, n = 5). *P < 0,05, **P < 0,01, NS, nicht signifikant.

Um weiter zu beurteilen, ob die Abnahme der myokardialen NMN- und NAD+-Spiegel bei mit FK866 behandelten TAC-operierten Mäusen eine kardiale Dekompensation verursachte, verabreichten wir diesen Mäusen intraperitoneal NMN oder Spott. Die NMN-Behandlung verbesserte die echokardiographischen Parameter wie LVEDD und %FS signifikant (Ergänzungstabelle 3) und verhinderte einen vorzeitigen Tod bei mit FK866 behandelten TAC-operierten Mäusen (Abb. 5a). Die NMN-Behandlung stellte die Myokardkonzentration von NAD+ (Abb. 5b), die Deacetylaseaktivität von Sirt1 (Abb. 5c), den Acetylierungsgrad von FoxO1 (Abb. 5d) und die Expressionsniveaus von Genen, die für die Mitochondrienfunktion relevant sind, wie Sod2, Ppargc1a, Tfam, wieder her. Pparg, Esrra und mt-Co3 (Abb. 5e) und die Anzahl der TUNEL-positiven Kardiomyozyten (Abb. 5f, g). Insgesamt legen diese Ergebnisse nahe, dass die Nampt-abhängige Biosynthese von NAD+ für die myokardiale Sirt1-Deacetylaseaktivität und den funktionellen Ausgleich bei Drucküberlastung bei Mäusen essentiell ist.

Prävention einer FK866-induzierten Herzdekompensation durch NMN-Verabreichung bei drucküberlasteten Mäusen.

(a) Kaplan-Meier-Überlebenskurven von TAC-operierten Mäusen, die mit FK866 (FK) + NMN (n = 9) oder FK + Mock (n = 8) behandelt wurden. (b) NAD+-Konzentrationen im Herzen 7 Tage nach der Operation (n = 5). (c) Sirt1-Deacetylase-Aktivität im Herzen 7 Tage nach der Operation (FK + NMN, n = 7; FK + Schein, n = 6). (d) Immunoblot-Analyse von Ac-FoxO1 und FoxO1 in Herzen 7 Tage nach der Operation (FK + NMN, n = 5; FK + Schein, n = 5). Die Quantifizierungen von Ac-FoxO1/FoxO1 werden als Balkendiagramme angezeigt. (e) Die mRNA-Spiegel mitochondrienassoziierter Gene im Herzen 7 Tage nach der Operation (n = 4). (f) TUNEL-Färbung (grün) mit Kernfärbung mit DAPI (blau) und WGA-Färbung (rot), die die Umrisse von Kardiomyozyten in Mäusen zeigt, die 4 Tage nach der TAC-Operation mit FK + NMN oder FK + Mock behandelt wurden. Maßstabsbalken, 40 μm. (g) Quantifizierung von TUNEL-positiven Kardiomyozyten im Herzen 4 Tage nach der Operation (n = 5). *P < 0,05, **P < 0,01.

Der Anstieg der Nampt-Expression in Monozyten und der Plasma-eNampt-Konzentration deutete auf einen ursächlichen Zusammenhang zwischen von Monozyten abgeleitetem eNampt und der Nampt-abhängigen funktionellen Kompensation bei Drucküberlastung hin. Um die Bedeutung von Monozyten-abgeleitetem eNampt in diesem Prozess zu testen, haben wir Monozyten/Makrophagen durch Behandlung mit Clodronat-Liposomen (CloLip) bei Mäusen abgereichert18. Wir haben durch durchflusszytometrische Analyse bestätigt, dass CloLip bei nicht operierten Mäusen 1 Tag nach Beginn der Behandlung eine etwa 3,2-fache Verringerung des Prozentsatzes der zirkulierenden CD11b+-, F4/80+-Monozyten hervorrief (Abb. 6a, ergänzende Abbildung 4a). Der Prozentsatz der CD11b+-, F4/80+-Monozyten war 5 Tage nach der TAC-Operation um etwa das 3,1-fache erhöht, wurde jedoch durch die gleichzeitige Behandlung mit CloLip um etwa das 1,6-fache verringert (Abb. 6a, ergänzende Abbildung 4b). Im Gegensatz dazu wurden die Populationen von CD11b+-, F4/80-Zellen und CD11b-, F4/80-Zellen nach der CloLip-Behandlung nicht signifikant verändert (ergänzende Abbildung 4). Mit CloLip behandelte Mäuse wurden lethargisch und etwa 75 % der mit CloLip behandelten Mäuse starben innerhalb von 5 Tagen nach der TAC-Operation, obwohl mit Kontrollliposomen (CntrlLip) behandelte Mäuse normal erschienen (Abb. 6b). Die echokardiographische Untersuchung ergab einen signifikanten Anstieg des LVEDD und einen signifikanten Rückgang des % FS bei mit CloLip behandelten Mäusen, während diese Parameter bei mit CntrlLip behandelten Mäusen unverändert blieben (Ergänzungstabelle 4). Die CloLip-Behandlung induzierte eine signifikante Abnahme des Plasma-eNampt-Proteins (Abb. 6c), ohne eine signifikante Veränderung des kardialen iNampt-Proteins (Abb. 6d), was zu einer signifikanten Abnahme der NAD+-Konzentration (Abb. 6e) und der Deacetylaseaktivität von Sirt1 (Abb. 6f) und ein Anstieg des Acetylierungsgrads von FoxO1 (Abb. 6g). Die CloLip-induzierte Reduktion von NAD+ führte zu einem signifikanten Anstieg der Anzahl TUNEL-positiver Kardiomyozyten (Abb. 6h,i). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die durch Clodronat-Liposomen vermittelte Reduktion von CD11b+-Zellen das Plasma-eNampt-Protein verringerte und dadurch eine kardiale Dekompensation bei drucküberlasteten Mäusen induzierte.

Herzdekompensation durch Behandlung mit CloLip bei drucküberlasteten Mäusen.

(a) Repräsentative durchflusszytometrische Analyse, die CD11b+-, F4/80+-Monozyten im peripheren Blut von Mäusen 1 Tag nach der Behandlung mit Clodronat-Liposomen (CloLip) oder Kontrollliposomen (CntrlLip) und TAC-operierten Mäusen 5 Tage nach der Operation und Behandlung mit zeigt CloLip oder CntrlLip. (b) Kaplan-Meier-Überlebenskurven von TAC-operierten Mäusen, die mit CloLip (n = 12) oder CntrlLip (n = 8) behandelt wurden. (c) Immunoblot-Analyse von eNampt im Plasma 5 Tage nach der TAC-Operation (CloLip, n = 5; CntrlLip, n = 4). Die Quantifizierungen des eNampt werden als Balkendiagramme angezeigt. (d) Immunoblot-Analyse von iNampt in Herzen 5 Tage nach der TAC-Operation (CloLip, n = 5; CntrlLip, n = 4). Die Quantifizierungen des Nampt/GAPDH werden als Balkendiagramme angezeigt. (e) NAD+-Konzentrationen im Herzen 5 Tage nach der TAC-Operation (CloLip, n = 5; CntrlLip, n = 7). (f) Sirt1-Deacetylase-Aktivität im Herzen 5 Tage nach der TAC-Operation (CloLip, n = 5; CntrlLip, n = 4). (g) Immunblot-Analyse von Ac-FoxO1 und FoxO1 in Herzen 5 Tage nach der TAC-Operation (CloLip, n = 4; CntrlLip, n = 4). Die Quantifizierungen von Ac-FoxO1/FoxO1 werden als Balkendiagramme angezeigt. (h) TUNEL-Färbung (grün) mit Kernfärbung mit DAPI (blau) und WGA-Färbung (rot), die die Umrisse von Kardiomyozyten in TAC-operierten Mäusen 2 Tage nach der Operation und Behandlung mit Clodronat-Liposomen (CloLip) oder Kontrollliposomen (CntrlLip) zeigt ). Maßstabsbalken, 40 μm. (i) Quantifizierung von TUNEL-positiven Kardiomyozyten 2 Tage nach der TAC-Operation (CloLip, n = 5; CntrlLip, n = 6). *P < 0,05, **P < 0,01, NS, nicht signifikant.

Wir untersuchten außerdem, ob die NMN-Behandlung eine CloLip-induzierte kardiale Dekompensation bei drucküberlasteten Mäusen verhinderte. Die NMN-Behandlung verbesserte die echokardiographischen Parameter wie LVEDD und %FS signifikant (Ergänzungstabelle 4) und verhinderte einen vorzeitigen Tod bei mit CloLip behandelten TAC-operierten Mäusen (Abb. 7a). Die NMN-Behandlung stellte die Myokardkonzentration von NAD+ (Abb. 7b), die Deacetylaseaktivität von Sirt1 (Abb. 7c), den Acetylierungsgrad von FoxO1 (Abb. 7d) und die Anzahl der TUNEL-positiven Kardiomyozyten (Abb. 7e, f) wieder her. Insgesamt legen diese Ergebnisse nahe, dass aus Monozyten gewonnenes eNampt für die myokardiale Synthese von NAD+ entscheidend ist, die für die funktionelle Kompensation einer Drucküberlastung bei Mäusen ausreicht.

Prävention einer CloLip-induzierten Herzdekompensation durch NMN-Verabreichung bei drucküberlasteten Mäusen.

(a) Kaplan-Meier-Überlebenskurven von TAC-operierten Mäusen, die mit CloLip + NMN (n = 12) oder CloLip + Mock (n = 24) behandelt wurden. (b) NAD+-Konzentrationen im Herzen 5 Tage nach der TAC-Operation (CloLip + NMN, n = 3; CloLip + Mock, n = 5). (c) Sirt1-Deacetylase-Aktivität im Herzen 5 Tage nach der TAC-Operation (n = 4). (d) Immunoblot-Analyse von Ac-FoxO1 und FoxO1 in Herzen 5 Tage nach der TAC-Operation (n = 4). Die Quantifizierungen von Ac-FoxO1/FoxO1 werden als Balkendiagramme angezeigt. (e) TUNEL-Färbung (grün) mit Kernfärbung mit DAPI (blau) und WGA-Färbung (rot), die die Umrisse von Kardiomyozyten in TAC-operierten Mäusen 2 Tage nach der Operation und Behandlung mit CloLip + NMN oder CloLip + Mock zeigt. Maßstabsbalken, 40 μm. (f) Quantifizierung von TUNEL-positiven Kardiomyozyten im Herzen 5 Tage nach der TAC-Operation (n = 5). *P < 0,05, **P < 0,01.

Die Kompensation des Myokards bei erhöhter Arbeitsbelastung wird durch komplexe und integrative Prozesse erreicht, an denen nicht nur eine Reihe intrazellulärer Signalwege, sondern auch interzelluläre und intergewebeübergreifende Kommunikationsnetzwerke beteiligt sind. Unsere vorliegende Studie zeigt einen bisher unbekannten Mechanismus der gewebeübergreifenden Regulierung der Herzhomöostase durch zirkulierende Monozyten. Wir liefern den Beweis, dass ein Anstieg des zirkulierenden NMN, der durch die Hochregulierung von Monozyten-abgeleitetem eNampt vermittelt wird, eine Abnahme der myokardialen iNampt-Expression ausgleicht, um den myokardialen NAD+-Spiegel bei drucküberlasteten Mäusen aufrechtzuerhalten (Abb. 8).

Homöostatischer Mechanismus der von Monozyten abgeleiteten eNampt-abhängigen Biosynthese von myokardialem NAD+ bei der Herzkompensation bei Drucküberlastung.

(a) Drucküberlastung verringert die kardiale iNampt-Expression, aber die myokardiale NAD+-Konzentration und die Sirt1-Deacetylase-Aktivität bleiben unverändert. Die Hochregulierung des von Monozyten abgeleiteten eNampt trägt zur Erhaltung der myokardialen NAD+-Spiegel und zur funktionellen Kompensation bei Drucküberlastung bei. (b) Die pharmakologische Hemmung von Nampt durch FK866 oder die Depletion von Monozyten durch CloLip unterdrückt die kompensatorische Hochregulierung des von Monozyten abgeleiteten eNampt und stört den homöostatischen Mechanismus der myokardialen NAD+-Spiegel und der Sirt1-Aktivität, was zu einer durch Drucküberlastung verursachten kardialen Dekompensation führt. (c) Die systemische Verabreichung von NMN stellt die myokardialen NAD+-Spiegel und die Sirt1-Aktivität wieder her und verhindert eine FK866- oder CloLip-induzierte kardiale Dekompensation bis hin zur Drucküberlastung.

Es wurde berichtet, dass eine Herunterregulierung von Nampt den apoptotischen Zelltod in kultivierten Kardiomyozyten neugeborener Ratten erhöhte11 und wir beobachteten auch, dass die Nampt-abhängige Biosynthese von NAD+ vor DOX-induzierter Kardiotoxizität schützte. Eine kardiale Überexpression von Nampt oder die Verabreichung von NMN erhöhte die myokardialen NAD+-Spiegel und schützte das Herz vor Ischämie oder Ischämie-/Reperfusionsschäden bei Mäusen, was darauf hindeutet, dass Nampt für die myokardiale NAD+-Synthese und den Kardioprotektionsmechanismus in gestressten Herzen von entscheidender Bedeutung ist11,12. Andererseits haben Pillai et al. berichteten, dass die herzspezifische Überexpression von Nampt bei Mäusen spontan eine Herzhypertrophie und interstitielle Fibrose induzierte und dass der heterozygote Knockout von Nampt die durch Isoproterenol und Angiotensin II induzierte Herzhypertrophie abschwächte, was darauf hinweist, dass Nampt ein positiver Regulator der nachteiligen Herzumgestaltung ist9. In Anbetracht der von Pillai et al. berichteten viel höheren Expressionsniveaus von myokardialem Nampt bei Mäusen könnte eine übermäßige Produktion von Nampt schädlich für die Herzpathophysiologie sein. Unsere vorliegenden Daten bringen unser Verständnis der bisher umstrittenen Rolle von Nampt bei der Stressreaktion auf hämodynamische Überlastung deutlich voran und zeigen, dass die Hemmung von Nampt in der frühen Phase der Drucküberlastung eine kardiale Dekompensation auslöste.

Kürzlich wurde berichtet, dass eNampt wie Zytokine und Wachstumsfaktoren direkt auf Zellen einwirkt, die Wirkungen von eNampt auf Kardiomyozyten sind jedoch rätselhaft. Die Behandlung mit eNampt schwächte die H2O2-induzierte Apoptose in H9c2-Kardiomyozyten ab19 und die intravenöse Verabreichung von eNampt zum Zeitpunkt der Reperfusion verringerte die Myokardinfarktgröße in einem Mausmodell für Ischämie/Reperfusion20. Im Gegenteil, Montecucco et al. berichteten, dass die pharmakologische Hemmung von Nampt die durch Neutrophile vermittelte Myokardschädigung in der frühen Phase der Reperfusion reduzierte21. Es blieb unklar, ob von Monozyten abgeleitetes eNampt biologische Auswirkungen auf Kardiomyozyten hat. Wir fanden jedoch heraus, dass die Plasma-NMN bei TAC-gesteuerten Mäusen signifikant erhöht war und dass die Behandlung neonataler Kardiomyozyten von Ratten mit TAC-gesteuertem Mäuseserum eine signifikant höhere Deacetylaseaktivität von Sirt1 induzierte. Daher könnte NMN durch eNampt auf systemischer Ebene extrazellulär aus NAM umgewandelt und nach dem Transportfluss in die Zellen über einen nicht identifizierten NMN-Transporter im Herzen als Substrat für die NAD+-Biosynthese verwendet werden. Weitere Studien mit ausgefeilten genetischen Modellen zur Löschung von Nampt speziell in Kardiomyozyten oder Monozyten sind erforderlich, um die kooperative Regulierung von myokardialem NAD+ durch iNampt und eNampt in Herzen zu untersuchen, die Drucküberlastung und Ischämie/Reperfusion ausgesetzt sind.

Die Nampt-abhängige NAD+-Biosynthese ist ein Schlüsselfaktor für die Deacetylaseaktivität von Sirtuinen6. Unsere Analyse der Sirt1-Deacetylase-Aktivität ergab, dass sie sowohl in vitro als auch in vivo ausnahmslos mit der myokardialen NAD+-Konzentration korrelierte. In einem Mausmodell für Ischämie/Reperfusion reduzierte die herzspezifische Überexpression von Sirt1 die Infarktgröße durch Aktivierung von FoxO1 und Mangansuperoxiddismutase, während die herzspezifische Ausschaltung von Sirt1 die Myokardschädigung verschlimmerte22. Bei der Entwicklung einer Herzhypertrophie bei Mäusen mit kardialer Überexpression von Sirt1 wurden jedoch widersprüchliche Phänotypen beobachtet, die auf Gendosen des Transgens zurückzuführen sind. Geringe bis mäßige Werte der Sirt1-Überexpression schwächten das altersabhängige Fortschreiten der kardialen Umgestaltung und Funktionsstörung ab, hohe Werte der Sirt1-Überexpression erhöhten jedoch den oxidativen Stress und die Apoptose, was zu kardialen Funktionsstörungen führte23,24. Die vorteilhaften Wirkungen von Sirt1 werden durch eine Kombination mehrerer Mechanismen vermittelt, wie z. B. die Deacetylierung des Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor-γ-Coaktivators-1α zur Modulierung der Mitochondrienfunktion16,25, die Hochregulierung der Mangansuperoxiddismutase zum Abfangen von ROS22,26 und die Deacetylierung von p53 Hemmung des apoptotischen Zelltods27 und der Deacetylierung von FoxO1 zur Auslösung von Autophagie28. Im Gegensatz dazu haben Oka et al. berichteten, dass überexprimiertes Sirt1 durch die Bildung eines Komplexes mit dem Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor-α die östrogenbezogenen Rezeptorwege unterdrückte, was zu einer mitochondrialen Dysfunktion und dem Fortschreiten der Herzinsuffizienz führte29. Bei TAC-operierten Mäusen korrelierten die Expressionsniveaus von Genen, die für die Mitochondrienfunktion relevant sind, mit der Sirt1-Deacetylaseaktivität, entweder wenn sie durch Behandlung mit FK866 verringert wurde oder wenn sie durch Behandlung mit NMN wiederhergestellt wurde, was die Möglichkeit einer Nampt-abhängigen Biosynthese unterstützt Myokardiales NAD+ ist an der Regulierung der Mitochondrienfunktion beteiligt. Da berichtet wurde, dass Sirt3 und Sirt7 sowie Sirt1 eine vorteilhafte Rolle im Herzen spielen15, sind weitere Studien erforderlich, um das Gesamtbild der Kompensationsmechanismen zu verstehen, die durch die eNampt-abhängige Biosynthese von NAD+ und die NAD+-abhängige Aktivierung von Sirt1 und anderen erleichtert werden Sirtuine in drucküberlasteten Herzen.

Im Gehirn und in der Bauchspeicheldrüse sind die Basalexpressionsniveaus von iNampt extrem niedrig und zirkulierendes NMN, das durch Plasma-eNampt aufrechterhalten wird, fungiert als essentielles Substrat für die intrazelluläre NAD+-Biosynthese7. Aktuelle Studien haben die Wirksamkeit einer NMN-Supplementierung zur Wiederherstellung von NAD+ in diesen Geweben gezeigt7,10,30,31. Unter pathologischen Bedingungen, bei denen die NMN-Spiegel im Blutkreislauf sinken, kann eine NMN-Supplementierung einen therapeutischen Nutzen bringen. Es wurde berichtet, dass der Spiegel des Nampt-Proteins sowie des NAD+ mit zunehmendem Alter in mehreren Geweben abnimmt10,32. Wir beobachteten, dass ältere Mäuse im Vergleich zu jungen Mäusen einen signifikanten Rückgang der Konzentrationen an myokardialem NAD+ und Plasma-eNampt-Protein zeigten, obwohl die Konzentrationen an myokardialem iNampt-Protein unverändert blieben (Ergänzende Abbildung S5). Es ist bekannt, dass die Prävalenz von Herzinsuffizienz mit zunehmendem Alter zunimmt und dass ältere Patienten mit Herzinsuffizienz eine schlechtere Prognose haben als jüngere33. Es ist sinnvoll anzunehmen, dass ein altersabhängiger Rückgang der eNampt-vermittelten NMN-Versorgung zu einem Rückgang des myokardialen NAD+ führen könnte, was zu einer erhöhten Anfälligkeit für Herzinsuffizienz mit höherer Morbidität und Mortalität bei älteren Menschen führt. Darüber hinaus hat eine aktuelle Studie gezeigt, dass hohe Plasma-eNampt-Spiegel mit einem günstigen klinischen Ergebnis bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie verbunden sind34 und unsere Studie könnte eine wahrscheinliche mechanistische Erklärung für die Korrelation zwischen Plasma-eNampt und Herzinsuffizienz-Phänotypen liefern. Unsere Studie beleuchtete einen neuartigen Mechanismus der zirkulierenden eNampt-vermittelten Regulierung von myokardialem NAD+ unter Stressbedingungen und eröffnete die Möglichkeit zu untersuchen, ob die Wiederherstellung von myokardialem NAD+ ein therapeutisches Potenzial für Herzinsuffizienz hat.

Alle Experimente wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Universität Osaka genehmigt und gemäß den Richtlinien der Universität Osaka durchgeführt. C57BL/6J-Mäuse wurden von CLEA Japan, Inc. gekauft. Für die TAC-Operation anästhesierten wir 8 bis 9 Wochen alte männliche Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Medetomidinhydrochlorid (0,3 mg/kg), Midazolam (4 mg/kg) und Butorphanol ( 5 mg/kg)35 und die Anästhesie wurde durch Kneifen des Zehs überwacht. Die Atmung wurde künstlich mit einem Atemzugvolumen von 0,2 ml und einer Atemfrequenz von 110 Atemzügen/min kontrolliert. Nach der medianen Sternotomie wurde die transversale Aorta zwischen den Ästen der rechten Arteria brachiocephalica und der linken A. carotis communis mit 7–0-Seidenfäden eingeengt, indem die Aorta mit einer stumpfen 27-Gauge-Nadel geschient wurde, die nach der Abbindung entfernt wurde. Anschließend wurde der Brustkorb verschlossen und die Mäuse konnten sich von der Narkose erholen, während ihre Körpertemperatur bei 37 °C gehalten wurde. Postoperative Analgetika (Meloxicam, 5 mg/kg/24 h) wurden 48 h lang subkutan verabreicht. Der Chirurg hatte keine Informationen über die in dieser Studie verwendeten Mäuse. Um die Nampt-abhängige Biosynthese von NAD+ in vivo zu hemmen, verabreichten wir Mäusen für die Dauer des Experiments FK866 (10 mg/kg/Tag) oder Scheinöl (Maisöl) durch intraperitoneale Injektion36. Zur NMN-Behandlung verabreichten wir für die Dauer des Experiments zweimal täglich NMN (500 mg/kg) oder Scheinlösung (normale Kochsalzlösung) durch intraperitoneale Injektion10,30. Clodronat und Kontrollliposomen (Clophosome, Combo Kit) wurden von FormuMax Scientific, Inc. gekauft. Um die Depletion von Monozyten und Makrophagen zu induzieren, wurde eine Dosis von 25 μl Clodronat oder Kontrollliposomen intraperitoneal verabreicht. Zur Beurteilung der Herzdimensionen und Kontraktilität wurde eine transthorakale Echokardiographie an wachen Mäusen mit einem Vevo 770-Bildgebungssystem unter Verwendung einer 25-MHz-Linearsonde (Visual Sonics Inc.) durchgeführt. Mäuse wurden getötet, um nach 24-stündigem Hungern Gewebeproben zu sammeln.

Die Experimente für Primärkulturen von Kardiomyozyten wurden vom Animal Study Committee der Universität Osaka genehmigt und gemäß den Richtlinien der Universität Osaka durchgeführt. Kurz gesagt, die Euthanasie bei zervikaler Luxation wurde von einem geschulten Personal vor der Entnahme des Herzgewebes von 1 Tag alten Wistar-Ratten gemäß den Richtlinien der American Veterinary Medical Association für die Euthanasie von Tieren durchgeführt. Die Ventrikel wurden zerkleinert und in Ca2+-freier Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) (Hyclone) mit 0,1 % Trypsin (Hyclone) und 70 E/ml Kollagenase (Worthington Biochemical Corp.) verdaut. Kardiomyozyten wurden nach der Vorplattierung angereichert, bei einer Felddichte von 1 × 105 Zellen/cm2 ausplattiert und in DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (BGS), 24 Stunden lang kultiviert. Nach 24-stündigem Serummangel (1 % BGS) wurden die Kardiomyozyten mit DOX (1 μM für 3 Stunden) und dem allosterischen Nampt-Inhibitor FK866 (500 nM für 24 Stunden) oder NMN (500 μM für 24 Stunden) stimuliert10. DOX wurde von Sigma-Aldrich gekauft und FK866 und NMN wurden von Cayman Chemical bzw. Sigma-Aldrich gekauft. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mithilfe des CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega) bestimmt, der auf der metabolischen Umwandlung einer Tetrazoliumverbindung MTS in ein gefärbtes Produkt durch lebende Zellen basiert.

Die Zellen wurden lysiert und die Gewebe in Puffer (20 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 8,0, 100 mM Na3VO4, 0,5 % Nonidet P-40 und Complete Mini Proteaseinhibitor (Roche Applied Science)) homogenisiert. Zum Nachweis von Ac-FoxO1 wurden Gewebe in Puffer mit 10 mM NAM und 1 μM Trichostatin A homogenisiert. Zur Kernfraktionierung wurden die Zellen in Puffer (10 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,5 mM DTT) lysiert , 0,05 % Nonidet P-40, 10 mM NAM, 1 μM Trichostatin A und Complete Mini-Proteaseinhibitor), 10 Min. bei 4 °C inkubiert und 10 Min. bei 4 °C und 800 g zentrifugiert. Das Pellet wurde in Puffer (50 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 % Natriumdesoxycholat, 1 % Nonidet P-40 und 0,1 % SDS, 10 mM NAM, 1 μM Trichostatin A und Complete Mini-Proteaseinhibitor) resuspendiert und inkubiert 30 Minuten bei 4 °C und 20 Minuten bei 4 °C und 10.400 g zentrifugiert. Der Überstand wurde als Kernfraktion aliquotiert. Zur Vorbereitung von Proteinproben aus Mausplasma, überflüssigem Plasmaprotein (Albumin, IgM, IgG, IgA, Haptoglobin, Transferrin, α1-Antitrypsin, Fibrinogen, α 2-Makroglobulin, α1-Säureglykoprotein, Apolipoprotein AI, Apolipoprotein AII, Komplement C3 und Transthyretin ) wurde unter Verwendung des Multiple Affinity Removal Spin Cartridge System (Agilent Technologies) gemäß den Anweisungen des Herstellers abgereichert.

Proteinproben wurden mit SDS-PAGE fraktioniert und auf PVDF-Membranen (GE Healthcare Biosciences) übertragen. Die gebloteten Membranen wurden mit primärem Antikörper inkubiert, gefolgt von Meerrettichperoxidase-konjugiertem Anti-Maus- oder Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.). Immunreaktive Signale wurden mit dem ECL Plus Western Blotting Detection System (GE Healthcare Biosciences) nachgewiesen und mit einem Lumino-Image-Analysator (ImageQuant LAS 4000 mini; GE Healthcare Biosciences) visualisiert. Folgende Primärantikörper wurden verwendet: polyklonaler Kaninchen-Anti-PBEF-Antikörper (Bethyl Laboratories, Inc.), polyklonaler Kaninchen-Anti-Sirt1-Antikörper (Merck Millipore), polyklonaler Kaninchen-Anti-GAPDH-Antikörper (Abcam), polyklonaler Kaninchen-Anti-Ac-FoxO1-Antikörper ( Santa Cruz Biotechnology, Inc.), monoklonaler Kaninchen-Anti-FoxO1-Antikörper (Cell Signaling Technology, Inc.), polyklonaler Kaninchen-Anti-Ac-K-Antikörper (Cell Signaling Technology, Inc.) und monoklonaler Kaninchen-Anti-Histon-H3-Antikörper (Cell Signaling). Technologie, Inc.).

Die Gesamt-RNA wurde mit dem TRIzol-Reagenz (Life Technologies, Inc.) extrahiert und mit DNase behandelt, um kontaminierende genomische DNA unter Verwendung des TURBO DNA-free Kit (Life Technologies, Inc.) zu entfernen. Einzelsträngige cDNA wurde unter Verwendung des SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit (Life Technologies, Inc) gemäß dem Protokoll des Herstellers transkribiert. Wir führten eine quantitative Echtzeit-PCR-Analyse mit dem Light Cycler TaqMan Master Kit (Roche Applied Science) mit den zielspezifischen Primern und den passenden Sonden durch, die vom Universal ProbeLibrary System (Roche Applied Science) gemäß den Anweisungen des Herstellers entwickelt wurden. Die Amplifikationsbedingungen waren eine anfängliche Denaturierung für 10 Minuten bei 95 °C, gefolgt von 45 Zyklen von 10 Sekunden bei 95 °C und 25 Sekunden bei 60 °C. Einzelne PCR-Produkte wurden durch Schmelzpunktanalyse analysiert. Das Expressionsniveau eines Gens wurde im Vergleich zu dem von Maus-Gapdh und Ratten-28S-rRNA unter Verwendung einer vergleichenden Ct-Methode normalisiert. Die Primersequenzen und Universal Probe-Nummern wurden mit der ProbeFinder-Software wie folgt entworfen: Maus-Nampt, 5′-cctgttccaggctattctgttc-3′ und 5′-atggtctttcccccaagc-3′, Nr. 84; Maus Sirt1, 5′-cgtggagacatttttaatcaggta-3′ und 5′-gcttcatgatggcaagtgg-3′, Nr. 104; Maus-Gapdh, 5′-tgtccgtcgtggatctgac-3′ und 5′-cctgcttcaccaccttcttg-3′, Nr. 80; Maus Sod2, 5′-gacccattgcaaggaacaa-3′ und 5′-gtagtaagcgtgctcccacac-3′, Nr. 3; Maus Ppargc1a, 5′-gaaagggccaaacagagaga-3′ und 5′-gtaaatcacacggcgctctt-3′, Nr. 29; Maus-Tfam, 5′-caaaggatgattcggctcag-3′ und 5′-aagctgaatatatgcctgcttttg-3′, Nr. 94; Maus-Pparg, 5′-aagacaacggacaaatcacca-3′ und 5′-gggggtgatatgtttgaacttg-3′, Nr. 7; Maus Nrf-1, 5′-tggagtccaagatgctaatgg-3′ und 5′-gcgaggctggttaccaca-3′, Nr. 100; Maus-Esrra, 5′-ccttccctgctggacctc-3′ und 5′-cgacaccagagcgttcact-3′, Nr. 78; Maus mt-Co3, 5′-tagcctcgtaccaacacatga-3′ und 5′-agtggtgaaattcctgttgga-3′, Nr. 66; Maus-Itgam, 5′-aaggatgctggggaggtc-3′ und 5′-gtcataagtgacagtgctctggat-3′, Nr. 16; Maus-Emr1, 5′-cctggacgaatcctgtgaag-3′ und 5′-ggtgggaccacagagagttg-3′, Nr. 1; Ratten-28S-rRNA, 5′-gctggctaggcagacaacat-3′ und 5′-gacctgacgatgacagaggaa-3′, Nr. 107; Ratte Sod2, 5′-tggacaaacctgagccctaa-3′ und 5′-gacccaaagtcacgcttgata-3′, Nr. 67; Ratte Ppargc1a, 5′-aaagggccaagcagagaga-3′ und 5′-gtaaatcacacggcgctctt-3′, Nr. 29; Ratten-Tfam, 5′-tcggtcagcatataacatttacg-3′ und 5′-caagcctgatttacaagcttca-3′, Nr. 79; Ratten-Pparg, 5′-cccaatggttgctgattaca-3′ und 5′-ggacgcaggctctactttga-3′, Nr. 125; Ratte Nrf1, 5′-atagtcctgtctggggaaacc-3′ und 5′-tccatgcatgaactccatct-3′, Nr. 109; Ratte Esrra, 5′-ggtggacccattgccttt-3′ und 5′-caccagggcgttaactgg-3′, Nr. 78; Ratte mt-Co3, 5′-taaacccaagcccatgacc-3′ und 5′-agccggatgtaagtagaagagc-3′, Nr. 92.

Die NAD+- und NMN-Werte wurden unter Verwendung eines HPLC-Systems (Shiseido Co., Ltd.) mit einer CAPCELL PAK C18 MGIII S5-Säule (15 cm × 2,0 mm; Shiseido) und einer YMC-Pack Pro C18 RS-Säule (15 cm × 4,6 mm) bestimmt ; YMC Co., Ltd.), wie zuvor beschrieben10. Gefrorene Gewebe oder frisch gesammeltes Plasma von Mäusen oder kultivierte Kardiomyozyten wurden in 1 M Perchlorsäure (200 μl/10 mg Gewebe, 100 μl/10 μl Plasma, 500 μl/6 cm Schale) extrahiert. Die Extrakte wurden 10 Minuten lang bei 4 °C mit 15.000 U/min zentrifugiert und die resultierenden Überstände 10 Minuten lang in 3 M K2CO3 auf Eis neutralisiert. Nach der Klärung der Extrakte wurden Aliquots von 100 μl mit 50 μl Puffer A (50 mM K2HPO4/KH2PO4, pH 7,0) und 50 μl Wasser gemischt. Für die NAD+-Messung wurde die HPLC bei einer Flussrate von 200 μl/min mit 100 % Puffer A von 0–5 Minuten und einem linearen Gradienten zu 95 % Puffer A/5 % Puffer B (100 % Methanol) von 5–6 Minuten durchgeführt Min., 95 % Puffer A/5 % Puffer B von 6–11 Min., ein linearer Gradient zu 85 % Puffer A/15 % Puffer B von 11–13 Min., 85 % Puffer A/15 % Puffer B von 13–23 Min und ein linearer Gradient zu 100 % Puffer A von 23–24 Minuten. Für die NMN-Messung wurde die HPLC mit einer Flussrate von 700 μl/min mit 100 % Puffer A von 0–5 min, einem linearen Gradienten zu 60 % Puffer A/40 % Puffer B von 5–10 min, 60 % Puffer, durchgeführt A/40 % Puffer B von 10–32,5 Min., ein linearer Gradient zu 100 % Puffer A von 32,5–35 Min. NAD+ und NMN wurden normalerweise nach 14 bzw. 25 Minuten eluiert. Die NAD+- und NMN-Spiegel wurden anhand der Peakfläche im Vergleich zu einer Standardkurve quantifiziert und auf das Gewicht des gefrorenen Gewebes, das Plasmavolumen und die Anzahl der kultivierten Kardiomyozyten normalisiert.

Die Sirt-1-Deacetylaseaktivität wurde mit dem SIRT1 Fluorescent Activity Assay/Drug Discovery Kit (Enzo Life Science International) basierend auf dem Fluor de Lys-SIRT1-Substratpeptid bestimmt. Proteinextrakte (10 μg) aus Mäuseherzen oder neugeborenen Kardiomyozyten von Ratten wurden mit dem fluorogenen acetylierten Peptidsubstrat inkubiert. Die Reaktion wurde 1 Stunde lang bei 37 °C durchgeführt und das Fluoreszenzsignal wurde bei 360 nm Anregung und 460 nm Emission auf einem Fluoreszenzplattenlesegerät (SH-9000Lab, Hitachi High-Technologies Corporation) gemessen.

Peripheres Blut der Maus wurde gesammelt und die mononukleären Zellen wurden unter Verwendung von Histopaque 1083 (Sigma-Aldrich) abgetrennt. Kurz gesagt, 1 ml Vollblut wurde vorsichtig auf 5 ml Histopaque 1083 in einem Zentrifugenröhrchen geschichtet und das Röhrchen wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 400 g zentrifugiert. Die undurchsichtige Grenzfläche, die das mononukleäre Zellband enthielt, wurde mit einer Pasteurpipette gesammelt. Die Trennung der CD11b+-Monozyten erfolgte durch Sortierung mit dem MACS-System (Miltenyi Biotech). Die mononukleären Zellen wurden mit Ratten-Anti-CD11b-Antikörper (Merck Millipore) 20 Minuten bei 4 °C inkubiert, in PBS, ergänzt mit 3 % FBS, gewaschen, mit Anti-Ratten-Mikrokügelchen 20 Minuten bei 4 °C inkubiert und in PBS gewaschen ergänzt mit 3 % FBS. Die Proben wurden durch eine MACS-MS-Säule (Miltenyi Biotech) geleitet, die in einem Miltenyi-Magneten aufgestellt war, und CD11b+-Monozyten wurden durch Waschen mit PBS, ergänzt mit 3 % FBS, aus der Säule eluiert.

Der TUNEL-Assay mit Kernfärbung mit DAPI wurde unter Verwendung des In-situ-Apoptose-Nachweiskits (Takara Bio Inc.) durchgeführt. Die Herzen wurden herausgeschnitten und sofort in die Kryomischung Tissue-Tek OCT (Sakura Finetek Japan) eingebettet. Frisch gefrorene Schnitte von 5 μm wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur mit Aceton fixiert und dann 30 Minuten mit PBS gewaschen. Die Schnitte wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 0,3 % H2O2 in Methanol inkubiert, um endogene Peroxidase zu blockieren, und dann dreimal 5 Minuten lang mit PBS gewaschen. Nach 5-minütiger Inkubation in Permeabilisierungspuffer auf Eis wurden die Schnitte in eine befeuchtete Kammer gelegt und mit TdT-Enzym, einschließlich Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-konjugiertem dUTP, 60 Minuten bei 37 °C inkubiert. Um zwischen Apoptose in Myozyten und Nicht-Myozyten zu unterscheiden, wurden Gewebeschnitte außerdem 60 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Alexa Fluor 594-konjugiertem Weizenkeimagglutinin (WGA) (Life Technologies, Inc.) gefärbt und dann 5 Minuten lang dreimal mit PBS gewaschen Mindest. Abschließend wurden die Abschnitte mit ProLong Gold Antifade Reagent (Life Technologies, Inc.) montiert. Die Bilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop (FSX100; Olympus) und der Olympus FSX-BSW-Software (Olympus) aufgenommen.

Durch Herzpunktion gewonnenes Vollblut wurde mit EDTA gepuffert, einer Lyse roter Blutkörperchen unter Verwendung von BD FACS Lysing Solution (BD Biosciences) unterzogen und in PBS, ergänzt mit 3 % fötalem Kälberserum, gewaschen. Blutleukozyten wurden zunächst mit Ratten-Anti-Maus-FcR/III-Antikörper (2.4G2) (BD Biosciences) inkubiert, um die unspezifische Bindung des Antikörpers an FcR zu minimieren. Sie wurden weiter mit APC-konjugiertem Anti-CD11b-Antikörper (BD Biosciences) und PE-konjugiertem Anti-F4/80-Antikörper (BD Biosciences) 10 Minuten lang auf Eis inkubiert und mit PBS, ergänzt mit 3 % fötalem Kälberserum, gewaschen. Die Prozentsätze der CD11b+- und F4/80+-Zellen wurden mit dem FACS Canto II-Durchflusszytometer (BD Biosciences) unter Verwendung der EXPO32-Software (Beckman Coulter) analysiert.

Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Der Zwei-Gruppen-Vergleich wurde durch den ungepaarten zweiseitigen Student-t-Test analysiert, und der Mehrgruppen-Vergleich wurde durch eine 1-Wege-ANOVA gefolgt vom Tukey-Kramer-HSD-Test zum Vergleich der Mittelwerte durchgeführt. Wir haben die Überlebenskurven mit der Kaplan-Meier-Methode geschätzt und die Gruppen mit dem verallgemeinerten Wilcoxon-Test verglichen. Werte von P < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Zitierweise für diesen Artikel: Yano, M. et al. Die von Monozyten abgeleitete extrazelluläre Nampt-abhängige Biosynthese von NAD+ schützt das Herz vor Drucküberlastung. Wissenschaft. Rep. 5, 15857; doi: 10.1038/srep15857 (2015).

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Wir danken Y. Hamanaka für die technische Beratung und M. Shimizu, H. Taniwaki, K. Kawaguchi, N. Miyagawa und Y. Ueda für ihre hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse der Japan Society for the Promotion of Science (KAKENHI 23390213, 24659390, 26670395 an HA, KAKENHI 21229010 an IK) und AMED-CREST, Japan Agency for Medical Research and Development, unterstützt.

Abteilung für Herz-Kreislauf-Medizin, Osaka University Graduate School of Medicine, Osaka, 565-0871, Suita, Japan

Masamichi Yano, Toru Oka, Chizuru Yabumoto, Yoko Kudo-Sakamoto und Yasushi Sakata

Abteilung für Herz-Kreislauf-Medizin, Graduate School of Medicine, Universität Tokio, Tokio, 113-8655, Bunkyo-ku, Japan

Hiroshi Akazawa, Takehiro Kamo, Yu Shimizu, Hiroki Yagi, Atsuhiko T. Naito und Issei Komuro

Clinical Pharmacy Education Unit, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Universität Osaka, Osaka, 565-0871, Suita, Japan

Chizuru Yabumoto

Abteilung für kardiovaskuläre regenerative Medizin, Graduate School of Medicine der Universität Osaka, Osaka, 565-0871, Suita, Japan

Atsuhiko T. Naito & Jong-Kook Lee

Abteilung für fortgeschrittene klinische Wissenschaft und Therapie, Graduate School of Medicine, Universität Tokio, Tokio, 113-8655, Bunkkyo-ku, Japan

Jun-ichi Suzuki

AMED-CREST, Japanische Agentur für medizinische Forschung und Entwicklung, Tokio, 100-0004, Chiyoda-ku, Japan

Hiroshi Akazawa, Toru Oka, Atsuhiko T. Naito, Jong-Kook Lee und Issei Komuro

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HA und IK planten und gestalteten die Experimente. IK betreute das Projekt. YM, TO, CY und YK-S. führte die Experimente durch. TK, Y.Sh. und HY analysierte die Daten. ATN, JK.L., JS und Y.Sa. bei den Versuchen beraten. MY, HA und IK haben das Manuskript geschrieben.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Yano, M., Akazawa, H., Oka, T. et al. Die von Monozyten abgeleitete extrazelluläre Nampt-abhängige Biosynthese von NAD+ schützt das Herz vor Drucküberlastung. Sci Rep 5, 15857 (2015). https://doi.org/10.1038/srep15857

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Eingegangen: 17. Juli 2015

Angenommen: 5. Oktober 2015

Veröffentlicht: 2. November 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep15857

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