Jahr IL

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 600 (2023) Diesen Artikel zitieren

2 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Eine übermäßige Entzündung ist eine postulierte Ursache für schwere Erkrankungen und den Tod bei Infektionen mit Atemwegsviren. Als Reaktion auf eine schwere Influenzavirus-Infektion lösen adoptiv übertragene naive Hämagglutinin-spezifische CD4+-T-Zellen von CD4+-TCR-transgenen 6.5-Mäusen eine IFN-γ-produzierende Th1-Reaktion bei Wildtyp-Mäusen aus. Es hilft bei der Virusbeseitigung, verursacht aber auch Kollateralschäden und eine Verschlimmerung der Krankheit. Die Spendermäuse 6,5 haben alle CD4+ T-Zellen mit TCR-Spezifität gegenüber Influenza-Hämagglutinin. Dennoch leiden die infizierten 6,5 Mäuse nicht unter einer starken Entzündung und einem schwerwiegenden Ausgang. Die anfängliche Th1-Reaktion lässt mit der Zeit nach, und eine ausgeprägte Th17-Reaktion kürzlich ausgewanderter Thymusdrüsen lindert Entzündungen und verleiht Schutz bei 6,5 Mäusen. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass virales Neuraminidase-aktiviertes TGF-β der Th1-Zellen die Th17-Entwicklung steuert und die IL-17-Signalisierung über den nicht-kanonischen IL-17-Rezeptor EGFR das Gerüstprotein TRAF4 stärker als TRAF6 aktiviert, während die Lungenentzündung bei schweren Erkrankungen gelindert wird Grippe.

Atemwegsviren verursachen schwere neu auftretende Infektionskrankheiten. Das klinische Ergebnis hängt vom Zusammenspiel zwischen dem eindringenden Virus und der Immunantwort des Wirts ab. Eine Virusinvasion verursacht einen zytopathischen Effekt, der zu Gewebeschäden in den Atemwegen führt. Das Immunsystem des Wirts reagiert, um das Virus zu beseitigen, aber die Reaktion trägt auch zur Entzündung bei. Wenn die Immunaktivierung und die Entzündung mit der Beseitigung des Virus nachlassen, erholt sich die infizierte Person effizient von einer Infektion. Allerdings können Immunaktivierung und Entzündung über die Virus-Clearance hinaus bestehen bleiben. Eine längere und übertriebene Immunaktivierung führt zu einer Verschlimmerung der Krankheit. Beispiele sind die unerwünschten Folgen saisonaler oder pandemischer Influenzavirus-Infektionen, SARS, MERS und der anhaltenden COVID-19-Pandemien1. Die Modulation der Entzündung mit überwältigenden Immunreaktionen ist immer ein Ziel bei der Krankheitsbehandlung. Kortikosteroid als häufig eingesetztes Mittel zur Unterdrückung von Lungenentzündungen beeinträchtigt auch die Pathogenbeseitigung bei unterdrückter Entzündung und kann die Krankheit verschlimmern, wie bei Patienten mit schwerer Influenza2,3,4,5, SARS6, MERS7 und COVID-198 beobachtet wird.

Eine weitere Möglichkeit zur Unterdrückung von Entzündungen ist der gezielte Einsatz von Zytokinen. Tocilizumab und Sarilumab zielen auf Interleukin (IL)-6 ab und können COVID-19-Patienten helfen9. IL-17 ist auch ein bekanntes proinflammatorisches Zytokin10. Die hohen IL-17-Spiegel bei Patienten mit schweren Erkrankungen wie COVID-191,11,12, SARS13, MERS14 und Influenza15 machen IL-17 zu einem möglichen Ziel von Manipulationen16. Wir haben IL-17 in den Seren unserer Patienten mit schwerer COVID-1911-Erkrankung und auch in lungeninfiltrierenden Influenza-Antigen-spezifischen CD4+ T-Zellen in unserem experimentellen Mausmodell für schwere Influenza nachgewiesen17,18.

In unserem Influenza-Hämagglutinin (HA)-Antigen-spezifischen Mausmodell löst das Influenzavirus eine Th1-Reaktion adoptiv übertragener naiver HA-spezifischer CD4+ T-Zellen in der Lunge aus17,18,19,20,21,22. Die 2,5 × 106 adoptiv übertragenen Spenderzellen helfen bei der Virusbeseitigung, verstärken jedoch Entzündungen in der Lunge und erhöhen die Mortalität. Eine Influenzavirus-Infektion der Spendermäuse, der HA-spezifischen CD4+-T-Zellrezeptor (TCR)-transgenen 6,5-Mäuse23, treibt die Aktivierung aller CD4+-T-Zellen in diesen Mäusen voran, da alle ihre CD4+-T-Zellen die für den HA spezifischen TCRs aufweisen Influenza-Virus. Mit einer so massiven Th1-Reaktion aller CD4+ T-Zellen in den infizierten 6,5 Mäusen erwarteten wir einen schwerwiegenden Ausgang. Obwohl sie zunächst mehr Körpergewicht verloren, litten sie unter einer leichten Lungenentzündung und erholten sich gut. Ihre Genesung war mit einer ausgeprägten Th17-Reaktion an den Tagen 6 und 9 verbunden. Hier untersuchten wir die Rolle der Th17-Reaktion beim Schutz von Mäusen vor schwerer Influenza. Wir haben eine Th1-gesteuerte Entwicklung der Th17-Reaktion gezeigt. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass virales Neuraminidase-aktiviertes TGF-β der Th1-Zellen die Th17-Entwicklung steuert. Die IL-17-Signalübertragung über den nicht-kanonischen IL-17-Rezeptor EGFR aktiviert das Gerüstprotein TRAF4 stärker als TRAF6 bei der Linderung von Lungenentzündungen bei schwerer Grippe.

In unserem Influenza-Hämagglutinin (HA)-Antigen-spezifischen Mausmodell17,18,19,20,21,22 erhielten Wildtyp-Mäuse einen adoptiven Transfer von 2,5 × 106 naiven HA-spezifischen 6,5 CD4+ T-Zellen von 6,5 Spendermäusen (WT-Mäuse +). 6,5 Zellen) und erhielt 2,5 × 103 Plaque-bildende Einheiten (pfu) PR8-Stamm einer H1N1-Influenzavirus-Infektion. Lungeninfiltrierende HA-spezifische 6,5 CD4+ T-Zellen (Spender 6,5 Zellen) produzierten IFN-γ unter Induktion des Th1-Transkriptionsfaktors T-bet (Abb. 1a). Es gab eine IL-17-Produktion auf Basisniveau mit vernachlässigbarem Th17-Transkriptionsfaktor ROR-γt (Abb. 1a, Ergänzende Anmerkung 1, Ergänzende Abb. 1). Der adoptive Transfer verschlimmerte die Erkrankung von Wildtyp-Mäusen mit einer Influenzavirus-Infektion. Die Lungen waren entzündet (Abb. 1b) und lungeninfiltrierende Spender-6,5-Zellen erlangten am 6. Tag eine Effektorfunktion. Diese Zellen verstärkten die durch HA-Peptid stimulierte Proliferation verwandter naiver CD4+-T-Zellen in vitro (Abb. 1b). Auch die Viruslast in der Lunge nahm vom 3. zum 9. Tag ab, wie im Plaque-Assay gezeigt (Abb. 1c). Die Mäuse verloren bis zum 8. Tag weiter an Körpergewicht, als einige von ihnen zu sterben begannen (Abb. 1c).

a–c Th17-Reaktion und gelinderte Lungenentzündung bei HA-spezifischen CD4+ TCR-transgenen 6,5-Mäusen. a Th1- und Th17-Reaktionen von lungeninfiltrierenden HA-spezifischen CD4+ T-Zellen, b Obere Felder: grobe Lungenpathologie am Tag 6; Untere Felder: Naive HA-spezifische CD4+-T-Zell-Proliferation in vitro mit infektionsreagierenden Zellen aus Lunge oder Milz (c) Viruslast in der Lunge, Körpergewichtsverlust und Überleben. Nicht-transgene Wildtyp-Mäuse (WT) erhielten einen adoptiven Transfer von 2,5 × 106 naiven HA-spezifischen CD4+-T-Zellen mit Infektion, wie im Text beschrieben, und dienten als Kontrollen. d Verlorener Überlebensvorteil bei IL-17-Mangel bei TCR-transgenen 6,5-Mäusen. Schwerer Körpergewichtsverlust und Mortalität mit stärkerer entzündlicher Zytokinsekretion durch die lungeninfiltrierenden CD4+- und CD8+-T-Zellen bei infizierten IL-17KO-Mäusen als bei IL-17-kompetenten TCR-transgenen 6,5-Mäusen. Fotos sind repräsentativ und andere Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung von mindestens 3 Experimenten (n = 6/Gruppe; ***p < 0,0001; NS nicht signifikant, p > 0,05; zweiseitige P-Werte für ungepaarten t-Test bis). Vergleichen Sie zwei Gruppen zu einem bestimmten Zeitpunkt, Zwei-Wege-ANOVA für Körpergewichtskurven und Gehan-Breslow-Wilcoxon-Test für Überlebenskurven.

Die Spendermäuse der naiven HA-spezifischen 6,5-CD4+-T-Zellen, die 6,5-TCR-transgenen Mäuse, haben einen monotonen TCR auf ihren CD4+-T-Zellen, wobei der gleiche α/β-TCR auf ein MHC-Klasse-II-I-Ed-beschränktes Epitop des HA reagiert vom A/PR/8/34 (PR8) Stamm H1N1-Influenzavirus23. Wir erwarteten einen schwerwiegenden Ausgang einer Influenzavirus-Infektion bei den 6,5 Spendermäusen mit einer massiven Th1-Reaktion aller CD4+ T-Zellen bei den infizierten 6,5 Mäusen. Im Gegensatz zu unserer Erwartung wurde die ausgeprägte Th1-Reaktion mit IFN-γ-Produktion nur am Tag 3 beobachtet, nicht jedoch danach an den Tagen 6 und 9 nach einer Infektion mit 2,5 × 103 pfu PR8-Virus (Abb. 1a). An den Tagen 6 und 9 produzierten mit der Aktivierung des Th17-Transkriptionsfaktors ROR-γt in 30–50 % der lungeninfiltrierenden CD4+-T-Zellen 25–40 % von ihnen stattdessen IL-17 (Abb. 1a, Ergänzende Anmerkung 1, Ergänzend). Abb. 2). Infizierte 6,5 Mäuse zeigten eine gelinderte Lungenentzündung (Abb. 1b) und ihre lungeninfiltrierenden CD4+ T-Zellen erlangten am 6. Tag eine regulatorische Funktion. Diese Zellen unterdrückten die durch HA-Peptid stimulierte Proliferation naiver verwandter CD4+ T-Zellen in vitro (Abb. 1b). . Infizierte 6,5 Mäuse verloren am dritten Tag erheblich an Körpergewicht. Sie erholten sich vom Gewichtsverlust und alle Mäuse überlebten die Infektion (Abb. 1c). Am 9. Tag befanden sich keine lebenden Viren in der Lunge (Abb. 1c).

IL-17 (Interleukin-17A) ist ein bekanntes entzündungsförderndes Zytokin, das zur Pathogenese vieler entzündlicher Erkrankungen beiträgt11,12,13,14,15,16. Bei den infizierten 6,5 Mäusen ist jedoch eine deutliche IL-17-Reaktion von lungeninfiltrierenden CD4+-T-Zellen mit einer Linderung der Lungenentzündung verbunden. Die Linderung von Lungenentzündungen und der Schutz vor einer Influenzavirus-Infektion gingen bei IL-17-Knockout (KO) 6,5-Mäusen verloren. Mit 2,5 × 103 pfu PR8-Influenzavirus erkrankten IL-17KO 6,5-Mäuse schwer. Die lungeninfiltrierenden IL-17KO CD4+- und CD8+-T-Zellen produzierten am 6. Tag mehr entzündliche Zytokine IFN-γ und TNF-α (Abb. 1d).

Aktivierte CD4+-T-Zellen dehnen sich zunächst aus, gefolgt von einer Kontraktion des Zellpools. Die durch Influenzaviren bedingte Aktivierung der adoptiv übertragenen naiven HA-spezifischen 6,5-CD4+-T-Zellen folgte während unserer Experimente auch einem ähnlichen Trend bei infizierten Wildtyp-Mäusen (WT-Mäuse + 6,5-Zellen). Der Spender-6,5-Zellpool dehnte sich zunächst aus und zog sich dann in der Lunge von Wildtyp-Mäusen zusammen (Abb. 2a). Im Gegensatz dazu verringerte sich die Lungen-infiltrierende CD4+-T-Zellpopulation bei den infizierten 6,5 Mäusen in den ersten 4 Tagen. Dann begann es anzusteigen und kehrte am 11. Tag nach der Infektion auf das Niveau vor der Infektion zurück (Abb. 2a). Zellen aus dem Thymus von 6,5 Mäusen, den neuen Thymus-Auswanderern, könnten die Population lungeninfiltrierender CD4+-T-Zellen wieder auffüllen. Wir testeten daher das CD24- und Qa2-Expressionsprofil der lungeninfiltrierenden CD4+-T-Zellen in infizierten 6,5 Mäusen. Es ist bekannt, dass die reifen Thymozyten einen hohen CD24-Gehalt und einen minimalen Qa2-Wert exprimieren. Die CD4+- oder CD8+-T-Zellen verlieren mit der Zeit nach ihrer Freisetzung an die Peripherie CD24 und gewinnen an Qa2-Expression24. Unter den lungeninfiltrierenden CD4+ T-Zellen der infizierten 6,5 Mäuse fanden wir am Tag 6 eine höhere CD24- und niedrigere Qa2-Expression auf der Oberfläche der IL-17-produzierenden Zellen als der IFN-γ-produzierenden Zellen (Abb. 2a).

a Kürzlich ausgewanderte Thymusdrüsen sezernieren mehr IL-17 und weniger IFN-γ in den infizierten Lungen von 6,5 Mäusen: Linkes Feld: Kinetik der lungeninfiltrierenden HA-spezifischen CD4+-T-Zellpopulation in infizierten 6,5 Mäusen. Als Kontrollen dienten WT-Mäuse mit adoptiv übertragenen Zellen, wie im Text beschrieben. Mittleres und rechtes Feld: CD24- und Qa2-Expressionsprofile von IL-17 oder IFN-γ, die lungeninfiltrierende CD4+-T-Zellen in infizierten 6,5 Mäusen produzieren. b–d Durch die Thymektomie wird die Versorgung mit kürzlich ausgewanderten Thymuszellen unterbrochen, und 6,5 thymektomierte Mäuse leiden an einer schweren Erkrankung mit geringerer IL-17-Produktion: b IL-17- und IFN-γ-Produktion mit ROR-γt- und T-bet-Induktion von lungeninfiltrierendem HA- spezifische CD4+ T-Zellen und c Viruslast in der Lunge am Tag 7. d Körpergewichtsverlust nach Infektion. Als Kontrollen dienten 6,5 Mäuse ohne Thymektomie. WT-Mäuse mit adoptiv übertragenen Zellen dienten als weitere Gruppe von Kontrollmäusen, wie im Text beschrieben. Histogramme und Punktdiagramme sind repräsentativ, und andere Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung von mindestens 3 Experimenten (n = 6/Gruppe; ***p < 0,0001; zweiseitige P-Werte für ungepaarten t-Test zum Vergleich zweier Gruppen bei a spezifischer Zeitpunkt, Zwei-Wege-ANOVA für Körpergewichtskurven).

Um den obigen Befund zu bestätigen, der darauf hindeutet, dass die jüngsten Thymusauswanderer die Quelle von IL-17 in der Lunge von infizierten 6,5 Mäusen sind, führten wir eine Thymektomie bei 2 Wochen alten 6,5 Mäusen durch und infizierten die thymektomierten 6,5 Mäuse nach zweiwöchiger Genesung Operation. Unter Thymektomie versteht man die chirurgische Entfernung der Thymusdrüse. Damit entfällt die Versorgung mit Thymusauswanderern. Nach einer PR8-Influenzavirus-Infektion mit 2,5 × 103 pfu zeigten 6,5 thymektomierte Mäuse am 7. Tag eine geringere ROR-γt-Induktion und IL-17-Produktion in den lungeninfiltrierenden CD4+-T-Zellen (Abb. 2b). Die Anteile der IFN-γ-produzierenden Zellen wurden durch die Thymektomie nicht verändert, und ~15 % der lungeninfiltrierenden CD4+-T-Zellen produzierten zu diesem Zeitpunkt IFN-γ in den thymektomierten und nicht thymektomierten 6,5 Mäusen (Abb. 2b). Infolgedessen wurde durch die Thymektomie die IL-17-Dominanz in infizierten 6,5-Mäusen ausgelöscht und die Verteilung zwischen IL-17 und IFN-γ auf ein ähnliches Muster wie bei Spender-6,5-Zellen in infizierten Wildtyp-Mäusen zurückgeführt (Abb. 2b). Mit dieser veränderten Th-Reaktion führte die Thymektomie bei den infizierten 6,5 Mäusen zu einer höheren Viruslast in der Lunge (Abb. 2c) und zu einer Verschlimmerung der Erkrankung mit mehr Körpergewichtsverlust (Abb. 2d). Diese Ergebnisse bestätigen unsere Erkenntnisse, die darauf schließen lassen, dass Th17 eine Schutzreaktion kürzlicher Thymus-Auswanderer bei infizierten 6,5-Mäusen ist.

Die Thymusinvolution führt mit zunehmendem Alter zu einem geringeren Angebot an Thymusauswanderern. Ähnlich wie bei Wildtyp-Mäusen gab es bei 4 Wochen alten 6,5-Mäusen etwa 50 Millionen Thymozyten. Die Zahl sank auf 40 Millionen bei 8 Wochen alten und 20 Millionen bei 12 Wochen alten 6,5 Mäusen. Bei 40 Wochen alten 6,5 Mäusen gab es nur 10 Millionen Thymozyten (Abb. 3a). Darüber hinaus gab es mit zunehmendem Alter weniger CD4+CD8+-doppelpositive Zellen in CD3+-Thymozyten (Abb. 3b). Eine Influenzavirus-Infektion löste bei 6,5 Jahre alten Mäusen eine geringere Th17-Reaktion aus als bei 6,5 Jahre alten Mäusen. Etwa 30 % der lungeninfiltrierenden CD4+-T-Zellen produzierten IL-17 in 4 oder 8 Wochen alten 6,5 Mäusen am Tag 7 nach der Infektion mit 2,5 × 103 pfu PR8-Influenzavirus. Die Zahl sank bei 12 Wochen alten Mäusen auf weniger als 20 % und bei 40 Wochen alten 6,5 Mäusen auf etwa 10 % (Abb. 3c, d). Der Prozentsatz der IFN-γ-produzierenden Zellen änderte sich jedoch nicht mit dem Alter, und etwa 10–12 % der lungeninfiltrierenden CD4+-T-Zellen produzierten IFN-γ bei den 4–40 Wochen alten 6,5 Mäusen (Abb. 3c, d). . Da sich der Prozentsatz der IFN-γ-produzierenden Zellen mit dem Alter nicht änderte, nahm auch die IL-17-Dominanz gegenüber der IFN-γ-Produktion mit dem Alter ab (Abb. 3e). Die Viruslast in der Lunge war am Tag 7 nach der Infektion bei alten 6,5 Mäusen höher als bei jungen (Abb. 3f). Alte 6,5-Mäuse litten an einer schwereren Erkrankung als junge 6,5-Mäuse, mit verzögerter Erholung des Gewichtsverlusts (Abb. 3g).

a Thymozytenzahlen und b CD4+CD8+-Zellprozentsatz in CD3+-Thymozyten bei gesunden, nicht infizierten 6,5 Mäusen des angegebenen Alters. c Punktdiagramme und d-Balkendiagramme zeigen abnehmende IL-17- und anhaltende IFN-γ-Reaktionen von lungeninfiltrierenden HA-spezifischen CD4+-T-Zellen im Alter von 6,5 Mäusen am Tag 7 nach der Infektion. e Verlorene Dominanz der IL-17-Reaktion gegenüber der IFN-γ-Reaktion von lungeninfiltrierenden HA-spezifischen CD4+-T-Zellen im Alter von 6,5 Mäusen am Tag 7 nach der Infektion. f Höhere Viruslast in der Lunge am Tag 7 nach der Infektion und g verzögerte Erholung des Körpergewichtsverlusts mit zunehmendem Alter bei infizierten 6,5 Mäusen. Punktdiagramme sind repräsentativ und andere Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung von mindestens 3 Experimenten (n = 6/Gruppe; ***p < 0,0001; *p < 0,01; NS nicht signifikant, p > 0,05; zweiseitiges P Werte für den ungepaarten t-Test zum Vergleich zweier Gruppen zu einem bestimmten Zeitpunkt, Zwei-Wege-ANOVA für Körpergewichtskurven).

Wir entwickelten ein Experiment mit zwei adoptiven Transfers von naiven HA-spezifischen 6,5 CD4+ T-Zellen in infizierte Wildtyp-Mäuse (WT-Mäuse + 2 Chargen von 6,5 Zellen), um sequentielle Thymus-Emigranten bei 6,5 Mäusen nachzuahmen (Abb. 4a). Die mit der Infektion übertragenen Spender-6,5-Zellen differenzierten sich in IFN-γ-produzierende Th1-Zellen, und die 4 Tage später übertragenen Spender-6,5-Zellen differenzierten sich am Tag 8 nach der Infektion in der Lunge von Wildtyp-Mäusen zu IL-17-produzierenden Th17-Zellen (Abb . 4a–c, Ergänzende Anmerkung 2, Ergänzende Abbildung 3). In Gegenwart von Th1-Zellen, die aus dem ersten Transfer stammten, produzierten 30 % der zweiten Transferzellen IL-17 und nur weniger als 2 % produzierten IFN-γ. Etwa 5 % der IL-17-produzierenden Zellen produzierten auch IFN-γ (Abb. 4d). Die zweiten Transferzellen veränderten auch den Phänotyp der ersten Transferzellen. Am Tag 8 nach der Infektion kam es zu einer Reduzierung der IFN-γ-Produktion um 40 % (Abb. 4d). Bei Einzeltransferkontrollen (WT-Mäuse + Einzelcharge 6,5-Zellen) waren die mit der Infektion oder an Tagen 4 nach der Infektion übertragenen Spender-6,5-Zellen prominente IFN-γ-produzierende Th1-Zellen am Tag 8 nach der Infektion in der Lunge von Wildtyp-Mäusen . Es gab nur einen geringfügigen Rückgang der IFN-γ-Produktion und einen geringfügigen Anstieg der IL-17-Produktion der am Tag 4 übertragenen Zellen im Vergleich zu den mit Infektion übertragenen Zellen. (Abb. 4).

a Linke Felder: Schematische Darstellung eines Experiments zum adoptiven Transfer von naiven HA-spezifischen CD4+-T-Zellen in zwei Chargen in infizierten Wildtyp-Mäusen, wie im Text beschrieben. Rechte Felder: Th17-Reaktion der Zellen der zweiten Charge in Gegenwart der Zellen der ersten Charge in der Lunge infizierter Wildtyp-Mäuse mit Zelltransfer in zwei Chargen. b IL-17- und c IFN-γ-Produktion der Zellen der ersten und zweiten Charge am 8. Tag in der Lunge infizierter Wildtyp-Mäuse mit einem HA-spezifischen CD4+-T-Zelltransfer in einer oder zwei Chargen. d IFN-γ-Koproduktion durch die IL-17-produzierenden HA-spezifischen CD4+-T-Zellen der zweiten Charge am Tag 8 in Gegenwart oder Abwesenheit adoptiv übertragener HA-spezifischer CD4+-T-Zellen der ersten Charge. e IFN-γ-Koproduktion durch die IL-17-produzierenden HA-spezifischen CD4+-T-Zellen der ersten Charge in Gegenwart oder Abwesenheit der Zellen der zweiten Charge zu diesem Zeitpunkt. Punktdiagramme sind repräsentativ und andere Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung von mindestens drei Experimenten (n = 6/Gruppe; ***p < 0,0001; *p < 0,01; NS nicht signifikant, p > 0,05; zweiseitiges P Werte für ungepaarten t-Test).

Im Experiment mit Wildtyp-Mäusen mit zwei adoptiven Transfers von naiven HA-spezifischen 6,5-CD4+-T-Zellen (WT-Mäuse + 2 Chargen von 6,5-Zellen) war die IL-17-produzierende Th17-Reaktion der 6,5-Zellen des zweiten Transferspenders assoziiert mit einer verringerten Dominanz von T-bet gegenüber ROR-γt (Abb. 5a, b). Es gab eine vergleichbare TCR-Signaltransduktion von der ZAP-70-Phosphorylierung bis zur Induktion des typischen Th1-Transkriptionsfaktors T-bet in Spender-6,5-Zellen beider Transfers (Abb. 5c). Mit der erheblichen T-bet-Induktion kam es zu einer starken Aktivierung des Th17-assoziierten Transkriptionsfaktors ROR-γt in den Spender-6,5-Zellen des zweiten Transfers (Abb. 5d). Die 6,5 Spenderzellen des zweiten Transfers produzierten IL-17 anstelle von IFN-γ mit der verringerten T-bet-Dominanz gegenüber ROR-γt (Abb. 5b – d). Darüber hinaus kam es in den 6,5 Spenderzellen des zweiten Transfers zu einer höheren Expression des induzierten regulatorischen T (iTreg)-Zellmarkers LAG-3 (Abb. 5e).

a Schematische Darstellung und Th17-Reaktion mit b reduzierter Dominanz von T-bet über ROR-γt der Spenderzellen der zweiten Charge im Adoptivtransferexperiment mit naiven HA-spezifischen CD4+-T-Zellen in zwei Chargen bei infizierten Wildtyp-Mäusen. c Vergleichbare Stärke des TCR-Signals von der ZAP70-Phosphorylierung bis zur T-bet-Induktion in den Th1-Zellen der ersten und der zweiten Th17-Charge in der Lunge am 8. Tag nach der Infektion. Die Zahlen stellen den MFI (mittlere Fluoreszenzintensität) der angegebenen Moleküle dar. d Unveränderte Foxp-3+-Populationsgröße mit höherer ROR-γt-Aktivierung der zweiten Charge im Vergleich zu den Spenderzellen der ersten Charge am Tag 8. e Höhere Expression des iTreg-Markers LAG-3 auf der Oberfläche der zweiten Charge im Vergleich zu Zu diesem Zeitpunkt waren bereits die Spenderzellen der ersten Charge vorhanden. f Erleichterte Wiederherstellung des Körpergewichtsverlusts und verbessertes Überleben infizierter Wildtyp-Mäuse mit zwei Chargen adoptivem Transfer naiver HA-spezifischer CD4+-T-Zellen im Vergleich zu Mäusen mit einem Transfer kognater Zellen in einer einzigen Charge. g Bruttolungenpathologie und pathologische Scores von Lungenschnitten und h Viruslast in der Lunge infizierter Wildtyp-Mäuse mit zwei Chargen naiver HA-spezifischer CD4+-T-Zell-Adoptionsübertragung im Vergleich zu Mäusen mit einer einzigen Charge verwandter Zellübertragung. Fotos, Histogramme und Punktdiagramme sind repräsentativ, und andere Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung von mindestens drei Experimenten (n = 6/Gruppe; ***p < 0,0001; **p < 0,001; *p < 0,01; NS nicht- signifikant, p > 0,05; zweiseitige P-Werte für den ungepaarten t-Test zum Vergleich zweier Gruppen zu einem bestimmten Zeitpunkt, zweiseitige ANOVA für Körpergewichtskurven und Gehan-Breslow-Wilcoxon-Test für Überlebenskurven).

Die zwei adoptiven Transfers von Spender-6,5-Zellen halfen den Empfänger-Wildtyp-Mäusen, sich effizienter von der Infektion zu erholen und ein besseres Überleben zu erzielen, im Vergleich zu den Mäusen mit nur einem Transfer von Spender-6,5-Zellen (Abb. 5f). Es gab einen verbesserten Schutz mit weniger Pathologie (Abb. 5g) und einer geringeren Viruslast in der Lunge am Tag 8 nach der Infektion (Abb. 5h).

Wir haben die schützende Rolle von IL-17 aus den Zellen der zweiten Charge im Experiment mit zwei adoptiven Transfers weiter definiert, indem wir Spender-6,5-Zellen von naiven IL-17KO-6,5-Mäusen im zweiten adoptiven Transfer verwendet haben ((WT-Mäuse + 1. Charge 6,5 Zellen +). 2. Charge IL-17KO 6,5-Zellen; Abb. 6a). Durch den Ersatz der zweiten Transferzellen durch IL-17KO-Donor-6,5-Zellen wurde der Schutz durch zwei Transfers von IL-17-kompetenten Donor-6,5-Zellen aufgehoben (Abb. 6b). Trotz erleichterter Virusbeseitigung Mit den Spender-IL-17KO-6,5-Zellen (Abb. 6c) litten die Mäuse an einer verschlimmerten Krankheit mit höherer Mortalität mit weniger IL-17 (Abb. 6d, f) und einer stärkeren entzündlichen IFN-γ-Produktion in den Spender-6,5-Zellen beider Transfers ( Abb. 6e, f).

a Schematische Darstellung und b verlorener Schutz des Adoptivtransfer-Experiments mit zwei Chargen bei infizierten Wildtyp-Mäusen mit adoptivem Transfer von naiven IL-17KO HA-spezifischen CD4+ T-Zellen in der zweiten Charge. c Viruslast am 8. Tag in der Lunge infizierter Wildtyp-Mäuse in einem naiven HA-spezifischen CD4+-T-Zelltransferexperiment mit zwei Chargen und IL-17KO- oder IL-17-kompetenten Zellen der zweiten Charge. d Unveränderte IL-17-Produktion durch die Zellen der ersten Charge und e gesteigerte IFN-γ-Produktion sowohl durch Zellen der ersten als auch der zweiten Charge mit dem naiven IL-17KO HA-spezifischen CD4+-T-Zelltransfer der zweiten Charge. f Repräsentative Punktdiagramme der IL-17- und IFN-γ-Produktion durch Zellen der ersten und zweiten Charge mit dem naiven IL-17-kompetenten oder IL-17KO-HA-spezifischen CD4+-T-Zelltransfer der zweiten Charge. Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung von mindestens drei Experimenten (n = 6/Gruppe; ***p < 0,0001; *p < 0,01; NS nicht signifikant, p > 0,05; zweiseitige P-Werte für den ungepaarten t-Test zum Vergleich zwei Gruppen zu einem bestimmten Zeitpunkt und Gehan-Breslow-Wilcoxon-Test für Überlebenskurven).

Die Neuraminidase des PR8-Influenzavirus aktiviert TGF-β der HA-spezifischen CD4+ T-Zellen18 und TGF-β ist ein unverzichtbares Zytokin für die Th17-Polarisierung in vitro25. Naive HA-spezifische 6,5 CD4+ T-Zellen wurden adoptiv in Wildtyp-Mäuse (WT-Mäuse + 6,5 Zellen) übertragen und die Mäuse erhielten eine Infektion mit 2,5 × 103 pfu des PR8-Virus. Die lungeninfiltrierenden Spender-6,5-Zellen hatten TGF-β am Tag 4 nach der Infektion in Wildtyp-Mäusen aktiviert (Abb. 7a). Sie wurden den damaligen Empfängermäusen zur Co-Kultur mit naiven 6,5 CD4+ T-Zellen in vitro entnommen. Ohne Co-Kultur waren die naiven 6,5 CD4+ T-Zellen Th1-Zellen und 16 % von ihnen produzierten IFN-γ nach 48-stündiger Stimulation mit dem PR8-Virus in vitro. Bei der Co-Kultivierung mit den am Tag 4 in die Lunge infiltrierenden 6,5-Zellen des Spenders wurden die naiven 6,5-CD4+-T-Zellen zu Th17-Zellen verzerrt. Etwa 20 % von ihnen produzierten IL-17 und nur 7 % von ihnen produzierten IFN-γ (Abb. 7b). Rekombinanter Maus-TGF-β-verstärkter Anti-TGF-β-Antikörper schwächte die IL-17-Produktion der 6,5 CD4+ T-Zellen ab (Abb. 7c). Das Vacciniavirus, das HA (Vac-HA) trägt, aktivierte adoptiv übertragene naive HA-spezifische 6,5 CD4+ T-Zellen in vivo mit einer vergleichbaren Amplitude wie das PR8-Influenzavirus. Da Vac-HA keine Neuraminidase enthält, erhielten Spender-6,5-Zellen kein aktiviertes TGF-β. Nach der Entnahme aus den Empfängermäusen am Tag 4 führten diese Vac-HA-aktivierten, lungeninfiltrierenden Spender-6,5-Zellen in der In-vitro-Kultur nicht zu einer Verschiebung der Th1-Zellen in Th17-Zellen (Abb. 7).

eine TGF-β-Aktivierung in den HA-spezifischen CD4+ T-Zellen durch das Influenzavirus, nicht jedoch durch das HA-inserierte Vacciniavirus (Vac-HA). Oberes Feld: Splenozyten von HA-spezifischen TCR-transgenen 6,5-Mäusen wurden über Nacht mit Influenza- oder Vac-HA-Virus stimuliert. Unteres Feld: Wildtyp-Mäuse erhielten einen adoptiven Transfer naiver HA-spezifischer CD4+-T-Zellen mit einer Influenza- oder Vac-HA-Virusinfektion, und Lungenzellen wurden am Tag 4 analysiert. b Die Lungenzellen von Tag 4 wurden mit naiven Splenozyten von HA-spezifischen gemischt TCR-transgene 6,5-Mäuse und 48 Stunden lang in vitro mit Influenzavirus stimuliert. c Die Zugabe von rekombinantem Maus-TGF-β verstärkte und Anti-Maus-TGF-β-Antikörper schwächte die IL-17-Produktion durch die HA-spezifischen CD4+-T-Zellen in der Co-Kultur ab. Histogramme und Punktdiagramme sind repräsentative Beispiele.

In unserem früheren Bericht haben wir eine verstärkte TGF-β-Aktivierung der HA-spezifischen CD4+ T-Zellen in Abwesenheit von IL-1018 gezeigt. Hier haben wir zwei Transfers von IL-10KO-Donor-6,5-Zellen in IL-10KO-Mäuse versucht (IL-10KO-Mäuse + 2 Chargen IL-10KO-6,5-Zellen; IL-10KO-Set), den ersten Transfer mit PR8-Influenzavirus-Infektion und den zweiten Transfer 4 Tage nach der Infektion. Zwei Transfers von IL-10-kompetenten Spender-6,5-Zellen in Wildtyp-Mäuse (WT-Mäuse + 2 Chargen von 6,5-Zellen; WT-Satz) dienten als Kontrollen (Abb. 8a, Ergänzende Anmerkung 3, Ergänzende Abb. 4). Es gab einen höheren aktiven TGF-β in den 6,5 Zellen des IL-10KO-Spenders des ersten Transfers in der IL-10KO-Einstellung ohne IL-10 im Vergleich zu den 6,5 Zellen des IL-10-kompetenten Spenders des ersten Transfers in der WT-Einstellung mit IL-10 (Abb. 8b). Darüber hinaus gab es in den 6,5 Zellen des IL-10KO-Spenders des zweiten Transfers in der IL-10KO-Einstellung ohne IL-10 einen höheren IL-17-Wert im Vergleich zu den 6,5 Zellen des IL-10-kompetenten Spenders des zweiten Transfers in der WT-Einstellung mit IL-10. Ungefähr 60 % der zweiten Transferzellen produzierten IL-17 in Abwesenheit von IL-10 am Tag 8 nach der Infektion, verglichen mit 25 % in der Umgebung mit IL-10 (Abb. 8c), und die IL-17-Produktion der Der zweite Transfer von Zellen war mit dem Schutz vor Influenzavirus-Infektionen bei IL-10KO-Mäusen verbunden (Ergänzende Anmerkung 3, Ergänzende Abbildung 4).

a–c Adoptivtransferexperiment mit zwei Chargen in Abwesenheit von IL-10. a Schematische Darstellung: Naive IL-10KO-HA-spezifische CD4+-T-Zellen wurden an den Tagen 0 und 4 nach der Infektion adoptiv in IL-10KO-Mäuse übertragen (IL-10KO-Set). Als Kontrolle dienten infizierte WT-Mäuse mit IL-10-kompetenten HA-spezifischen CD4+ T-Zellen (WT-Set). b Mehr TGF-β der IL-10KO-Spenderzellen der ersten Charge und c verstärkte Th17-Antwort der IL-10KO-Spenderzellen der zweiten Charge in IL-10KO, eingestellt am 8. Tag. d, e Adoptive-Transfer-Experiment mit zwei Chargen in Wild- Typ-Mäuse mit HA-insertierter Vaccinia-Virusinfektion (Vac-HA). d Keine Th17-Reaktion der Spenderzellen der zweiten Charge bei Mäusen mit Vac-HA-Infektion. Histogramme und Punktdiagramme sind repräsentativ, und andere Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung von mindestens drei Experimenten (n = 6/Gruppe; ***p < 0,0001; zweiseitige P-Werte für ungepaarten t-Test).

Als nächstes führten wir ein ähnliches Zwei-Transfer-Experiment im WT-Setting (WT-Mäuse + 2 Chargen von 6,5 Zellen) mit HA-inseriertem Vacciniavirus (Vac-HA) anstelle einer PR8-Influenzavirus-Infektion durch (Abb. 8d). Die Spender-6,5-Zellen beider Transfers, die mit der Infektion übertragen und am Tag 4 übertragen wurden, wurden durch die Vac-HA-Infektion in den Th1-Phänotyp aktiviert, wie erwartet, da auf den Spender-6,5-Zellen des ersten Transfers kein aktiver TGF-β vorhanden war (Abb. 8e).

Die Signalübertragung von IL-17 über seinen bekannten Rezeptor IL-17RA trägt zur Entzündung bei26. Der epidermale Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR; ErbB-1; HER1) wurde als nicht-kanonischer Rezeptor für IL-17 beschrieben. Es wurde gezeigt, dass die IL-17-Signalübertragung mit EGFR am Wundheilungsprozess beteiligt ist27. Wir infizierten 6,5 Mäuse mit 2,5 × 103 pfu des Influenzavirus-Stammes PR8. Wildtyp-Mäuse erhielten einen adoptiven Transfer von naiven 6,5-Spenderzellen mit der Infektion (WT-Mäuse + 6,5-Zellen; WT-Satz), und IL-17KO-Mäuse erhielten einen adoptiven Transfer von naiven IL-17KO-6,5-Spenderzellen mit der Infektion (IL-17KO-Mäuse). + IL-17KO 6,5 Zellen; IL-17KO-Set). Bei 6,5 Mäusen kam es nach der Influenzavirus-Infektion zu einer Hochregulierung von IL-17RA und EGFR auf den lungeninfiltrierenden CD4+-T-Zellen. IL-17RA wurde erst am Tag 3 nach der Infektion hochreguliert, danach jedoch nicht mehr. EGFR wurde von Tag 3 bis Tag 6 und Tag 9 nach der Infektion schrittweise hochreguliert (Abb. 9a). Vom 6. bis zum 9. Tag nach der Infektion war EGFR auf der Zelloberfläche häufiger anzutreffen als IL-17RA (Abb. 9b). Eine Hochregulierung von IL-17RA und EGFR erfolgte auch bei lungeninfiltrierenden Spenderzellen 6,5 und IL-17KO 6,5 des WT-Sets bzw. des IL-17KO-Sets (Abb. 9a, b, Ergänzende Anmerkung 4, Ergänzende Abb. 5). . Allerdings gab es am 6. Tag, jedoch nicht am 9. Tag im WT-Satz eine EGFR-Dominanz gegenüber IL-17RA auf Lungen-infiltrierenden CD4+-T-Zelloberflächen. An den Tagen 6 und 9 im IL-17KO-Satz gab es keine EGFR-Dominanz gegenüber IL-17RA (Abb. 9b).

a EGFR- und IL-17RA-Expression auf der Oberfläche von lungeninfiltrierenden CD4+-T-Zellen in infizierten TCR-transgenen 6.5-Mäusen, Wildtyp-Mäusen und IL-17KO-Mäusen. Als Kontrollen dienten nicht infizierte gesunde Mäuse (naiv). Balkendiagramme zeigen die Hoch- oder Herunterregulierung der EGFR- und IL-17RA-Expression mit der Zeit nach der Infektion bei diesen Mäusen. b Häufigkeit von EGFR als IL-17RA auf der Oberfläche von lungeninfiltrierenden CD4+-T-Zellen an den Tagen 6 und 9 nach der Infektion bei 6,5 Mäusen. c Höhere EGFR-Phosphorylierung von lungeninfiltrierenden CD4+-T-Zellen in den infizierten 6,5 Mäusen an den Tagen 6 und 9. d–e EGFR-Phosphorylierung in den 6,5 CD4+-T-Zellen nach 48-stündiger Stimulation mit 0,03 MOI PR8-Virus in vitro. Splenozyten von naiven IL-17-kompetenten und IL-17KO 6,5-Mäusen wurden stimuliert, und Splenozyten von Wildtyp-Mäusen dienten als Kontrollen. Wie im Text angegeben wurde der Kulturbedingung rekombinantes Maus-IL-17 (0,1 oder 1,0 μg/ml) oder Gefitinib (1,0 μM) zugesetzt. f Dominanz von TRAF4 gegenüber TRAF6 in der Lunge infizierter 6,5 Mäuse, im Gegensatz zur Dominanz von TRAF6 gegenüber TRAF4 in der Lunge infizierter Wildtyp- und IL-17KO-Mäuse, bestimmt durch mRNA-Spiegel in lungeninfiltrierenden CD4+-T-Zellen und im Text beschrieben. g Intrazelluläre Färbung von TRAF4 in den 6,5 CD4+ T-Zellen nach 48-stündiger Stimulation mit 0,03 MOI PR8-Virus in vitro. Splenozyten von naiven IL-17-kompetenten und IL-17KO 6,5-Mäusen wurden stimuliert, und Splenozyten von Wildtyp-Mäusen dienten als Kontrollen. Wie im Text angegeben wurde der Kulturbedingung rekombinantes Maus-IL-17 (0,1 oder 1,0 μg/ml) oder Gefitinib (1,0 μM) zugesetzt. h Co-Lokalisierung von EGFR und TRAF4 in 6.5-, IL-17KO 6.5- und Wildtyp-CD4+-T-Zellen nach 48-stündiger Stimulation mit 0,03 MOI PR8-Virus in vitro. Histogramme und Fotos sind repräsentativ, andere Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung von mindestens drei Experimenten. (n = 6/Gruppe; ***p < 0,0001; NS nicht signifikant, p > 0,05; zweiseitige P-Werte für ungepaarten t-Test).

Infizierte 6,5 Mäuse wiesen eine Fülle von EGFR auf der Oberfläche von lungeninfiltrierenden CD4+-T-Zellen auf, und dies war mit einer höheren Phosphorylierung von EGFR am 9. Tag als am 6. und 3. Tag verbunden. Im Gegensatz dazu wurde nur ein basisches Niveau an phosphoryliertem EGFR nachgewiesen Im lungeninfiltrierenden Spender wurden an den Tagen 3, 6 und 9 6,5 Zellen des WT-Sets und Spender-IL-17KO-Zellen des IL-17KO-Sets eingesetzt (Abb. 9c). Bei der Stimulation von Splenozyten von naiven 6,5-Mäusen, IL-17KO-6,5-Mäusen oder WT-Mäusen mit 0,03 MOI-Influenzavirus über 48 Stunden in vitro kam es zu einer stärkeren EGFR-Phosphorylierung von 6,5-CD4+-T-Zellen als von IL-17KO-6,5-CD4+-T-Zellen ( Abb. 9d). Das IL-17-Supplement steigerte die EGFR-Phosphorylierung von IL-17KO 6,5 CD4+ T-Zellen in dosisabhängiger Weise, stärkere Steigerung mit 1,0 als 0,1 μg/ml rekombinantem Maus-IL-17 (Abb. 9e). Der EGFR-Inhibitor Gefitinib milderte die EGFR-Phosphorylierung von 6,5 CD4+ T-Zellen und die IL-17-induzierte EGFR-Phosphorylierung von IL-17KO 6,5 CD4+ T-Zellen (Abb. 9e). Als Kontrollen dienten Wildtyp-CD4+-T-Zellen von naiven WT-Mäusen, bei denen die IL-17-Ergänzung die EGFR-Phosphorylierung verstärkte und Gefitinib abschwächte (Abb. 9e).

Die Familie der Tumornekrosefaktor-Rezeptor-assoziierten Faktoren (TRAF) (TRAF 1 bis 7) mit sieben Gerüstproteinen ist an verschiedenen zellulären physiologischen Prozessen beteiligt28. TRAFs moderieren als Adaptermoleküle viele Signalwege. TRAF4 und TRAF6 teilen sich die gleichen TRAF-Bindungsstellen, spielen jedoch unterschiedliche Rollen in der Pathogenese29,30. Eine quantitative Reverse-Transkriptions-PCR-Studie in Echtzeit an Lungenzellen des 6. Tages ergab eine Hochregulierung von TRAF4 und TRAF6 bei den infizierten 6,5 Mäusen. In den lungeninfiltrierenden CD4+ T-Zellen von infizierten 6,5 Mäusen war TRAF4 gegenüber TRAF6 dominant (Abb. 9f). Im Gegensatz dazu war TRAF6 gegenüber TRAF4 in den lungeninfiltrierenden Spender-6,5-CD4+-T-Zellen des infizierten Wildtyps (WT-Mäuse + 6,5 Zellen; WT-Satz) oder den Spender-IL-17KO-6,5-CD4+-T-Zellen infizierter IL-17KO-Mäuse (IL) dominant -17KO-Mäuse + IL-17KO 6,5 Zellen; IL-17KO-Satz; Abb. 9f). Bei einer ähnlichen In-vitro-Stimulation, wie oben beschrieben, zeigte die Durchflusszytometrie eine stärkere Hochregulierung des TRAF4-Proteins in 6,5- als IL-17KO-6,5-CD4+-T-Zellen (Abb. 9g). Die IL-17-Ergänzung steigerte die Hochregulierung von TRAF4 in IL-17KO 6,5 CD4+ T-Zellen in dosisabhängiger Weise, stärkere Steigerung mit 1,0 als 0,1 μg/ml rekombinantem Maus-IL-17 (Abb. 9g). Der EGFR-Inhibitor Gefitinib milderte die Hochregulierung von TRAF4 in 6,5 CD4+ T-Zellen und die durch IL-17 induzierte Hochregulierung von TRAF4 in IL-17KO 6,5 CD4+ T-Zellen (Abb. 9g). Als Kontrollen dienten Wildtyp-CD4+-T-Zellen von naiven WT-Mäusen, bei denen die IL-17-Ergänzung die TRAF4-Hochregulation verstärkte und Gefitinib abschwächte (Abb. 9g).

Die konfokale Mikroskopie ergab eine TRAF4-Translokation zum EGFR-Signalkomplex in den 6,5 CD4+ T-Zellen nach Stimulation von Splenozyten von naiven 6,5 Mäusen mit 0,03 MOI-Influenzavirus für 48 Stunden in vitro (Abb. 9h). Die Co-Lokalisierung von TRAF4 und EGFR war in den 6,5 CD4+ T-Zellen signifikanter als die der IL-17KO 6,5 CD4+ T-Zellen. Die IL-17-Ergänzung steigerte die Co-Lokalisierung von TRAF4 und EGFR in den stimulierten IL-17KO 6,5 CD4+ T-Zellen (Abb. 9h). Der EGFR-Inhibitor Gefitinib milderte die gemeinsame Lokalisierung von TRAF4 und EGFR in 6,5 CD4+ T-Zellen und die durch IL-17 induzierte gemeinsame Lokalisierung von TRAF4 und EGFR in IL-17KO 6,5 CD4+ T-Zellen (Abb. 9h).

Gefitinib ist ein EGFR-Inhibitor, der die Signalübertragung über den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) in Zielzellen unterbricht. Gefitinib verschlimmerte die Erkrankung einer Influenzavirus-Infektion bei Mäusen. Die Wirkung der EGFR-Hemmung mit Gefitinib war bei infizierten 6,5-Mäusen am höchsten, bei infizierten Wildtyp-Mäusen mäßig und bei infizierten IL-17KO-Mäusen vernachlässigbar (Abb. 10a). Bei den infizierten Wildtyp-Mäusen sorgte die intranasale IL-17-Ergänzung für einen gewissen Schutz, der durch die Behandlung mit Gefitinib verloren ging (Abb. 10b). Der entgangene Nutzen war mit einer veränderten Hochregulierung von TRAF4 und TRAF6 in der Lunge verbunden. Das IL-17-Supplement veränderte die TRAF6-Dominanz gegenüber TRAF4 in der Lunge infizierter Wildtyp-Mäuse, und die Veränderung wurde eingeschränkt, wenn das IL-17-Supplement zusammen mit einer Gefitinib-Behandlung verabreicht wurde (Abb. 10b).

Eine EGFR-Hemmung mit Gefitinib führte zu einem stärkeren Körpergewichtsverlust und einer höheren Mortalität bei mit dem Influenzavirus infizierten 6,5 Mäusen. Als Kontrolle dienten infizierte Wildtyp- und IL-17KO-Mäuse. b Die Behandlung mit Gefitinib verringerte auch den durch die IL-17-Ergänzung verliehenen Schutz und führte zu einem stärkeren Körpergewichtsverlust und einer höheren Sterblichkeit infizierter Wildtyp-Mäuse. Die Veränderungen waren mit einer veränderten TRAF4-Dominanz gegenüber TRAF6-mRNA-Spiegeln verbunden. Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung von mindestens drei Experimenten. (n = 6/Gruppe; ***p < 0,0001; NS nicht signifikant, p > 0,05; zweiseitige P-Werte für ungepaarten t-Test zum Vergleich zweier Gruppen zu einem bestimmten Zeitpunkt, Zwei-Wege-ANOVA für das Körpergewicht Kurven und Gehan-Breslow-Wilcoxon-Test für Überlebenskurven).

Hier haben wir gezeigt, dass der durch Influenzaviren aktivierte TGF-β der Th1-Zellen die Th17-Entwicklung neuer Thymus-Auswanderer steuert. Die IL-17-Signalübertragung über den nicht-kanonischen IL-17-Rezeptor EGFR aktiviert das Gerüstprotein TRAF4 stärker als TRAF6 bei der Linderung von Lungenentzündungen bei schwerer Grippe. Adoptiv übertragene HA-spezifische 6,5 CD4+ T-Zellen verursachten mit ihrer IFN-γ-produzierenden Th1-Reaktion auf die Infektion bei Wildtyp-Mäusen Kollateralschäden. Die Spendermäuse der naiven HA-spezifischen 6,5 CD4+ T-Zellen, die 6,5 TCR transgenen Mäuse, verfügen alle über CD4+ T-Zellen, die auf das HA-Antigen des Influenzavirus reagieren. Die überwältigende CD4+-T-Zell-Reaktion bei den infizierten 6,5 Mäusen würde mehr Schaden und eine schwerere Erkrankung verursachen. Zunächst kam es zu einer Verschlimmerung der Krankheit, aber die anschließende Entwicklung einer ausgeprägten Th17-Reaktion linderte die Krankheit und die 6,5 Mäuse hatten ein besseres Überleben als Wildtyp-Mäuse. Sowohl Th1- als auch Th17-CD4+-T-Zellen wurden für die Th1-Bindung mit vergleichbarer TCR-Signalisierung von der ZAP-70-Phosphorylierung bis zur T-bet-Induktion aktiviert. Die Th17-Entwicklung war mit einer Hochregulierung von ROR-γt und einer verringerten T-bet-Dominanz gegenüber ROR-γt verbunden. Thymektomie, Experimente mit alten Mäusen und wiederholte adoptive Transferexperimente zeigten, dass Th1-CD4+-T-Zellen die Th17-Entwicklung steuerten, verbunden mit viraler Neuraminidase-aktiviertem TGF-β auf den Th1-Zellen. Die IL-17-Signalisierung durch den EGFR erfolgte mit relativer Häufigkeit von EGFR zu IL-17RA bei 6,5 CD4+ TCR-transgenen Mäusen. Die Signalübertragung aktiviert das Gerüstprotein TRAF4 stärker als TRAF6. Die Gefitinib-Blockade dokumentierte die Bedeutung der IL-17-Signalübertragung durch EGFR bei der Linderung von Lungenentzündungen bei schwerer Grippe.

Sowohl IFNγ als auch IL-17 sind grundlegende Bestandteile des Zytokinsturms bei schwerer Influenza mit Lungenentzündung31. IFN-γ ist ein typisches Th1-Zytokin, das für die Virusclearance essentiell ist32. In unserem experimentellen System produzieren lungeninfiltrierende HA-spezifische CD4+ T-Zellen IFN-γ als Reaktion auf die Infektion17,18. Der Transkriptionsfaktor T-bet steuert die Bindung an die Th1-Linie und die IFN-γ-Produktion33,34. Hier stellten wir fest, dass unserer Th17-Entwicklung auch eine Th1-Bindung mit einer vergleichbaren Stärke der TCR-Signalisierung von der ZAP-70-Phosphorylierung bis zur T-bet-Induktion vorausging. TGF-β ist für die Th17-Polarisierung naiver CD4+ T-Zellen in vitro25 unverzichtbar. Wir haben gezeigt, dass virales Neuraminidase-aktiviertes TGF-β der Th1-CD4+-T-Zellen für die Th1-gesteuerte Entwicklung von Th17-Zellen essentiell ist. Die Th1-CD4+-T-Zellen steuerten die Aktivierung des Th17-spezifischen Transkriptionsfaktors ROR-γt und die Produktion des Th17-spezifischen Zytokins IL-17.

Es wurde gezeigt, dass der Th1-Transkriptionsfaktor T-bet die Differenzierung von Th2 und Th17 unterdrückt35,36. Allerdings wurde die Koproduktion von IFN-γ und IL-17 in menschlichen CD4+-T-Zellen nachgewiesen25,37 und die Koproduktion von IFN-γ und IL-10 wurde in murinen CD4+-T-Zellen dokumentiert18. Relative Expressionsniveaus der Transkriptionsfaktoren T-bet, GATA-3 und ROR-γt können ein Gleichgewicht zwischen verschiedenen Abstammungslinien des herkömmlichen Th1/Th2/Th17-Paradigmas feinabstimmen. Eine verminderte T-bet-Dominanz gegenüber GATA-3 und ROR-γt unterbindet die IFN-γ-Produktion von lungeninfiltrierenden HA-spezifischen CD4+ T-Zellen in unserem experimentellen System17. Hier haben wir im gleichen experimentellen System einer schweren Influenza eine Th17-Differenzierung mit verminderter Dominanz von T-bet gegenüber ROR-γt demonstriert. Diese übermäßige ROR-γt-Aktivierung trieb die Th1-gebundenen CD4+-T-Zellen in die Th17-Linie und unterdrückte die IFN-γ-Produktion.

Die Rolle von IL-17 blieb ungewiss. IL-17 steht im Zusammenhang mit lokalisierten Entzündungen und ist pathogen bei bestimmten Autoimmunerkrankungen, bei denen IL-17 an seinen kanonischen Rezeptor IL-17RA bindet und TRAF6 und die anschließende Signalkaskade aktiviert26,28,38. IL-17 wirkt bei anderen Erkrankungen entzündungshemmend39,40,41. IL-17 ist äußerst vielseitig und wurde auch mit anderen nicht-pathogenen Erkrankungen in Verbindung gebracht, darunter Gewebereparatur und Krebs42, bei denen IL-17 an rekrutiertes EGFR im Rezeptorkomplex bindet und TRAF4 und die anschließende Signalkaskade aktiviert27,39. Die Aktivierung von TRAF4 kann IL-17-vermittelte pathogene Prozesse einschränken30. Unsere HA-spezifischen Th17-Zellen ähnelten den nicht-pathogenen Th17-Zellen25, da sie kein IFN-γ produzieren und die Entzündung nicht verstärken. Es gab auch eine Signalübertragung durch EGFR und die anschließende Aktivierung von TRAF4. Die Th17-Reaktion linderte die Entzündung in unserem Mausmodell einer schweren Influenza.

Ältere Menschen haben ein höheres Risiko für eine schwere Grippe43. Sie litten auch unter einer übermäßigen Sterblichkeit während SARS und der anhaltenden COVID-19-Pandemie44,45, https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/need-extra-precautions/index.html; abgerufen am 23. August 2022. Ihre Begleiterkrankungen tragen zu dieser Tatsache bei, es kann aber auch zu einer Störung des Immunsystems kommen. Das Problem kann eine altersbedingte Rückbildung der Thymusdrüse und eine verringerte Thymusproduktion sein. Im Alter von 50 Jahren produziert der menschliche Thymus im Vergleich zu jungen Menschen nur 15–20 % der T-Zellen. Im Alter von 65 Jahren ist es fast nicht mehr in der Lage, neue T-Zellen zu bilden (Ref: 46). Die Thymusinvolution beginnt bei Mäusen im Alter von drei Monaten47. Die krankheitslindernden Th17-Zellen zeigten die Oberflächenmarker kürzlicher Thymus-Auswanderer. Durch die Thymektomie wurde die Th17-Reaktion aufgehoben und die Th17-Reaktion ließ mit zunehmendem Alter nach. Bei älteren Menschen kann es aufgrund des Verlusts der krankheitsmodifizierenden Th17-Zellen zu schweren Erkrankungen kommen. Unsere Ergebnisse geben Anlass zur Sorge hinsichtlich der Modulation der IL-17-Reaktion bei schweren Atemwegsinfektionen. Wir müssen vorsichtig sein, um eine unangemessene Zytokinmanipulation zu vermeiden, da IL-17 nicht unbedingt immer proinflammatorisch ist.

Alle Experimente mit Mäusen wurden gemäß den vom „Animal Care and Use Committee“ des Chang Gung Memorial Hospital genehmigten Protokollen durchgeführt (Genehmigungsnummer: IACUC 2016030301). Das Komitee bestätigte, dass alle Experimente mit Mäusen in strikter Übereinstimmung mit dem Tierschutzgesetz des Landwirtschaftsrates des Exekutiv-Yuan von Taiwan (ROC) und den im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren enthaltenen Richtlinien in der veröffentlichten Fassung durchgeführt wurden vom Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council, USA

Alle Mäuse hatten den genetischen Hintergrund C57BL/10.D2, und für die Experimente wurden 8–12 Wochen alte Mäuse beiderlei Geschlechts verwendet, außer in Experimenten mit alten Mäusen. Die TCR-transgene Mauslinie 6.5 exprimiert einen TCR, der ein I-Ed-beschränktes HA-Epitop (110SFERFEIFPKE120) von HA des PR8-Influenzavirus erkennt (großzügig bereitgestellt von H. Von Boehmer, Harvard University, Boston, MA). Die 6,5 Mäuse wurden mit syngenen IL17KO- oder IL10KO-Mäusen gekreuzt, um 6,5 IL17KO TCR-transgene bzw. 6,5 IL10 KO TCR-transgene Mäuse zu erzeugen. Syngene IL17KO-Mäuse wurden durch Kreuzung von IL17KO-Mäusen mit genetischem B6-Hintergrund (großzügig bereitgestellt von YC. Day, Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan) mit Mäusen mit genetischem Hintergrund C57BL/10.D2 über mehr als 9 Generationen hinweg erzeugt. Syngene IL10-KO- und 6,5-IL10-KO-TCR-transgene Mäuse wurden bereits früher beschrieben18. Die Mäuse wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten.

Der PR8-Stamm (A/PR/8/34) des Influenzavirus wurde in der Allantoisflüssigkeit von 10 Tage alten embryonierten Hühnereiern produziert und von einer Kerneinrichtung an der Chang Gung University, Taiwan, charakterisiert. Mäuse wurden über den intranasalen Weg während einer Anästhesie mit leichtem Isofluran (Aesica Queenborough Ltd., Kent, UK) mit 2,5 × 103 Plaque-bildenden Einheiten (pfus) in 50 μl PBS17,18,19,20,21,22,34 geimpft.

Das HA-inserierte Vacciniavirus48,49,50 wurde unter Verwendung von BCS-1-Zellen amplifiziert. Eine infektiöse Dosis von 1 × 106 Plaque-bildenden Einheiten (pfus) wurde intraperitoneal in 100 μl PBS injiziert.

Rekombinantes Maus-IL-17A (trägerfrei) wurde von BioLegend (San Diego, CA, USA; Kat.-Nr. 576006) erworben. Während der Anästhesie mit Isofluran (Aesica Queenborough Ltd., Kent, UK) wurde 5 Tage lang täglich eine geeignete Konzentration von IL-17A in 20 μl PBS über intranasale Route ergänzt.

Der EGFR-Inhibitor Gefitinib wurde von AstraZeneca bezogen. Zunächst wurde eine Stammlösung in DMSO hergestellt und Aliquots bei –80 °C aufbewahrt. Jeden Tag wurde eine frische Endlösung in PBS hergestellt und 100 mg/kg Gefitinib in 100 μl per Schlundsonde verabreicht.

Klonotypische HA-spezifische CD4+ TCR-transgene T-Zellen wurden aus gepoolten Milzen und Lymphknoten von HA-spezifischen CD4+ TCR-transgenen 6,5-Mäusen hergestellt17,18,19,20,21,22,34,48,49. Klonotypische IL17-KO- oder IL10-KO-HA-spezifische CD4+-TCR-transgene T-Zellen wurden aus gepoolten Milzen und Lymphknoten von 6,5 IL17-KO- bzw. 6,5 IL10-KO-TCR-transgenen Mäusen hergestellt. Klonotypische Prozentsätze wurden durch durchflusszytometrische Analyse bestimmt. Der naive Phänotyp wurde durch die Beurteilung der Profile der Aktivierungsmarker CD44 (Anti-Maus-CD44; 553133, BD Biosciences; Verdünnung = 1 zu 100) und CD62L (Anti-Maus-CD62L; 553150, BD Biosciences; Verdünnung = 1 zu 100) bestätigt. Auf eine Infektion reagierende 6,5-CD4+-T-Zellen wurden aus den Lungen infizierter HA-spezifischer CD4+-TCR-transgener 6,5-Mäuse entnommen. CD4+-T-Zellen wurden durch negative Selektion mit Magnetkügelchen angereichert und Spenderzellen wurden mit Fluorochrom-konjugierten Antikörpern gegen CD90.1 (Thy1.1; Anti-Maus-CD90.1; 554898, BD Biosciences; Verdünnung = 1 zu 1000) identifiziert CD90.2 (Thy1.2; Anti-Maus CD90.2; 553006; BD Biosciences; Verdünnung = 1 in 200). Für Einzelchargen-Transferexperimente wurden 2,5 × 106 klonotypische 6,5 CD4+ T-Zellen über die Schwanzvene in Thy1.2/Thy1.2+ Wildtyp-Empfängermäuse in 0,2 ml Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) injiziert. Für Transferexperimente mit zwei Chargen wurde eine erste Charge von 0,5 × 106 klonotypischen 6,5 CD4+ T-Zellen zum Zeitpunkt der Infektion injiziert, und eine zweite Charge von 1,5 × 106 klonotypischen 6,5 CD4+ T-Zellen wurde am Tag 4 der Infektion in Thy1 injiziert. 2/Thy1.2+ Wildtyp-Mäuse.

Klonotypische T-Zellen (1 × 107 Zellen/ml) wurden 10 Minuten lang mit 5 μM CFSE (5,6-Carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidylester; Molecular Probes, Eugene, OR, USA) in HBSS gefärbt. Die Zellen wurden dreimal mit HBSS gewaschen und CFSE-gefärbte 6,5 CD4+ T-Zellen (2,5 × 106) wurden über die Schwanzvene in Empfängermäuse übertragen.

Zellsuspensionen wurden auf Eis mit gesättigten Konzentrationen von Fluorochrom-markierten mAbs in FACS-Puffer (PBS plus 0,5 % BSA und 0,02 % NaN3) wie vom Hersteller empfohlen inkubiert. Spender-CD4+-T-Zellen wurden mithilfe der folgenden mAbs identifiziert: Biotin-konjugierter antiklonotypischer 6,5-TCR (bereitgestellt von H. Von Boehmer; Verdünnung = 1 zu 100), Avidin-PE (A1204, Caltag, Burlingame, CA; Verdünnung = 1 Zoll). 200) oder Streptavidin-APC (SA 1005, Caltag, Burlingame, CA; Verdünnung = 1 zu 200) und PerCP oder FITC-konjugiertes Anti-CD4 (553052 oder 553047, BD Biosciences; Verdünnungen = 1 zu 100 für beide). Alle Fluorochrom-konjugierten Antikörper stammten von BD Biosciences, mit Ausnahme von T-bet und der Maus-IgG1κ-Isotypkontrolle (45–5825, 45–4714, eBiosciences; Verdünnung = 1 zu 50 für beide), FITC-Phospho-EGFR (Tyr1068) Kaninchen Anti-Human, Maus (MA5-27995, Invitrogen; Verdünnung = 1 zu 10) und PE-TRAF4 (SC-390232, Santa Cruz Biotechnology; keine Verdünnung). Die Zellen wurden mit FACS CALIBUR erfasst und die Analyse mit der Software CellQuest Pro (BD Biosciences), FACSuite (BD Biosciences) oder FlowJo (Tree Star, Inc.) durchgeführt.

Einzelzellsuspensionen (5–10 × 106 Zellen, Vertiefung 1 in Platten mit 24 Vertiefungen) aus entnommenen Organen wurden 5 Stunden lang mit 10 μg ml-1 MHC-Klasse-II-beschränktem HA-Peptid (SFERFEIFPKE) in Gegenwart von 5 μg ml erneut stimuliert −1 Brefeldin A (SI-B7651, Sigma-Aldrich). Die Brefeldin-A-Konzentration wurde während der gesamten intrazellulären Zytokinfärbung aufrechterhalten. Restimulierte Zellen wurden wie oben beschrieben mit Anti-CD90.1 und Anti-CD4 oberflächengefärbt, in IC-Fixierungspuffer (00–8222, eBiosciences) fixiert, gewaschen und in enthaltendem Permeabilisierungspuffer (00–8333, eBiosciences) gefärbt Fluorochrom-konjugierte Antikörper gegen Zielzytokine. Für Foxp3 (11–5773, eBiosciences; Verdünnung = 1 zu 50) und T-bet wurden die Zellen oberflächengefärbt, fixiert und in Fixierungs-/Permeabilisierungspuffer (00-5523, eBiosciences) permeabilisiert, gewaschen und in Permeabilisierungspuffer gefärbt (00-8333, eBiosciences) mit Fluorochrom-konjugierten Antikörpern. In einigen Experimenten wurden Zellen ex vivo analysiert und ohne erneute Stimulation gefärbt.

Einzelzellsuspensionen wurden aus der Milz von HA-spezifischen TRC-transgenen 6,5-Mäusen hergestellt. Splenozyten (2,5 × 105) wurden 72 Stunden lang mit Klasse-II-beschränktem HA-Peptid (SFERFEIFPKE) bei 37 °C in Gegenwart von 5 % CO2 erneut stimuliert. Tritiiertes Thymidin wurde 18 Stunden vor der Ernte zugesetzt. Die in jeder Vertiefung in die DNA eingebaute Radioaktivitätsmenge wurde in einem Szintillationszähler gemessen, wie zuvor beschrieben17,34. Wir haben lungeninfiltrierende HA-spezifische CD4+-T-Zellen kokultiviert, die wie im Text beschrieben aus infizierten Mäusen gewonnen wurden, um ihren Einfluss auf die Proliferation zu messen.

Zur Zytokinproduktion wurden Einzelzellsuspensionen von Splenozyten (2,5 × 106 Zellen pro Vertiefung) von IL-17-kompetenten (IL-17+/+) 6,5 Mäusen mit Influenzavirus (PR8-Stamm; 0,03 (MOI) Multiplizität der Infektion) stimuliert ) in vollständigem RPMI-1640 für 48 Stunden in vitro, in Gegenwart von lungeninfiltrierenden HA-spezifischen 6,5 CD4+ T-Zellen von am 4. Tag infizierten Mäusen im Verhältnis 1:5. Als Kontrolle dienten naive Splenozyten ohne Zellen der infizierten Mäuse. Zu Beginn wurde der Kultur rekombinantes Maus-TGF-β (10 ng ml-1, GF346, Millipore) oder Anti-TGF-β (10 μgml-1, MAB1835, R&D) zugesetzt. Verwandtes HA-Peptid (100 μgml-1) wurde der Kultur für die letzten 5 Stunden zugesetzt. Brefeldin-A wurde für die letzten 3 Stunden der Stimulation zugegeben und die Zellen wurden dann für die intrazelluläre Färbung verarbeitet.

Für die TRAF4-Färbung werden Einzelzellsuspensionen von Splenozyten (2,5 × 106 Zellen pro Vertiefung) aus naivem WT, IL-17-kompetent (IL-17+/+) 6,5 oder IL-17-Knockout (IL-17−/−) verwendet. 6,5 Mäuse wurden mit Influenzavirus (PR8-Stamm; 0,03 (MOI) Infektionsmultiplizität) in vollständigem RPMI-1640 48 Stunden lang in vitro stimuliert. Zu Beginn wurde der Kultur rekombinantes Maus-IL-17 (0,1 oder 1,0 μgml-1; 576006, Biolegend) und/oder Gefitinib (0,1 oder 1,0 μgM; Iressa, AstraZeneca) zugesetzt. Verwandtes HA-Peptid (100 μgml-1) wurde der Kultur für die letzten 5 Stunden zugesetzt. Brefeldin-A wurde für die letzten 3 Stunden der Stimulation hinzugefügt und die Zellen wurden dann auf ähnliche Weise verarbeitet, wie wir es für die intrazelluläre Färbung getan haben.

Für die Färbung mit phosphoryliertem EGFR werden Einzelzellsuspensionen von Splenozyten (2,5 × 106 Zellen pro Vertiefung) aus naivem WT, IL-17-kompetentem (IL-17+/+) 6,5 oder IL-17-Knockout (IL-17−/ −) 6,5 Mäuse wurden mit Influenzavirus (PR8-Stamm; 0,03 (MOI) Multiplizität der Infektion) in vollständigem RPMI-1640 für 48 Stunden in vitro stimuliert. Zu Beginn wurde der Kultur rekombinantes Maus-IL-17 (0,1 oder 1,0 μgml-1; 576006, Biolegend) und/oder Gefitinib (0,1 oder 1,0 μgM; Iressa, AstraZeneca) zugesetzt. Verwandtes HA-Peptid (100 μgml-1) wurde der Kultur für die letzten 5 Stunden zugesetzt. Brefeldin-A wurde für die letzten 3 Stunden der Stimulation hinzugefügt und die Zellen wurden dann zur Färbung verarbeitet. Kurz gesagt, die Zellen wurden zunächst 30 Minuten lang in kalten Dauerwellenpuffer III (558050, BD Biosciences) gegeben, mit Färbepuffer (554657, BD Biosciences) gewaschen und mit FITC-Phospho-EGFR (Tyr1068) Rabbit anti-Human gefärbt. Maus (MA5-27995, Invitrogen; Verdünnung = 1 in 10) in Färbepuffer. Die Zellen wurden mit dem BD LSRFortessa™ Cell Analyzer für die Durchflusszytometrie erfasst oder in der konfokalen Mikroskopie (Leica) sichtbar gemacht.

Wir haben die Titer lebender Influenzaviren in den Organen infizierter Mäuse mithilfe eines modifizierten Plaque-Assays mit Madin-Darby-Hundenierenzellen (MDCK; The American Type Culture Collection) gemessen, wie bereits beschrieben17,18,19,20,21,22,34. Die Organe wurden zu den angegebenen Zeiten in 1 ml DMEM gesammelt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur Analyse bei –80 °C gelagert. Zehnfache Verdünnungen von Gewebehomogenaten wurden in DMEM, ergänzt mit 10 % FCS, Antibiotikum-Antimykotikum (15240-062, GIBCO BRL) und 0,00025 % Trypsin, hergestellt. Insgesamt 500 μl jeder Verdünnung wurden zu konfluenten Monoschichten von MDCK-Zellen in Platten mit 6 Vertiefungen gegeben und 1 Stunde lang bei 35 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Jede Vertiefung erhielt dann 2 ml Agar-Overlay (0,3 %) und wurde 3 Tage lang inkubiert. Die Zellen wurden mit 10 % Formalin fixiert, die Agarschicht wurde entfernt und die fixierten Monoschichten wurden mit Kristallviolett (0,02 % in 2 % Ethanol) angefärbt. Die Ergebnisse wurden als Plaque-bildende Einheit (PFU)/ml = (mittlere Anzahl von Plaques × 2) × (Verdünnungsfaktor − 1) dargestellt.

Die Lungen von Versuchsmäusen wurden am Tag 7 nach der Infektion entnommen und mit 10 % neutraler gepufferter Formalinlösung fixiert. Nach der Fixierung wurden die Lungen in Paraffin eingebettet und 5 μm-Schnitte geschnitten. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt und blind bewertet. Die Infiltration von Entzündungszellen, einschließlich Lymphozyten, Neutrophilen und Plasmazellen, wurde von Pathologen je nach Infiltrationsdichte separat als negativ, 1+, 2+ oder 3+ bewertet. Vaskulitis und Fibrose wurden je nach Schweregrad ebenfalls als negativ bewertet, 1+, 2+ oder 3+, wie zuvor beschrieben17,18,19,20,21,22,34. Die Gesamtentzündung in der Lunge wurde durch den Durchschnitt dieser Werte dargestellt.

Die Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Wir haben Graphpad Prism Version 8 für Student-t-Testanalysen verwendet, um zwei Gruppen zu einem bestimmten Zeitpunkt zu vergleichen. Wir haben auch die Zwei-Wege-ANOVA für die Körpergewichtskurven und den Gehan-Breslow-Wilcoxon-Test für die Überlebenskurven analysiert. Wir betrachteten p-Werte < 0,05 als signifikant.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Papier und seinen Zusatzinformationen verfügbar. Die numerischen Quelldaten für die Grafiken finden Sie in den Zusatzdaten 1.

Fajgenbaum, DC & June, CH Zytokinsturm. N. engl. J. Med. 383, 2255–2273 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ni, Y.-N. et al. Die Wirkung von Kortikosteroiden auf die Mortalität von Patienten mit Influenza-Pneumonie: eine systematische Überprüfung und Metaanalyse. Krit. Pflege 23, 99 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Cao, B. et al. Adjuvante Kortikosteroidbehandlung bei Erwachsenen mit viraler Influenza A (H7N9)-Pneumonie. Krit. Pflege Med. 44, e318–e328 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Rodrigo, C. et al. Kortikosteroide als Zusatztherapie bei der Behandlung von Influenza. Cochrane-Datenbanksystem. Rev. 3, CD010406 (2016).

PubMed Google Scholar

Nedel, WL et al. Kortikosteroide bei schwerer Influenza-Pneumonie: eine kritische Bewertung. Welt J. Crit. Pflege Med. 5, 89–95 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Stockman, LJ, Bellamy, R. & Garner, P. SARS: systematische Überprüfung der Behandlungseffekte. PLoS Med. 3, e343 (2006).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Arabi, YM et al. Kortikosteroidtherapie für schwerkranke Patienten mit Middle East Respiratory Syndrome. Bin. J. Atmung. Krit. Pflege Med. 197, 757–767 (2018).

Artikel PubMed Google Scholar

RECOVERY Collaborative Group, Horby, P. et al. Dexamethason bei hospitalisierten Patienten mit Covid-19. N. engl. J. Med. 384, 693–704 (2020).

Artikel Google Scholar

Angriman, F. et al. Blockade des Interleukin-6-Rezeptors bei Patienten mit COVID-19: Einordnung klinischer Studien in den Kontext. Lanzettenatmung. Med. 9, 655–664 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Baeten, DLP & Kuchroo, VK Wie Zytokinnetzwerke Entzündungen anheizen: Interleukin-17 und eine Geschichte von zwei Autoimmunerkrankungen. Nat. Med. 19, 824–825 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Huang, CG et al. Relative COVID-19-Viruspersistenz und Antikörperkinetik. Krankheitserreger. Rev. 10, 752 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, J. et al. Zytokinsturm und Leukozytenveränderungen bei leichter versus schwerer SARS-CoV-2-Infektion: Überprüfung von 3939 COVID-19-Patienten in China und neue Pathogenese- und Therapiekonzepte. J. Leukoc. Biol. 108, 17–41 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Liu, WJ et al. T-Zell-Immunität von SARS-CoV: Auswirkungen auf die Impfstoffentwicklung gegen MERS-CoV. Antivirale Res. 137, 82–92 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Mahallawi, WH et al. Eine MERS-CoV-Infektion beim Menschen ist mit einem entzündungsfördernden TH1- und TH17-Zytokinprofil verbunden. Cytokine 104, 8–13 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, C. et al. Die IL-17-Reaktion vermittelt eine akute Lungenschädigung, die durch das pandemische Influenza-A-Virus (H1N1) von 2009 verursacht wird. Zellauflösung 22, 528–538 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Pacha, O., Sallman, MA & Evans, SE COVID-19: Ein Argument für die Hemmung von IL-17? Nat. Pfr. Fr. Immunol. 20, 345–346 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dutta, A. et al. Veränderte T-bet-Dominanz in IFN-γ-entkoppelten CD4+ T-Zellen mit abgeschwächtem Zytokinsturm und erhaltenem Gedächtnis bei Influenza. J. Immunol. 190, 4205–4214 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Dutta, A. et al. IL-10 hemmt Neuraminidase-aktiviertes TGF-β und erleichtert den Th1-Phänotyp in der frühen Phase der Infektion. Nat. Komm. 6, 6374 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Dutta, A. et al. Die Sterilisierung der Immunität gegen eine Influenzavirus-Infektion erfordert eine lokale Antigen-spezifische T-Zell-Reaktion in der Lunge. Wissenschaft. Rep. 6, 32973 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huang, CT et al. Rapamycin-Adjuvans und verschlimmerte schwere Influenza in einem experimentellen Mausmodell. Wissenschaft. Rep. 7, 4136 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Huang, CT et al. Wirkung von Aloin auf die virale Neuraminidase und die Hämagglutinin-spezifische T-Zell-Immunität bei akuter Influenza. Phytomedizin 64, 152904 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Dutta, A. Rolle von Pneumokokken-NanC bei der schweren Erkrankung der Streptococcus pneumoniae-Superinfektion mit Influenza. Immunhorizonte 5, 210–218 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kirberg, J. et al. Thymusselektion von CD8+-einzelpositiven Zellen mit einem durch den Haupthistokompatibilitätskomplex eingeschränkten Rezeptor der Klasse II. J. Exp. Med. 180, 25–34 (1994).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hale, JS et al. Thymusproduktion bei alten Mäusen. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA. 103, 8447–8452 (2006).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, Y. et al. Induktion und molekulare Signatur pathogener TH17-Zellen. Nat. Immunol. 13, 991–999 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Feng, Y. et al. Der neutralisierende IL-17A-Antikörper schwächt die durch Angiostrongylus cantonensis verursachte eosinophile Meningitis ab, indem er die IL-17RA/Traf6/NF-kappaB-Signalisierung einbezieht. Exp. Zellauflösung 384, 111554 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chen, X. et al. Die IL-17R-EGFR-Achse verknüpft die Wundheilung mit der Tumorentstehung in Lrig1(+)-Stammzellen. J. Exp. Med. 216, 195–214 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bradley, JR & Pober, JS Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor-assoziierte Faktoren (TRAFs). Oncogene 20, 6482–6491 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Matsumoto, R. et al. Das epitheliale TRAF6 treibt die IL-17-vermittelte psoriatische Entzündung voran. JCI Insight 3, e121175 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Zepp, JA et al. Auf dem neuesten Stand: TNF-Rezeptor-assoziierter Faktor 4 schränkt IL-17-vermittelte Pathologie und Signalprozesse ein. J. Immunol. 189, 33–37 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Guo, XJ & Thomas, PG Im Influenza-Zytokinsturm tauchen neue Fronten auf. Semin. Immunopathol. 39, 541–550 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sarawar, SR et al. Die Verabreichung von Anti-IFN-Gamma-Antikörpern an Mäuse mit Beta-2-Mikroglobulin-Mangel verzögert die Clearance des Influenzavirus, verändert jedoch nicht die Reaktion auf einen T-Helferzell-2-Phänotyp. J. Immunol. 153, 1246–1253 (1994).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Szabo, SJ et al. Ein neuartiger Transkriptionsfaktor, T-bet, steuert die Bindung der Th1-Linie. Zelle 100, 655–669 (2000).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Dutta, A., et al. Der Ursprung der von den Effektorzellen in LAG-3 markierten Th1-Immunität gegen schwere Influenzavirusinfektionen. Immunologie https://doi.org/10.1111/imm.13620 (2022).

Hwang, ES et al. Das Schicksal der T-Helferzellen wird durch die Kinase-vermittelte Interaktion von T-bet mit GATA-3 spezifiziert. Wissenschaft 307, 430–433 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lazarevic, V. et al. T-bet unterdrückt die T(H)17-Differenzierung, indem es die Runx1-vermittelte Aktivierung des für RORγt kodierenden Gens verhindert. Nat. Immunol. 12, 96–104 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zielinski, CE et al. Durch Krankheitserreger induzierte menschliche TH17-Zellen produzieren IFN-γ oder IL-10 und werden durch IL-1β reguliert. Natur 484, 514–518 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Du, S. et al. IL-17 stimuliert die Expression von CCL2 in Herzmuskelzellen über Act1/TRAF6/p38MAPK-abhängige AP-1-Aktivierung. Scan. J. Immunol. 91, e12840 (2020).

Artikel PubMed Google Scholar

Wu, L. et al. Ein neuartiger IL-17-Signalweg, der die Keratinozytenproliferation und Tumorentstehung über die TRAF4-ERK5-Achse steuert. J. Exp. Med. 212, 1571–1587 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ke, Y. et al. Entzündungshemmende Rolle von IL-17 bei experimenteller Autoimmun-Uveitis. J. Immunol. 182, 3183–3190 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Matthias, J. et al. Salz erzeugt entzündungshemmende Th17-Zellen, verstärkt aber die Pathogenität in proinflammatorischen Zytokin-Mikroumgebungen. J. Clin. Investieren. 130, 4587–4600 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, X. et al. IL-17-Rezeptor-basierte Signalübertragung und Auswirkungen auf Krankheiten. Nat. Immunol. 20, 1594–1602 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Monto, AS & Fukuda, K. Lehren aus Grippepandemien der letzten 100 Jahre. Klin. Infizieren. Dis. 70, 951–957 (2020).

PubMed Google Scholar

Halaji, M. et al. Neu auftretende Coronaviren: erstes SARS, zweites MERS und drittes SARS-CoV-2: epidemiologische Aktualisierungen von COVID-19. Infez. Med. 28, 6–17 (2020).

CAS PubMed Google Scholar

O'Driscoll, M. et al. Altersspezifische Mortalitäts- und Immunitätsmuster von SARS-CoV-2. Natur 590, 140–145 (2021).

Artikel PubMed Google Scholar

Naylor, K. et al. Der Einfluss des Alters auf die T-Zell-Generierung und die TCR-Diversität. J. Immunol. 174, 7446–7452 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Aspinall, R. Die altersbedingte Thymusatrophie bei der Maus ist auf einen Mangel zurückzuführen, der die Neuordnung des TCR während der Entwicklung der intrathymischen T-Zellen beeinträchtigt. J. Immunol 158, 3037–3045 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Huang, CT et al. Rolle von LAG-3 in regulatorischen T-Zellen. Immunität 21, 503–513 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Huang, CT et al. CD4+ T-Zellen durchlaufen während des Prozesses der In-vivo-Toleranzinduktion eine Effektorphase. J. Immunol 170, 3945–3953 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yang, Y. et al. Für die Umkehrung der regulatorischen T-Zell-vermittelten CD8-Toleranz sind anhaltende Toll-like-Rezeptorsignale erforderlich. Nat. Immunol. 5, 508–515 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Referenzen herunterladen

Wir danken dem Radiation Research Core Laboratory des Chang Gung Memorial Hospital für die Unterstützung des Durchflusszytometrie-Instruments. Das Forschungszentrum für neu auftretende Virusinfektionen erhält Unterstützung durch das Featured Areas Research Center Program im Rahmen des Higher Education Sprout Project des Bildungsministeriums (MOE), Taiwan und NSTC 111−2634-F-182-001 von National Science und Technologierat, Taiwan. Diese Arbeit wurde durch die Projekte MOST 111-2314-B-182-029 (AD), MOST-105-2321-B-182A-003-MY3 (AD) und MOST-106-2314-B-182A-160 unterstützt. MY3 (CTH) vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan, und von CMRPVVJ0052 (CYH), CMRPG 3E2081-3 und 3J0721 (CTH) vom Medical Research Project Fund, Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan.

Forschungszentrum für neu auftretende Virusinfektionen, College of Medicine, Chang Gung University, Guishan-33302, Stadt Taoyuan, Taiwan

Avijit Dutta

Abteilung für Infektionskrankheiten, Abteilung für Medizin, Chang Gung Memorial Hospital, Guishan-33333, Stadt Taoyuan, Taiwan

Avijit Dutta, Sung-Han Hsiao, Chia-Shiang Chang und Ching-Tai Huang

Abteilung für Thoraxmedizin, Abteilung für Medizin, Chang Gung Memorial Hospital, Guishan-33333, Stadt Taoyuan, Taiwan

Chen-Yiu Hung

Abteilung für Pathologie, Chang Gung Memorial Hospital, Guishan-33333, Stadt Taoyuan, Taiwan

Tse-Ching Chen

Abteilung für Pathologie, College of Medicine, Chang Gung University, Guishan-33302, Taoyuan City, Taiwan

Tse-Ching Chen

Abteilung für Hämatologie und Onkologie, Abteilung für Medizin, Chang Gung Memorial Hospital, Guishan-33333, Stadt Taoyuan, Taiwan

Yung-Chang Lin

Abteilung für Hämatologie und Onkologie, College of Medicine, Chang Gung University, Guishan-33302, Stadt Taoyuan, Taiwan

Yung-Chang Lin

Abteilung für Hepatogastroenterologie, Abteilung für Medizin, Chang Gung Memorial Hospital, Guishan-33333, Stadt Taoyuan, Taiwan

Chun-Yen Lin

Abteilung für Hepatogastroenterologie, College of Medicine, Chang Gung University, Guishan-33302, Taoyuan City, Taiwan

Chun-Yen Lin

Abteilung für Infektionskrankheiten, College of Medicine, Chang Gung University, Guishan-33302, Taoyuan City, Taiwan

Ching-Tai Huang

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

AD und C.-TH entwarfen die Forschungsstudien, analysierten die Daten und verfassten die Arbeit; T.-CC führte eine pathologische Bewertung von Lungenabschnitten durch; AD, C.-YH, S.-HH, C.-SC, T.-AC, Y.-CL und C.-YL führten die Forschung durch.

Korrespondenz mit Ching-Tai Huang.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Hugh D. Mitchell und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Damon Tumes, Eve Rogers und Christina Karlsson Rosenthal. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Dutta, A., Hung, CY., Chen, TC. et al. Eine IL-17-EGFR-TRAF4-Achse trägt zur Linderung von Lungenentzündungen bei schwerer Grippe bei. Commun Biol 6, 600 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04982-0

Zitat herunterladen

Eingegangen: 11. September 2022

Angenommen: 25. Mai 2023

Veröffentlicht: 03. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04982-0

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.

Nachricht