Erhöhte Seltenheit

Nature Band 618, Seiten 87–93 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Technisch wichtige Seltenerdelemente sind aufgrund ihrer subtilen Unterschiede im Ionenradius und der Koordinationszahl bekanntermaßen schwer zu trennen1,2,3. Das natürliche Lanthanid-bindende Protein Lanmodulin (LanM)4,5 ist eine nachhaltige Alternative zur herkömmlichen Trennung auf Lösungsmittelextraktionsbasis6. Hier charakterisieren wir ein neues LanM aus Hansschlegelia quercus (Hans-LanM) mit einem oligomeren Zustand, der gegenüber dem Ionenradius seltener Erden empfindlich ist, wobei das Lanthan(III)-induzierte Dimer >100-fach stärker ist als das Dysprosium(III)-induzierte Dimer. Röntgenkristallstrukturen veranschaulichen, wie Unterschiede im Pikometerbereich im Radius zwischen Lanthan(III) und Dysprosium(III) durch eine Carboxylatverschiebung, die ein Wasserstoffbrückennetzwerk der zweiten Sphäre neu anordnet, auf die Quartärstruktur von Hans-LanM übertragen werden. Der Vergleich mit dem prototypischen LanM aus Methylorubrum extorquens zeigt unterschiedliche Metallkoordinationsstrategien, was die größere Selektivität von Hans-LanM innerhalb der Seltenerdelemente erklärt. Schließlich moduliert die strukturgesteuerte Mutagenese eines Schlüsselrests an der Hans-LanM-Dimer-Grenzfläche die Dimerisierung in Lösung und ermöglicht eine einstufige, säulenbasierte Trennung einer Neodym(III)/Dysprosium(III)-Mischung auf >98 % Einzelelementreinheiten . Diese Arbeit zeigt die natürliche Vielfalt selektiver Lanthanoid-Erkennungsmotive und enthüllt die seltenerdempfindliche Dimerisierung als biologisches Prinzip, mit dem sich die Leistung biomolekülbasierter Trennprozesse optimieren lässt.

Die unersetzliche Rolle von Seltenerdelementen (SE) in allgegenwärtigen modernen Technologien, die von Permanentmagneten bis hin zu Leuchtdioden und Leuchtstoffen reichen, hat das Interesse an einer der großen Herausforderungen der Trennwissenschaft – der effizienten Trennung von Lanthaniden – erneut geweckt1. Die Trennung dieser 15 Elemente wird durch die ähnlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften ihrer vorherrschenden +III-Ionen erschwert, wobei die Ionenradien zwischen LaIII und LuIII nur um 0,19 Å abnehmen (Lit. 7), was auch dazu führt, dass diese Metalle in SE-haltigen Metallen gleichzeitig vorkommen Mineralien. Herkömmliche hydrometallurgische Flüssig-Flüssig-Extraktionsmethoden für die RE-Produktion nutzen organische Lösungsmittel wie Kerosin und giftige Phosphonat-Extraktionsmittel und erfordern Dutzende oder sogar Hunderte von Stufen, um hochreine einzelne SE-Oxide zu erhalten3,8. Die Ineffizienz und die großen Umweltauswirkungen der SE-Trennung9 haben Forschungsbemühungen nach alternativen Liganden mit größeren Trennfaktoren zwischen benachbarten REs10,11,12,13,14 und umweltfreundlicheren Prozessdesigns angeregt, um die SE-Trennung in weniger Stufen15 und unter Verwendung rein wässriger Chemie6 zu erreichen. 16,17,18,19,20.

Die Entdeckung des Gründungsmitglieds der LanM-Familie der Lanthanoid-bindenden Proteine ​​zeigte, dass die Natur Makromoleküle entwickelt hat, die die Selektivität synthetischer F-Element-Chelatoren übertreffen4. Das prototypische LanM aus M. extorquens AM1 (Mex-LanM) ist ein kleines (12 kDa) monomeres Protein, das eine selektive Konformationsreaktion auf pikomolare Konzentrationen von Lanthanoiden4,18 und Actiniden21,22,23,24 ermöglicht Verständnis der Lanthanoidaufnahme in Methylotrophen25 und diente als Technologieplattform für den Nachweis von F-Elementen26, die Rückgewinnung18,27 und die Trennung6. Was unter den RE-Chelatoren ungewöhnlich ist, bevorzugt Mex-LanM die größeren und häufiger vorkommenden leichten REs (LREs), insbesondere LaIII–SmIII, gegenüber den schweren REs (HREs)4. Unser jüngster Nachweis, dass sogar einzelne Substitutionen an den Metallbindungsmotiven von Mex-LanM die Actinid/Lanthanid-Trennung verbessern können, hat uns dazu angespornt, zu untersuchen, ob Orthologe von Mex-LanM möglicherweise unterschiedliche und potenziell nützliche Metallselektivitätstrends aufweisen.

Hier berichten wir, dass das LanM aus Hansschlegelia quercus (Hans-LanM), einem aus Stieleichenknospen isolierten methylotrophen Bakterium28, im Vergleich zu Mex-LanM eine verbesserte SE-Trennkapazität aufweist. Während Mex-LanM immer monomer ist, existiert Hans-LanM in einem Monomer/Dimer-Gleichgewicht, dessen Position von der spezifischen RE-Bindung abhängt. Drei Röntgenkristallstrukturen von LanMs und strukturgesteuerte Mutagenese erklären den SE-abhängigen oligomeren Zustand von Hans-LanM und seine größere Trennkapazität als die von Mex-LanM. Schließlich nutzen wir diese Erkenntnisse, um eine einstufige Hans-LanM-basierte Trennung des kritischen Neodym/Dysprosium-Paares zu erreichen. Diese Ergebnisse veranschaulichen, wie intermolekulare Wechselwirkungen – die in Proteinen häufig, in kleinen Molekülen jedoch selten sind – zur Verbesserung der RE-Trennung genutzt werden können.

Wir haben mehrere Merkmale eines LanM vorgeschlagen4. Erstens besitzen LanMs vier EF-Handmotive. EF-Hände umfassen carboxylatreiche Metallbindungsschleifen mit 12 Resten, flankiert von α-Helices, die traditionell auf die CaII-Bindung reagieren;29 in Mex-LanM binden jedoch 1–3 EF-Hände Lanthanoid(III)-Ionen mit niedriger Pikomolarzahl Affinität und 108-fache Selektivität gegenüber CaII, was zu einem großen, Lanthanoid-selektiven Konformationsübergang von der Störung zur Ordnung führt4. EF4 bindet nur mit mikromolarer Affinität. Zweitens sind benachbarte EF-Hände in LanMs durch 12–13 Reste getrennt – und nicht durch die typischen etwa 25 Reste in CaII-responsiven EF-Hand-Proteinen –, was zu einer ungewöhnlichen Drei-Helix-Bündelarchitektur mit den Metallbindungsstellen an der Peripherie führt5. Drittens enthält mindestens eine EF-Hand Prolin an der zweiten Position (in Mex-LanM weisen alle vier EF-Hände P2-Reste auf). Wir durchsuchten Sequenzdatenbanken anhand der ersten beiden Kriterien und einer Sequenzlänge von <200 Resten und identifizierten 696 mutmaßliche LanMs. Diese Sequenzen wurden mithilfe eines Sequenzähnlichkeitsnetzwerks30 visualisiert, um LanM-Sequenzen zu identifizieren, die getrennt von Mex-LanM gruppiert sind. Bemerkenswert ist, dass bei einer Identitätsschwelle von 65 % ein kleiner Sequenzcluster gebildet wird, der vom Hauptcluster aus 642 Sequenzen entfernt ist (Abb. 1a). Dieser exklusive Cluster (der Hans-Cluster) umfasst Bakterien aus mehreren Gattungen, darunter Hansschlegelia und Xanthobacter (Extended Data Abb. 1), die alle fakultative Methylotrophe sind31.

a: Das Sequenzähnlichkeitsnetzwerk der LanM-Kernsequenzen weist darauf hin, dass Hans-LanM einen eindeutigen Cluster bildet. Das Sequenzähnlichkeitsnetzwerk umfasst 696 LanM-Sequenzen, die mit 48.647 Kanten verbunden sind, einen Schwellenwert für einen BLAST E-Wert von 1 × 10−5 und eine Sequenzidentität von 65 % aufweisen. Die Blackbox umfasst mit Hans-LanM geclusterte Knoten. Die mit Mex (unteres Dreieck) und vier innerhalb von Hansschlegelia (oberes Dreieck) assoziierte LanM-Sequenz ist im Vergleich zu anderen Knoten (Kreisen) vergrößert. Die Farben der Knoten stellen die Familie dar, aus der die Sequenzen stammen. b, Vergleich der Sequenzen der vier EF-Hände von Mex- und Hans-LanMs. Rückstände, die kanonisch an der Metallbindung in EF-Händen beteiligt sind, sind blau; Pro-Rückstände sind in Lila dargestellt. c, Zirkulardichroismus-Spektren aus einer repräsentativen Titration von Hans-LanM mit LaIII, die die metallassoziierte Konformationsreaktion zeigen, die die Helizität erhöht; Apoprotein ist kräftig schwarz, LaIII-gesättigtes Protein ist kräftig rot. d, Zirkulardichroismus-Titration von Hans-LanM mit LaIII, NdIII und DyIII (pH 5,0). Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten dar. e, Vergleich der Kd,app-Werte (pH 5,0) für Mex-LanM (schwarz18) und Hans-LanM (rot), aufgetragen gegen den Ionenradius7. Mittelwert ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten.

Quelldaten

Hans-LanM weist eine geringe (33%) Sequenzidentität mit Mex-LanM (ergänzende Abbildung 1) und divergierende EF-Hand-Motive auf, insbesondere an der ersten, zweiten und neunten Position (Abb. 1b), die wichtige Positionen in Mex-LanM sind. LanM23,26 und andere EF-Hand-Proteine29. Daher bot Hans-LanM die Möglichkeit, Merkmale zu bestimmen, die für die selektive Lanthanoiderkennung in LanMs wesentlich sind.

Hans-LanM wurde in Escherichia coli als 110 Aminosäuren langes Protein exprimiert (ergänzende Abbildung 1). LaIII und NdIII wurden als repräsentative LREs und DyIII als repräsentative HRE für Komplexierungsstudien ausgewählt. Das Protein bindet durch Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (Ergänzungstabelle 1) etwa drei Äquivalente LaIII und NdIII und etwas weniger DyIII, ebenso wie Mex-LanM4. Ebenso wie Mex-LanM4 weist Hans-LanM in Abwesenheit von Metall einen geringen Helixgehalt auf, was anhand des Zirkulardichroismussignals bei 222 nm beurteilt wird (Abb. 1c). Unerwarteterweise reichten nur zwei Äquivalente von LaIII oder DyIII aus, um die vollständige Konformationsänderung von Hans-LanM zu bewirken (ergänzende Abbildung 2), was darauf hindeutet, dass das dritte Bindungsäquivalent schwach ist und die Helizität nicht erhöht.

Die scheinbaren Dissoziationskonstanten (Kd,app), die durch Zirkulardichroismus-Spektroskopie4 bestimmt wurden, spiegeln die Selektivitäten von Mex-LanM gegenüber RE gegenüber RE und RE gegenüber Nicht-RE unter konkurrierenden RE-Gewinnungsbedingungen wider6,18. Daher wurden ähnliche Bestimmungen von Kd,app mit freien Metallkonzentrationen, kontrolliert durch einen konkurrierenden Chelator4,32, auf Hans-LanM angewendet; Die Ergebnisse (Abb. 1d und Ergänzungstabelle 2) unterschieden sich von denen für Mex-LanM. Die Bindung von LaIII und NdIII an Hans-LanM erhöht die molare Elliptizität bei 222 nm um das 2,3-fache, wobei die vollständige Konformationsänderung in stöchiometrischen Titrationen sichtbar ist. Die Konformationsänderung ist kooperativ (Hill-Koeffizienten n von 2; Ergänzungstabelle 2) und die Kd,app-Werte sind ähnlich, 68 bzw. 91 pM. Obwohl DyIII in stöchiometrischen Titrationen die gleiche Gesamtreaktion wie LaIII induziert (ergänzende Abbildung 2), zeigt Hans-LanM in den Chelator-gepufferten DyIII-Titrationen eine geringere Konformationsreaktion (1, 8-facher Anstieg). Dieser Unterschied weist darauf hin, dass mindestens eine der DyIII-Bindungsstellen sehr schwach reagiert (Kd,app > 0,3 µM, die höchste erreichbare Konzentration in den Chelator-gepufferten Titrationen). Die Hauptreaktion auf DyIII erfolgt bei 2,6 nM, mehr als 30-fach höher als bei den LREs und mit geringer oder keiner Kooperativität (n = 1,3). Im Gegensatz dazu zeigt Mex-LanM nur eine mäßige Präferenz für LREs (ungefähr fünffach; Abb. 1e; Lit. 4), und alle Lanthanoide und YIII induzieren ähnliche Konformationsänderungen und Kooperativität . Hans-LanM reagiert schwach auf Calcium(II) (Kd,app = 60 µM), mit dem gleichen Mangel an Kooperativität (n = 1,0) und einer teilweisen Konformationsänderung, die bei DyIII erkennbar ist (Extended Data Abb. 2). Daher unterscheidet Hans-LanM stärker zwischen LREs und HREs als Mex-LanM, wobei die HRE-Komplexe eine geringere Affinität, eine geringere Kooperativität und eine geringere primäre Konformationsänderung aufweisen.

Das unterschiedliche Verhalten der LRE- und HRE-Hans-LanM-Komplexe deutete auf einen oder mehrere Mechanismen der LRE- gegenüber HRE-Selektivität hin, die in Mex-LanM nicht vorhanden sind. Da Mex-LanM ein Monomer im Komplex mit LREs und HREs gleichermaßen ist4,5, gingen wir davon aus, dass LREs und HREs in Hans-LanM unterschiedliche oligomere Zustände induzieren könnten. In Gegenwart von drei Äquivalenten LaIII eluiert Hans-LanM von einer Größenausschlusschromatographiesäule (SEC) nicht mit dem erwarteten Molekulargewicht (MW) von 11,9 kDa, sondern mit 27,8 kDa, was auf ein Dimer hindeutet (Ergänzende Abbildungen 3). und 4a). Das scheinbare MW beginnt allmählich nach NdIII, aber stark bei GdIII und nimmt in Richtung des für ein Monomer erwarteten Werts ab (Abb. 2a, ergänzende Abb. 4 und ergänzende Tabelle 3). Bemerkenswerterweise scheinen Lanthanoide, die schwerer als GdIII sind, das Wachstum von Bakterien, die RE nutzen, nicht zu unterstützen33,34,35.

a, Scheinbares Molekulargewicht von Hans-LanM-Komplexen mit REs, bestimmt durch analytische SEC (rote Linien) oder SEC-MALS (schwarze gestrichelte Linie). Die Bedingungen finden Sie in der Ergänzungstabelle 1. Jeder einzelne Datenpunkt ist das Ergebnis eines einzelnen Experiments. b, Das LaIII-gebundene Hans-LanM-Dimer, bestimmt durch Röntgenkristallographie. LaIII-Ionen werden als grüne Kugeln und NaI-Ionen als graue Kugeln dargestellt. c, Detailansicht der Dimerschnittstelle in der Nähe von EF3 von Kette A (blauer Cartoon). Arg100 aus Kette C (hellblauer Cartoon) verankert ein Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerk, an dem Asp93 von Kette A und zwei EF3-LaIII-Liganden (Glu91 und Asp85) beteiligt sind. Diese Wechselwirkungen stellen die einzigen polaren Kontakte an der Dimer-Grenzfläche dar und bieten eine Möglichkeit, den Radius der Lanthanoid-Bindungsstelle an EF3 zu steuern. d, Schematische Darstellung der Wechselwirkungen an der Dimer-Grenzfläche. Rote gestrichelte Linien zeigen Wasserstoffbrücken-Wechselwirkungen an und graue gestrichelte Linien zeigen hydrophobe Kontakte. e, DENSS-Projektionen der Elektronendichte aus Kleinwinkel-Röntgenstreuungsdatensätzen für LaIII-gebundenes (links) und DyIII-gebundenes (rechts) Hans-LanM, überlagert mit einem PyMOL-erzeugten Banddiagramm des dimeren LaIII-Hans-LanM Kristallstruktur.

Um die bevorzugte Dimerisierung in Gegenwart physiologisch relevanter LREs weiter zu untermauern, wurden RE-Komplexe von Hans-LanM mittels Mehrwinkellichtstreuung (MALS; Abb. 2a und ergänzende Abb. 5) analysiert. Die LaIII-, NdIII- und GdIII-Komplexe haben MWs von 22–25 kDa, was auf Dimere hinweist, aber die MWs nehmen beginnend mit TbIII ab und setzen sich in Übereinstimmung mit den SEC-Daten bei DyIII und HoIII fort, bei etwa 15 kDa (erweiterte Datentabelle 1). CaII-gebundenes Hans-LanM zeigte ebenfalls ein MW von 14,7 kDa an. Die HRE–, CaII– und apo Hans-LanM-Komplexe sind jedoch immer noch ein Drittel größer als für ein Monomer erwartet, was jedoch darauf hindeutet, dass diese Formen unter diesen Bedingungen in einem schnellen Gleichgewicht mit einem Monomer/Dimer-Verhältnis von ≈2:1 existieren. Als nächstes bestimmten wir den Kd für die Dimerisierung (Kdimer) von Apo, LaIII-gebundenem und DyIII-gebundenem Hans-LanM durch isotherme Titrationskalorimetrie (erweiterte Datentabelle 2 und ergänzende Abbildungen 6–8). Das Apoprotein und das DyIII-gebundene Protein dimerisieren schwach mit Kdimer-Werten von 117 µM bzw. 60 µM, was mit den Verhältnissen von Monomer und Dimer übereinstimmt, die in den SEC- und MALS-Spuren widergespiegelt werden. In Gegenwart von LaIII war das Dimer jedoch zu fest, um die Monomerisierung durch isotherme Titrationskalorimetrie beobachten zu können, was darauf hinweist, dass Kdimer <0,4 µM ist (ergänzende Abbildung 8). Somit begünstigt LaIII die Dimerisierung von Hans-LanM um das >100-fache gegenüber DyIII.

Eine Röntgenkristallstruktur von Hans-LanM mit einer Auflösung von 1,8 Å im Komplex mit LaIII bestätigt die LRE-induzierte Dimerisierung (Erweiterte Daten, Abb. 3 und Ergänzungstabelle 4). Zwei LanM-Monomere interagieren Kopf-an-Schwanz (Abb. 2b) und vergraben etwa 600 Å2 Oberfläche durch hydrophobe und polare Kontakte (Abb. 2c, d). Diese Wechselwirkungen treten größtenteils zwischen Seitenketten auf, die von den Kernhelices α1 (zwischen EF1 und EF2) und α2 (zwischen EF3 und EF4) beigetragen werden; ergänzende Abbildung 9. Reste an der Dimer-Grenzfläche stellen direkten Kontakt nur mit einer der vier Metallbindungsstellen, EF3, her; Drei Reste von EF3 in jedem Monomer bilden mit Arg100 des anderen Monomers ein Wasserstoffbrückennetzwerk (Abb. 2c), was darauf hindeutet, dass die Besetzung und Koordinationsgeometrie an dieser Stelle den oligomeren Zustand steuern könnte.

Hans-LanM und seine Komplexe mit drei Äquivalenten LaIII, NdIII und DyIII wurden auch durch Röntgenkleinwinkelstreuung analysiert (Ergänzende Abbildungen 10 und 11). Die aus den Kleinwinkel-Röntgenstreuungsdaten berechneten Lösungsmittelhüllen36 passen gut zum kristallographischen Hans-LanM-Dimer für LaIII-Hans-LanM, ausreichend für NdIII-Hans-LanM, aber schlecht für DyIII-Hans-LanM (Abb. 2e). und ergänzende Abbildungen 12–14). Die schwächere Dimerisierung von DyIII-Hans-LanM wird auch durch quantitative Metriken wie das Porod-Volumen gestützt (Ergänzungsabbildungen 15 und 16 sowie Ergänzungstabellen 5 und 6). Zusammengenommen deuten die biochemischen und strukturellen Ergebnisse darauf hin, dass das Dimerisierungsgleichgewicht von Hans-LanM stark von der jeweiligen SE-Bindung abhängt.

Die Struktur von LaIII–Hans-LanM bietet auch einen der ersten detaillierten Einblicke in die Koordinationsumgebungen in einem LanM und in der Tat in jedem natürlichen Biomolekül, das mit der reversiblen Lanthanoiderkennung beauftragt ist. Die vorherige NMR-Struktur von Mex-LanM5 zeigte die ungewöhnliche Faltung des Proteins, konnte jedoch keine Details auf molekularer Ebene über die Metallbindungsstellen liefern. Um die Grundlage für die Unterscheidung zwischen LRE und HRE zu verstehen, haben wir auch eine Struktur von DyIII-Hans-LanM mit einer Auflösung von 1,4 Å bestimmt. Schließlich berichten wir über eine Struktur von NdIII-Mex-LanM mit einer Auflösung von 1,01 Å, was den flacheren RE-Selektivitätstrend von Mex-LanM erklärt.

In LaIII-Hans-LanM sind EF1–3 mit LaIII-Ionen besetzt (Extended Data Abb. 3b – e). EF4 ist strukturell unterschiedlich, weist keine anomale Differenzdichte im Einklang mit LaIII auf und wurde mit NaI modelliert (ergänzende Abbildung 17a). Jede LaIII-Bindungsstelle ist zehnfach koordiniert, wie in Strukturen von Lanthanoid-abhängigen Methanoldehydrogenasen 33, 37 beobachtet (ergänzende Abbildung 18). Ein einzähniges Asn (N1-Position), vier zweizähnige Asp- oder Glu-Reste (D3, D5, E9 und E12) und ein Rückgrat-Carbonyl (T7 oder S7) vervollständigen die erste Koordinationssphäre in EF1–3 (Abb. 3a). Exogene Lösungsmittelliganden werden nicht beobachtet (ergänzende Abbildung 17b); Lumineszenzstudien von EuIII-Hans-LanM zur Bestimmung der Anzahl koordinierter Lösungsmittelmoleküle (q) ergaben q = 0, 11, was mit dem Fehlen von Lösungsmittelliganden in der Röntgenstruktur übereinstimmt (ergänzende Abbildung 19).

a, Vergrößerte Ansichten von EF2 (links) und EF3 (rechts) in LaIII–Hans-LanM. LaIII-Ionen werden als grüne Kugeln dargestellt. Koordinationsbindungen und Wasserstoffbrückenbindungen sind als gestrichelte Linien dargestellt. Die von Kette A beigesteuerten Reste sind in Blau dargestellt, die von Kette C beigesteuerten Reste (im Fall von EF3) in Hellblau. Einschub: Überlagerung von LaIII–Hans-LanM (blau und hellblau) mit DyIII–Hans-LanM (grau), die die Carboxylatverschiebung von Glu91 von zweizähnig (La) zu einzähnig (Dy) zeigt. Koordination und Wasserstoffbrückenbindungen (gestrichelte Linien) sind nur für den Dy-Fall dargestellt. b, Repräsentative Metallbindungsstelle (EF3) in NdIII-Mex-LanM. Das NdIII-Ion wird als Aquakugel dargestellt. Lösungsmittelmoleküle werden als rote Kugeln dargestellt.

Die Lanthanoid-Bindungsstellen in Hans-LanM weisen außerdem umfangreiche Wechselwirkungen in der zweiten Sphäre auf, die die Positionen der Liganden und die Größe der Metallbindungspore weiter einschränken können (ergänzende Abbildung 20). Dieses Phänomen ist in EF3 am offensichtlichsten, wo die Dimer-Grenzfläche ein ausgedehntes Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerk vermittelt, an dem mehrere Liganden beteiligt sind. Arg100, das vom benachbarten Monomer beigesteuert wird, ragt in die dem Lösungsmittel ausgesetzte Seite von EF3 vor, um mit zwei Carboxylatliganden, Asp85 (D3) und Glu91 (E9), in Kontakt zu treten und so deren zweizähnige Bindungsmodi zu verstärken. Arg100 wird auch durch Asp93 (EF3 D11) gestützt, das nur bei EF3 innerhalb von Hans-LanM vorkommt und in Mex-LanM nicht beobachtet wird. Wir haben die Bedeutung dieses Netzwerks bei der Hans-LanM-Dimerisierung getestet, indem wir die minimale Substitution R100K vorgenommen haben. Hans-LanM(R100K) hatte nahezu identische Kd,app-Werte und eine nahezu identische Reaktion auf NdIII und DyIII wie Wildtyp-Hans-LanM, aber der Kd,app für LaIII war zweifach schwächer (Ergänzungsabbildung 21 und Ergänzungstabelle 7). Die SEC-MALS-Analyse ergab MWs von 10–13 kDa für Apo, LaIII– und DyIII–Hans-LanM(R100K) (Ergänzungsabbildung 22 und Ergänzungstabelle 8), was auf eine erhöhte Monomerisierung, insbesondere für den LaIII-Komplex, hinweist und darauf hindeutet Eine schwächere Dimerisierung könnte für die geringere LaIII-Affinität verantwortlich sein. Alle vier Reste des Arg100-EF3-Netzwerks sind im Hans-Cluster vollständig konserviert (ergänzende Abbildung 23), was darauf hindeutet, dass diese Wechselwirkungen zur Dimerisierung in diesen LanMs beitragen könnten.

Die Struktur von DyIII-Hans-LanM bestätigt die Bedeutung der Kontrolle der Ligandenpositionierung in der zweiten Sphäre (Erweiterte Daten Abb. 4, Ergänzende Abbildungen 24–26 und Ergänzende Tabellen 9 und 10). Die Gesamtstruktur von DyIII-Hans-LanM ist weitgehend mit der von LaIII-Hans-LanM überlagerbar, und die Koordinationssphären der DyIII-Ionen in EF1–3 ähneln denen in LaIII-Hans-LanM (Abb. 3a, Einschub). , mit der bemerkenswerten Ausnahme von E9 (zum Beispiel Glu91 in EF3). Dieser Rest verschiebt sich von zweizähnig mit LaIII zu einzähnig mit den kleineren DyIII-Ionen, was eine neunfach koordinierte, verzerrte, abgedeckte, quadratische, antiprismatische Geometrie ergibt; Die niedrigere Koordinationszahl mit einem HRE-Ion stimmt mit dem Fall anderer RE-Komplexe überein38,39. In EF3 verlängert diese Carboxylatverschiebung den Abstand zwischen Arg100 und dem proximalen Oε von Glu91 von 2,9 Å (in LaIII-Hans-LanM) auf 3,2 Å (ergänzende Abbildung 27). Die Neuanordnung dieses Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerks der zweiten Sphäre legt eine strukturelle Grundlage für RE-abhängige Unterschiede in den Kdimer-Werten nahe.

Die Metallbindungsstellen von Mex-LanM unterscheiden sich erheblich von denen von Hans-LanM. In Mex-LanM sind alle vier EF-Hände mit neunfach koordinierten (EF1–3) oder zehnfach koordinierten (EF4) NdIII-Ionen besetzt, die jeweils zwei Lösungsmittelliganden enthalten, die in Hans-LanM nicht vorhanden sind (Abb. 3b und ergänzende Abb. 28). Die Beobachtung der zwei Lösungsmittelmoleküle pro Metallstelle und der Wasserstoffbindung zum D9-Rest bestätigt aktuelle spektroskopische Studien21,23,26. Der Unterschied in der Koordinationszahl zwischen EF1–3 und EF4 ist darauf zurückzuführen, dass das D3-Carboxylat in EF1–3 einzähnig, in EF4 jedoch zweizähnig ist. Obwohl die NdIII-Stellen von Mex-LanM die in DyIII- und LaIII-Hans-LanM beobachtete Neun- und Zehn-Koordination aufweisen, ähneln sie strukturell den siebenfach koordinierten CaII-Bindungsstellen von Calmodulin (ergänzende Abbildung 18). Die erhöhten Koordinationszahlen in Mex-LanM im Vergleich zu Calmodulin resultieren aus der zweizähnigen Koordination von D5 und einem zusätzlichen Lösungsmittelliganden. Diese Ähnlichkeiten legen nahe, dass ein Großteil der einzigartigen 108-fachen Selektivität von LanM für REs gegenüber CaII auf subtile Unterschiede in der zweiten Koordinationssphäre und anderen weiter entfernten Wechselwirkungen zurückzuführen ist. Schließlich führt die ausschließlich aus Proteinen stammende erste Koordinationssphäre in Hans-LanM, insbesondere aufgrund der Koordination durch E9, zu ausgedehnteren Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerken (ergänzende Abbildungen 20 und 29) und verbessert wahrscheinlich die Kontrolle über den Radius der Bindungsstelle. Somit erklären die Strukturen die außerordentliche RE- gegenüber Nicht-RE-Selektivität von Mex-LanM und Hans-LanM und erklären gleichzeitig ihre Unterschiede in der LRE- gegenüber HRE-Selektivität.

Die Unterschiede in Stabilität und Struktur zwischen den LRE- und HRE-Komplexen von Hans-LanM ließen darauf schließen, dass Hans-LanM (Wildtyp und/oder R100K) Mex-LanM bei RE/RE-Trennungen übertreffen würde. Wir haben uns auf die Trennung des RE-Paares von NdIII und DyIII konzentriert, das in Permanentmagneten verwendet wird. Wir untersuchten zunächst die Stabilitäten der Wildtyp-RE-Komplexe Hans-LanM und Hans-LanM(R100K) gegenüber Citrat, das zuvor als Desorptionsmittel mit Mex-LanM6 verwendet wurde. RE-Hans-LanM-Komplexe sind im Allgemeinen weniger stabil gegenüber Citrat als die von Mex-LanM, wie aufgrund der geringeren Affinität zu erwarten war (Abb. 1e), aber der Unterschied in der Stabilität zwischen NdIII-Hans-LanM und DyIII-Hans- LanM-Komplexe – ausgedrückt als Verhältnis der Citratkonzentration, die für eine 50%ige Desorption jedes Metalls ([Citrat] 1/2) erforderlich ist, wie durch die Fluoreszenz der beiden Trp-Reste von Hans-LanM berichtet (ergänzende Abbildung 30) – ist doppelt so groß für Mex-LanM-Komplexe (Abb. 4a, Ergänzungstabelle 11 und erweiterte Daten Abb. 5). Darüber hinaus destabilisiert die R100K-Substitution den LaIII-Komplex von Hans-LanM erheblich gegenüber Citrat, wohingegen sie den NdIII-Komplex nur geringfügig und den DyIII-Komplex nicht beeinflusst. Dieses Ergebnis bestätigt, dass die Dimerisierung die LRE-Komplexe von Hans-LanM (und insbesondere den LaIII-Komplex) selektiv stabilisiert, ein Faktor, der durch die R100K-Substitution aufgehoben wird. Unter Verwendung von Malonat, einem schwächeren Chelator als Citrat, kann DyIII sowohl von Hans-LanM als auch von R100K mit 10–100 mM Chelator ohne nennenswerte NdIII-Desorption leicht desorbiert werden, was auf Bedingungen für die NdIII/DyIII-Trennung schließen lässt (Abb. 4b).

a, Hans-LanM und die R100K-Variante weisen größere Unterschiede in der Stabilität des Nd- gegenüber dem Dy-Komplex auf als Mex-LanM gegenüber der Desorption durch Citrat. Mittelwert ± Standardabweichung für drei unabhängige Versuche. **Signifikanter Unterschied zwischen [Citrat]1/2 für LaIII zwischen Hans-LanM und Hans-LanM(R100K) (20 µM Protein) zeigt den Einfluss der Dimerisierung auf die Stabilität des LaIII-Komplexes (P < 0,01, Varianzanalyse mit Bonferroni nach- prüfen). Mex-LanM Nd- und Dy-Daten aus Lit. 6. b, Spektrofluorometrische Titration der Hans-LanM- und R100K-Variante (λex = 280 nm, λem = 333 nm) bei pH 5,0, Darstellung der Malonat-induzierten Desorption eines 2:1-Metall-Protein-Komplexes. Mittelwert ± Standardabweichung für drei unabhängige Versuche, mit Ausnahme derjenigen mit R100K, bei denen es sich um Einzelversuche für jede Erkrankung handelte. c, Vergleich der Verteilungsfaktoren (pH 5,0, jeweils etwa 0,33 mM RE, LaIII–DyIII) für immobilisiertes Hans-LanM, Hans-LanM(R100K) und Mex-LanM. Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± Standardabweichung für drei unabhängige Versuche dar. d, Trennung einer 95:5-Mischung von NdIII/DyIII unter Verwendung von immobilisiertem Hans-LanM(R100K) und einem Desorptionsschema aus drei abgestuften Konzentrationen von Malonat, gefolgt von HCl mit pH 1,5. Ein Bettvolumen betrug 0,7 ml.

Quelldaten

Obwohl eine zweifache Modulation der RE- gegenüber der SE-Selektivität durch Dimerisierung gering erscheinen mag, bieten solche Unterschiede die Möglichkeit, die Anzahl der Trennstufen zu verringern und so die Effizienz eines Trennprozesses zu erhöhen3,12. Daher wurden Hans-LanM und die R100K-Variante über einen carboxyterminalen Cys-Rest auf Maleimid-funktionalisierten Agarosekügelchen immobilisiert, wie zuvor beschrieben6, und auf NdIII/DyIII-Trennung getestet. Immobilisiertes Hans-LanM band im Gegensatz zur Lösung etwa ein Äquivalent RE, verglichen mit zwei Äquivalenten für Mex-LanM6 und Hans-LanM (R100K) (ergänzende Abbildung 31). Hans-LanM und R100K zeigten eine ähnliche Trennfähigkeit im La-Gd-Bereich – obwohl R100K eine größere Trennfähigkeit im Gd-Dy-Bereich aufweist – wie durch die Verteilungsverhältnisse (D) einer gemischten RE-Lösung auf der Säule im Gleichgewicht bestimmt (Abb . 4c, Erweiterte Datentabelle 3 und Ergänzungstabellen 12–14). Diese Nd/Dy-Trennfaktoren sind fast doppelt so hoch (Hans-LanM) bzw. dreimal so hoch (Hans-LanM(R100K)) wie Mex-LanM (erweiterte Datentabelle 3). Immobilisiertes Hans-LanM wurde zu 90 % der Durchbruchskapazität mit einer Modell-Elektronikschrott-Mischung aus 5 % Dysprosium und 95 % Neodym beladen und gemäß Abb. 4b mit einem kurzen, schrittweisen Malonatgradienten eluiert, gefolgt von einer vollständigen Desorption bei pH 1,5 HCl. In einer einzigen Reinigungsstufe wurde die Reinheit von Dy von 5 % auf 83 % erhöht und Nd wurde mit einer Reinheit von 99,8 % gewonnen (beide >98 % Ausbeute; erweiterte Daten, Abb. 6). Dies übertraf den vergleichbaren Mex-LanM-basierten Prozess deutlich, der in einer ersten Trennstufe nur eine Reinheit von 50 % erreichte und eine zweite Stufe erforderte, um eine Reinheit von >98 % zu erreichen6. Die immobilisierte R100K-Variante schnitt sogar noch besser ab und erreichte eine Grundlinientrennung von DyIII und NdIII mit einer Reinheit von >98 % und einer Ausbeute von >99 % in einer einzigen Stufe (Abb. 4d). Die bessere Leistung der R100K-Variante war unerwartet und deutet möglicherweise darauf hin, dass bei dieser Immobilisierungsdichte funktionelle Dimere auf der Säule unwahrscheinlich sind (eine Diskussion finden Sie in der Überschrift der erweiterten Daten in Abb. 6). Trotz der erheblich verbesserten Leistung gegenüber Mex-LanM, die durch die Charakterisierung des Hans-LanM-Dimerisierungsmechanismus ermöglicht wurde, kann die vollständige Ausnutzung des Dimerisierungsphänomens auf der Säule beispielsweise die Anbindung von zwei Monomeren an eine einzelne Polypeptidkette beinhalten, was derzeit untersucht wird.

Die biochemische und strukturelle Charakterisierung des Hans-LanM-Mechanismus der metallempfindlichen Dimerisierung liefert einen neuen allosterischen Mechanismus für die LRE- gegenüber der HRE-Selektivität in der Biologie und erweitert Konzepte der dimerabhängigen Metallerkennung, die kürzlich aus synthetischen Lanthanidkomplexen11 und manipulierten Übergangsmetall-bindenden Proteinen40 hervorgegangen sind Dies zeigt, dass diese Prinzipien fest in der Natur verankert sind. Unsere Arbeit zeigt auch, dass die Dimerisierungsstärke und damit die Metallselektivität rational moduliert werden können. Hans-LanM entwickelte eine LRE-selektive Dimerisierung bei physiologischen Proteinkonzentrationen, die denen in unseren biochemischen Tests (10–20 µM) näher kamen als denen auf der Säule (etwa 3 mM). Daher würde die Nutzung der Dimerisierung in einem Trennprozess dadurch unterstützt, dass die Dimerisierungsempfindlichkeit auf den höheren Konzentrationsbereich verlagert wird, beispielsweise durch Abstimmung hydrophober Wechselwirkungen an der Dimerisierungsgrenzfläche. Darüber hinaus belegen unsere Studien, dass LanMs mit einer Identität von nur 33 % leicht vorherzusagen sind, jedoch nützliche Unterschiede in der Metallselektivität aufweisen; Eine weitere Untersuchung dieser Diversität könnte weitere Mechanismen zur Abstimmung der RE-Trennungen aufdecken. Schließlich sollten die vom Lösungsmittel ausgeschlossenen Koordinationssphären von Hans-LanM Mex-LanM bei der SE/Aktinid-Trennung23, der lumineszenzbasierten Erfassung21,26 und der Stabilisierung hydrolyseanfälliger Ionen übertreffen. Die fortgesetzte Charakterisierung der Koordinations- und supramolekularen Prinzipien der biologischen F-Element-Erkennung wird die Entwicklung von Liganden mit höheren RE- gegenüber SE-Selektivitäten und deren Implementierung in neue SE-Trennprozesse inspirieren.

Einzelheiten finden Sie in den ergänzenden Methoden.

Die Sequenz von LanM aus M. extorquens AM1 wurde als Abfrage verwendet, um PSI-BLAST-Suchen in den Datenbanken des National Center for Biotechnology Information für nichtredundante Proteinsequenzen (nr) und metagenomische Proteine ​​(env_nr) bis zur Konvergenz durchzuführen 41 . Die resultierenden 3.047 Proteinsequenzen wurden dann manuell für diejenigen kuratiert, die weniger als 200 Reste lang sind, mindestens ein Paar EF-Hände durch weniger als 14 Reste getrennt haben und 4 EF-Hände haben. Signalpeptide von LanM-Sequenzen wurden mit SignalP (v6.0)42 vorhergesagt und dann vor der weiteren Analyse der Sequenzen entfernt.

Das Enzyme Function Initiative-Enzyme Similarity Tool wurde verwendet, um die Ähnlichkeiten zwischen allen Peptidsequenzpaaren mit einem E-Wert-Schwellenwert von 1 × 10−5 zu berechnen (Lit. 30). Das resultierende Sequenzähnlichkeitsnetzwerk aus 696 Knoten und 241.853 Kanten wurde dann mithilfe des organischen Layouts durch Cytoscape (v3.9.1)43 konstruiert und untersucht und in R (v4.1.0)44 visualisiert. Der Schwellenwert für die prozentuale Kantenidentität wurde schrittweise von 40 % auf 90 % erhöht, um eindeutige Cluster zu erhalten.

LanM-Sequenzen wurden mit MUSCLE (v5.1)45 mit Standardparametern ausgerichtet. Das für die Phylogeniekonstruktion verwendete Modell wurde mit ModelFinder in IQ-TREE (v2.2.0.3)46,47 ausgewählt, wobei --mset auf beast2 gesetzt war. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde mit BEAST (v2.6.7)48 eine bayesianische Phylogenie erstellt. Die resultierende Phylogenie wurde anhand von 107 Generationen und unter Berücksichtigung eines Burn-Ins von 25 % ausgewertet und anschließend mit ggtree (v3.2.1)49 visualisiert.

Das für Hans-LanM kodierende Gen, ein für die Expression in E. coli optimiertes Codon ohne sein natives Signalpeptid mit 23 Resten (siehe Ergänzungstabelle 15), wurde von Twist Bioscience erhalten und unter Verwendung der Restriktionsstellen NdeI/ in pET-29b(+) eingefügt. XhoI. Hans-LanM wurde im 2-l-Maßstab überexprimiert und unter Verwendung des etablierten Protokolls für Mex-LanM50 gereinigt, mit einer Modifikation: Nach dem letzten SEC-Schritt wurde das Protein auf 5 ml konzentriert und gegen 5 g Chelex 100 in 500 ml dialysiert 30 mM HEPES, 100 mM KCl, 5 % Glycerin, pH 8,4, um CaII- und Spurenmetallverunreinigungen zu entfernen. Dieses Verfahren führte zu etwa 15 ml 550 μM Protein, das nicht weiter konzentriert wurde. Die Endausbeute betrug 45 mg Protein pro Liter Kultur. Die Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 11.000 M−1 cm−1 berechnet, basierend auf dem ExPASy ProtParam-Tool51. Hans-LanM(R100K) wurde mit dem gleichen Verfahren gereinigt und ergab 30 mg Protein pro Liter Kultur.

Zirkulardichroismus-Spektren von Hans-LanM wurden wie zuvor beschrieben32 bei 15 µM (Monomerkonzentration) in Chelex 100-behandeltem Puffer A (20 mM Acetat, 100 mM KCl, pH 5,0) gesammelt, sofern nicht anders angegeben. Gepufferte Metalllösungen wurden wie zuvor beschrieben4,23,25,32 hergestellt. Weitere Einzelheiten finden Sie in den Zusatzinformationen.

Proben von Wildtyp-Hans-LanM wurden durch langsame Zugabe von 3,0 Äquivalenten Metall (jeweils 0,5 Äquivalente und anschließendes Mischen) zu 1,0 ml konzentrierter Stammlösung von Hans-LanM (550 μM) hergestellt. Bei diesen Proteinkonzentrationen wurde bei LRE-Proben (z. B. LaIII) eine leichte Ausfällung beobachtet, während bei HRE-Proben (z. B. DyIII) eine signifikante Ausfällung beobachtet wurde. Die Proben wurden 2 Minuten lang bei 12.000 g zentrifugiert, um den Niederschlag zu entfernen, und dann mittels Gelfiltrationschromatographie (HiLoad 10/300 Superdex 75 pg, 1 ml Schleife, 0,8 ml min−1) in Puffer B (30 mM MOPS, 100 mM KCl) gereinigt , 5 % Glycerin, pH 7,0). Hans-LanM-haltige Peaks (im Bereich von 12,0 bis 15,0 ml Elutionsvolumen) wurden gesammelt, um die Aggregatpeaks mit hohem Molekulargewicht zu vermeiden, was 2,0 ml metalliertes Hans-LanM im Bereich zwischen 114 μM und 128 μM (1,37–1,53 mg ml−1) ergab ).

Proben von Hans-LanM(R100K) bilden keine Spezies mit hohem Molekulargewicht und fallen bei der Metallzugabe nicht aus. Um Proben dieses Proteins herzustellen, wurde eine 500 μM Proteinlösung in Puffer B, der 0,75 mM eines spezifischen RECl3 enthielt, auf 250 μM (3 mg ml−1) verdünnt, was eine Endlösung von 3 mg ml−1 Protein mit einer 1 ergab :3-Metallverhältnis, das direkt von SEC-MALS analysiert wurde.

Für Calciumbedingungen wurden die Proteine ​​auf 250 μM (3 mg ml−1) verdünnt, 5 mM CaCl2 zugegeben und die Proben 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Der für SEC-MALS verwendete Puffer war derselbe wie oben, außer dass er zusätzlich 5 mM CaCl2 enthielt.

SEC-MALS-Experimente wurden mit einem Agilent 1260 Infinity II HPLC-System durchgeführt, das mit einem Autosampler und einem Fraktionssammler ausgestattet war, und die hydrophile Wyatt SEC-Säule hatte 5 µm Silica-Kügelchen, eine Porengröße von 100 Å und Abmessungen von 7,8 × 300 mm. Zur Analyse der Molmasse der aus der Säule eluierten Peaks wurden die Brechungsindexdetektoren DAWN MALS und Wyatt Optilab von Wyatt Technology verwendet. Das SEC-MALS-System wurde 5 Stunden lang mit Puffer B äquilibriert. Das System wurde mit Rinderserumalbumin (MW des Monomers: 66 kDa) im gleichen Puffer kalibriert und eine Normalisierung und Ausrichtung der MALS- und Brechungsindexdetektoren durchgeführt. Ein Volumen von 15 µl jeder Probe wurde mit einer Flussrate von 0,8 ml/min bei einer Chromatogrammlaufzeit von 25 Minuten injiziert. Die Daten wurden mit der ASTRA-Software (Wyatt) analysiert. Wenn eine Kleinwinkel-Röntgenstreuungsanalyse (SAXS) gewünscht wurde, wurde ein zweiter Lauf mit injizierten 150 µl Protein (ca. 4 mg ml-1) durchgeführt und 200 µl-Fraktionen des Hauptpeaks gesammelt. Anschließend wurden die BioSAXS-Daten dreifach erfasst.

Die Dissoziationskonstanten für die Dimere von Apo, LaIII-gebundenem und DyIII-gebundenem Hans-LanM wurden durch verdünnende Zugabe einer konzentrierten Proteinlösung und anschließende isotherme Titrationskalorimetrie auf einem Low-Volume-Auto-Affinity-Titrationskalorimeter von TA Instruments bestimmt. Die Spritze enthielt 300 μM Protein (Apo oder 2 Äquivalente gebundenes DyIII) oder 150 μM oder 540 μM (2 Äquivalente gebundenes LaIII) und die Zelle enthielt 185 μl eines passenden Puffers (30 mM MOPS, 100 mM KCl, pH 7,0). ). Die Titrationen wurden bei 30 °C durchgeführt. Die Titrationen bestanden aus einer ersten 0,2-μl-Injektion, gefolgt von 17 × 2-μl-Injektionen, sofern nicht anders angegeben, unter Rühren bei 125 U/min und einer Äquilibrierungszeit von 180 s zwischen den Injektionen. Die Daten wurden mit NanoAnalyze unter Verwendung des Dimer-Dissoziationsmodells angepasst und ergaben die Dimer-Dissoziationskonstante (Kdimer), die Dissoziationsenthalpie (ΔH) und die Dissoziationsentropie (ΔS). Alle Parameter sind in der erweiterten Datentabelle 2 aufgeführt.

Kdimer ist als Dissoziationskonstante für das Gleichgewicht D \(\rightleftharpoons \) 2M definiert, sodass Kdimer = [M]2/[D] ist, wobei [D] die Konzentration des Dimers und [M] die Konzentration ist des Monomers und die Gesamtproteinkonzentration [P] (gemessen unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten für das Monomer) ist gegeben durch [P] = [M] + 2[D]. Daher ist Kdimer = 2[M]2/([P] − [M]) oder

Diese Gleichung kann verwendet werden, um Monomer- und Dimerkonzentrationen während SEC-MALS-Experimenten abzuschätzen, indem Kdimer-Werte verwendet werden, die aus isothermen Titrationskalorimetrie-Experimenten berechnet wurden, und [P] aus der SEC-MALS-Kurve. Diese Gleichung kann auch verwendet werden, um das maximal mögliche Kdimer für LaIII-gebundenes Protein anhand der SEC-MALS-Daten abzuschätzen.

SAXS-Daten wurden an RE-komplexiertem Hans-LanM bei den in der Ergänzungstabelle 5 angegebenen Proteinkonzentrationen unter Verwendung von Geräten und unter den in den Ergänzungsmethoden beschriebenen Bedingungen gesammelt.

Die Vorwärtsstreuung I(0) und der Gyrationsradius (Rg) sind in der Ergänzungstabelle 5 aufgeführt und wurden unter Verwendung der Guinier-Näherung berechnet, die davon ausgeht, dass bei sehr kleinen Winkeln (q < 1,3/Rg) die Intensität ungefähr als I( q) = I(0)exp[−1/3(qRg)2]. Unter den LaIII-, NdIII- und DyIII-gebundenen Bedingungen stimmt dies mit der berechneten Größe von 17,9 Å für das kristallographische Dimer überein. Die Molekülmasse wurde anhand eines Vergleichs mit SAXS-Daten eines Rinderserumalbumin-Standards geschätzt. Die Datendateien wurden mit der ATSAS-Software52 auf Guinier Rg, maximale Partikeldimension (Dmax), Guinier-Anpassungen, Kratky-Diagramme und Paarabstandsverteilungsfunktion analysiert. GNOM wurde innerhalb von ATSAS zur Berechnung der Paarabstandsverteilungsfunktion P(r) verwendet, aus der Rg und Dmax bestimmt wurden. Die Lösungsmittelhüllen wurden mit DENSS36 berechnet. Die theoretischen Streuprofile der konstruierten Modelle wurden berechnet und mit CRYSOL53 an experimentelle Streudaten angepasst. OLIGOMER54 wurde zur Schätzung der Monomer- und Dimeranteile verwendet.

Zu Hans-LanM (2 ml, 1,16 mM, Puffer B) wurden 3,0 Äquivalente LaCl3 oder DyCl3 langsam, jeweils 0,5 Äquivalente, unter Mischen zugegeben, um die Ausfällung zu minimieren. Der Niederschlag wurde durch 2-minütige Zentrifugation bei 12.000 g entfernt. Alle löslichen Aggregate wurden entfernt und das Protein durch Gelfiltrationschromatographie (HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, 1 ml Schleife, 0,75 ml min) in Puffer ohne Glycerin (Puffer C: 30 mM MOPS, 50 mM KCl, pH 7,0) ausgetauscht −1). Der Peak im Bereich von 70–85 ml wurde gepoolt und die Fraktionen auf etwa 500 μl mit einer Endkonzentration von etwa 1,3 mM konzentriert.

Mex-LanM wurde wie zuvor beschrieben50 gereinigt und vor der Kristallisation in Puffer C ausgetauscht. Das Protein wurde mit 3,5 Äquivalenten NdIII (NdCl3) beladen.

Beugungsdatensätze wurden an der ID-G-Beamline des Life Sciences Collaborative Access Team gesammelt und mit dem HKL2000-Paket verarbeitet55. In allen Strukturen wurden Phaseninformationen mit phenix.autosol56,57 durch die Methode der anomalen Einzelwellenlängenbeugung erhalten, bei der mit HySS58 identifizierte Lanthanoidionen als anomale Streuer verwendet wurden. Erste Modelle wurden mit phenix.autobuild59 generiert, gefolgt von manuellen Modifikations- und Verfeinerungsrunden in Coot60 und phenix.refine61. In den letzten Phasen der Modellverfeinerung wurden die anisotropen Verschiebungsparameter und Besetzungen für alle Lanthanoidstandorte verfeinert62. Die Modellvalidierung wurde mit dem Molprobity-Server63 durchgeführt. Die Abbildungen wurden mit dem PyMOL-Softwarepaket für molekulare Grafiken (Schrödinger, LLC) erstellt.

Kristalle wurden mithilfe der Dampfdiffusionsmethode mit sitzendem Tropfen erhalten, bei der 1 μl Proteinlösung (15 mg ml−1) mit 1 μl 10 mM Trinatriumcitrat, pH 7,0 und 27 % (Gew./Vol.) PEG gemischt wurde 6000 in einer 24-Well-Platte von Hampton Research (Katalognummer HR1-002) bei Raumtemperatur. Innerhalb von 3 Tagen erschienen dünne plattenförmige Kristalle. Für die Datenerfassung geeignete Kristalle wurden auf Rayon-Schlaufen montiert, kurz in einer Kryoschutzlösung eingeweicht, die aus der mit 10 % Ethylenglykol ergänzten Bohrlochlösung bestand, und in flüssigem N2 schockgefroren.

LaIII-beladenes Hans-LanM kristallisierte in der Raumgruppe P21 (β = 90,024°) mit vier Monomeren in der asymmetrischen Einheit. Der anfängliche Gütefaktor und der Bayes'sche Korrelationskoeffizient betrugen 0,563 bzw. 0,5664. Das endgültige Modell besteht aus den Resten 24–133 in jeder Kette, 12 LaIII-Ionen (3 pro Kette in der ersten, zweiten und dritten EF-Hand), 4 NaI-Ionen65 (1 pro Kette in der vierten EF-Hand), 273 Wassermolekülen und 2 Citratmoleküle. Von den modellierten Rückständen befinden sich 100 % in zulässigen oder bevorzugten Regionen, wie aus der statistischen Analyse von Ramachandran hervorgeht.

Kristalle wurden mithilfe der Dampfdiffusionsmethode mit sitzendem Tropfen erhalten, bei der 1 μl Proteinlösung (15 mg ml−1) mit 1 μl 250 μM Trinatriumcitrat, pH 7,0 und 27 % (Gew./Vol.) gemischt wurde. PEG 6000 in einer 24-Well-Platte von Hampton Research bei Raumtemperatur. Innerhalb eines Monats bildeten sich dünne plattenförmige Kristalle. Für die Datenerfassung geeignete Kristalle wurden auf Rayon-Schlaufen montiert, kurz in einer Kryoschutzlösung eingeweicht, die aus der Bohrlochlösung, ergänzt mit Perfluorpolyether-Kryoöl von Hampton Research (Katalognummer HR2-814), bestand, und in flüssigem N2 schockgefroren.

DyIII-beladenes Hans-LanM kristallisierte in der Raumgruppe P21 (β = 93,567°) mit vier Monomeren in der asymmetrischen Einheit. Der anfängliche Gütefaktor und der Bayes'sche Korrelationskoeffizient betrugen 0,748 bzw. 0,5864. Das endgültige Modell besteht aus den Resten 24–133 in jeder Kette (mit Ausnahme der Kette D, für die die Reste 34–38 nicht modelliert werden können), 14 DyIII-Ionen (4 in den Ketten A und D, 3 in der zweiten, dritten und vierten EF-Hände). der Ketten B und C) und 656 Wassermoleküle. Von den modellierten Rückständen befinden sich 100 % in zulässigen oder bevorzugten Regionen, wie aus der statistischen Analyse von Ramachandran hervorgeht.

Die Erfassung anomaler Datensätze wird in den ergänzenden Methoden beschrieben.

Kristalle wurden mithilfe der Dampfdiffusionsmethode mit sitzendem Tropfen erhalten, bei der 1 μl Proteinlösung (35 mg ml−1) mit 1 μl 0,1 M Ammoniumsulfat, 0,1 M Tris pH 7,5 und 20 % (Gew./Vol.) gemischt wurde ) PEG 1500 in einer 24-Well-Platte von Hampton Research bei Raumtemperatur. Innerhalb von 6 Monaten bildeten sich dünne, plattenförmige Kristalle. Für die Datenerfassung geeignete Kristalle wurden auf Rayon-Schlaufen montiert, kurz in einer Kryoschutzlösung eingeweicht, die aus der Bohrlochlösung, ergänzt mit Perfluorpolyether-Kryoöl von Hampton Research, bestand, und in flüssigem N2 schockgefroren.

NdIII-beladenes Mex-LanM kristallisierte in der Raumgruppe P212121 mit einem Monomer in der asymmetrischen Einheit. Der anfängliche Gütefaktor und der Bayes'sche Korrelationskoeffizient betrugen 0,799 bzw. 0,5664. Das endgültige Modell besteht aus den Resten 29–133, 4 NdIII-Ionen und 171 Wassermolekülen. Von den modellierten Rückständen befinden sich 100 % in zulässigen oder bevorzugten Regionen, wie aus der statistischen Analyse von Ramachandran hervorgeht.

Alle Fluoreszenzdaten wurden mit einem Fluorolog-QM-Fluorometer in der Konfiguration 75-21-C (Horiba Scientific) erfasst, das mit einem Doppelmonochromator am Anregungsarm und einem Einzelmonochromator am Emissionsarm ausgestattet war. Als Lichtquelle wurde für stationäre Messungen eine 75-W-Xenonlampe und für zeitaufgelöste Messungen eine gepulste Xenonlampe verwendet. Zehn-Millimeter-Quarz-Spektrofluormetrieküvetten (Starna Cells, 18F-Q-10-GL14-S) wurden verwendet, um Daten bei 90° relativ zum Anregungspfad zu sammeln.

Messungen der Fluoreszenzlebensdauer wurden mit etablierten Methoden26,66 durchgeführt. Kurz gesagt, eine Lösung von Hans-LanM mit 2 Äquivalenten EuIII hinzugefügt, insgesamt 4,5 ml, wurde in 100 % H2O-Matrix hergestellt (Puffer: 25 mM HEPES, 75 mM KCl, pH 7,0). Die Hälfte dieser anfänglichen Proteinmischung (2,25 ml) wurde für die zukünftige Verwendung aufbewahrt und der Rest wurde durch Lyophilisierung zur Entfernung von H2O und zweimaliges Resuspendieren in 99,9 % D2O in D2O umgewandelt. Die resultierenden Proteinlösungen (in 100 % H2O und etwa 99 % D2O) wurden in unterschiedlichen Verhältnissen gemischt, um D2O-Gehalte von 0 %, 25 %, 50 % und 75 % zu erzeugen. Die Proteinkonzentration betrug 20 µM. Für jede Probe wurde die Lumineszenzabklingzeitkonstante (τ) gemessen (λex = 394 nm, λem = 615 nm) mit 5.000 Aufnahmen über einen Zeitraum von 2.500 μs. τ wurde mit der FelixFL Powerfit-10-Software (Horiba Scientific) unter Verwendung einer einzelnen exponentiellen Anpassung bestimmt. 1/τ wurde gegen die prozentuale Zusammensetzung von D2O aufgetragen und die Steigung der resultierenden Linie (m) wurde bestimmt. Der q-Wert wurde unter Verwendung der folgenden Gleichung aus Lit. bestimmt. 67:

wobei τ−1H2O und τ−1D2O die Kehrwerte der Zeitkonstanten in 100 % H2O bzw. D2O (letzteres extrapoliert unter Verwendung der Gleichung der angepassten Linie) in ms–1 sind; und nOH = 0, nNH = 0 und nO–CNH = 1 (resultierend aus den metallkoordinierten Asn-Resten), basierend auf den Hans-LanM-Kristallstrukturen. Diese Gleichung vereinfacht sich zu:

Für Fluoreszenzkonkurrenzexperimente wurde eine Lösung von 20 μM Hans-LanM oder der R100K-Variante in Puffer A (pH 5,0) mit zwei Äquivalenten Metall (40 μM) hergestellt. Fluoreszenzemissionsspektren wurden mit folgenden Einstellungen aufgenommen: λex = 278 nm, λem 300–420 nm, Integrationszeit = 0,5 s, Schrittgröße = 1 nm. Die Titrationen erfolgten durch Zugabe von mindestens 0,6 μl Titriermittel (aus konzentrierten Stammlösungen von 10 mM–1 M Citrat oder Malonat, pH 5,0). Die Spektren wurden hinsichtlich der Verdünnung korrigiert. Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt.

Hans-LanM(R100K)-Cys wurde wie für Mex-LanM-Cys (Lit. 6) beschrieben exprimiert und gereinigt, mit einer Endausbeute von 50 mg Protein pro Liter Kultur. Für Hans-LanM-Cys wurde das Protein gereinigt, indem die gleichen Modifikationen wie oben, abzüglich des Dialyseschritts, in unsere zuvor beschriebene Mex-LanM-Cys-Reinigung übernommen wurden, mit der Ausnahme, dass der SEC-Schritt unter Verwendung eines reduzierenden Puffers (30 mM MOPS) durchgeführt wurde , 100 mM KCl, 5 mM TCEP, pH 7,0) mit 5 mM EDTA und vor der Immobilisierung unter flüssigem N2 eingefroren.

Die Maleimidfunktionalisierung aminfunktionalisierter Agarosekügelchen wurde bereits beschrieben6. Ausführliche Informationen finden Sie in den Zusatzinformationen.

Die Immobilisierung von Hans-LanM(R100K) wurde mithilfe einer Thiol-Maleimid-Konjugationsreaktion wie zuvor beschrieben6 durchgeführt. Im Fall von Hans-LanM wurde eine Endproteinkonzentration von etwa 0,4 mM (8 ml) mit 1 ml Maleimid-Mikrokügelchen kombiniert und die Konjugationsreaktion 16 Stunden lang bei Raumtemperatur durchgeführt. Nicht konjugiertes Hans-LanM wurde durch Waschen mit Kopplungspuffer entfernt und die Hans-LanM-Mikrokügelchen wurden für nachfolgende Tests im Kopplungspuffer aufbewahrt. Zur Quantifizierung der Hans-LanM-Immobilisierungsausbeute wurde der Pierce BCA Protein Assay (ThermoFisher Scientific) verwendet, um die LanM-Konzentration in der Reaktionslösung vor und nach der Konjugationsreaktion wie zuvor beschrieben zu bestimmen.

LanM-immobilisierte Mikrokügelchen wurden mit entionisiertem Wasser gewaschen. Feed-Lösung (5 ml, äquimolare REs La–Dy, insgesamt 3 mM, pH 5,0) wurde zu 1 ml Mikrokügelchen gegeben und 2 Stunden lang inkubiert. Die Flüssigkeit im Gleichgewicht wurde gesammelt und die SE-Konzentrationen wurden durch Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma als [M]ad bestimmt. Dann wurden 4 ml 0,1 M HCl verwendet, um REs aus den Mikrokügelchen zu desorbieren, und die Konzentrationen wurden durch Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma als [M]de gemessen.

Der RE-Verteilungsfaktor (D) zwischen der LanM-Phase und der Lösungsphase wurde wie folgt berechnet:

wobei [M]LanM und [M]Liquid die molaren Konzentrationen jedes Metallions in der LanM-Phase bzw. der Lösungsphase im Gleichgewicht sind. Um die freie Flüssigkeit zu berücksichtigen, die auf den Agarose-Mikrokügelchen absorbiert wurde, wurde die folgende Korrektur angewendet: [M]Liquid = [M]ad; [M]LanM = (4 × [M]de – [M]ad)/4.

Der Trennfaktor ist definiert als:

wobei DRE1 und DRE2 die Verteilungsfaktoren von RE1 bzw. RE2 sind.

Die Säulen wurden gefüllt und betrieben und die Metallkonzentrationen analysiert, wie in unserer vorherigen Arbeit beschrieben6; Einzelheiten finden Sie in den ergänzenden Methoden.

Für die SE-Paartrennungsexperimente werden die Metallionenreinheit und -ausbeute wie folgt definiert:

wobei CRE1 und CRE2 die molaren Konzentrationen von RE1 bzw. RE2 sind.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle Daten sind im Haupttext oder in den Zusatzinformationen verfügbar. Die Koordinaten wurden in der Proteindatenbank mit den Zugangscodes 8DQ2 (LaIII–Hans-LanM), 8FNR (DyII–Hans-LanM) und 8FNS (NdIII–Mex-LanM) hinterlegt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Cheisson, T. & Schelter, EJ Seltenerdelemente: Mendelejews Fluch, moderne Wunder. Wissenschaft 363, 489–493 (2019).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Nash, KL & Jensen, MP Trennungen der Lanthanoide im analytischen Maßstab: ein Überblick über Techniken und Grundlagen. Sep. Sci. Technol. 36, 1257–1282 (2001).

Artikel CAS Google Scholar

Xie, F., Zhang, TA, Dreisinger, D. & Doyle, F. Eine kritische Übersicht über die Lösungsmittelextraktion seltener Erden aus wässrigen Lösungen. Bergmann. Ing. 56, 10–28 (2014).

Artikel CAS Google Scholar

Cotruvo, JA Jr, Featherston, ER, Mattocks, JA, Ho, JV & Laremore, TN Lanmodulin: ein hochselektives Lanthanid-bindendes Protein aus einem Lanthanid-verwertenden Bakterium. Marmelade. Chem. Soc. 140, 15056–15061 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cook, EC, Featherston, ER, Showalter, SA & Cotruvo, JA Jr. Strukturelle Grundlage für die Erkennung seltener Erdelemente durch Methylobacterium extorquens Lanmodulin. Biochemie 58, 120–125.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Dong, Z. et al. Verbindung von Hydrometallurgie und Biochemie: ein proteinbasierter Prozess zur Gewinnung und Trennung von Seltenerdelementen. ACS Cent. Wissenschaft. 7, 1798–1808 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shannon, RD Überarbeitete effektive Ionenradien und systematische Untersuchungen interatomarer Abstände in Halogeniden und Chalkogeniden. Acta Cryst. A 32, 751–767 (1976).

Artikel Google Scholar

Deblonde, GJP, Chagnes, A. & Cote, G. Jüngste Fortschritte in der Chemie hydrometallurgischer Methoden. Sep. Purif. Rev. https://doi.org/10.1080/15422119.2022.2088389 (2022).

Vahidi, E. & Zhao, F. Ökologische Ökobilanz zur Abtrennung von Seltenerdoxiden durch Lösungsmittelextraktion. J. Umgebung. Verwalten. 203, 255–263 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jensen, MP et al. Trennung von dreiwertigem Americium von Curium und den Lanthaniden durch Lösungsmittelextraktion. Lösungsmittelextr. Ionenaustausch. 33, 329–345 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Bogart, JA et al. Einfache, löslichkeitsbasierte Trennungen von Seltenerdelementen mit Komplexen, die größenabhängige Molekülöffnungen tragen. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 113, 14887–14892 (2016).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Healy, MR et al. Effiziente Trennung leichter Lanthanoide (III) durch Verwendung von Bis-Lactam-Phenanthrolin-Liganden. Chem. EUR. J. 25, 6326–6331.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Thiele, NA, Fiszbein, DJ, Woods, JJ & Wilson, JJ Optimierung der Trennung leichter Lanthanide mithilfe eines selektiven wässrigen Komplexbildners mit umgekehrter Größe. Inorg. Chem. 59, 16522–16530 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Slope, LN, Daubney, OJ, Campbell, H., White, SA & Peacock, AFA Ortsabhängige Lanthanoid-Selektivität, die in strukturell charakterisierte, gewickelte Spulen integriert wurde. Angew. Chem. Int. Ed. 60, 24473–24477 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Fang, H. et al. Elektrokinetische Trennung von Seltenerdelementen mithilfe eines redoxaktiven Liganden. Angew. Chem. Int. Ed. 56, 13450–13454 (2017).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Demir, S. et al. Extraktion von Lanthanid- und Actinid-Ionen aus wässrigen Gemischen unter Verwendung eines Carbonsäure-funktionalisierten porösen aromatischen Gerüsts. ACS Cent. Wissenschaft. 2, 253–265 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Park, DM et al. Bioadsorption von Seltenerdelementen durch die Darstellung von Lanthanoid-Bindungsmarkierungen auf der Zelloberfläche. Umgebung. Wissenschaft. Technol. 50, 2735–2742 (2016).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Deblonde, GJ-P. et al. Selektive und effiziente biomakromolekulare Extraktion von Seltenerdelementen mit Lanmodulin. Inorg. Chem. 59, 11855–11867 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lumpe, H. et al. Je früher, desto besser: Strukturanalyse und Trennung von Lanthaniden mit Pyrrolochinolinchinon. Chem. EUR. J. 26, 10133–10139 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ding, Y., Harvey, D. & Wang, N.-HL Zweizonen-Liganden-unterstützte Verdrängungschromatographie zur Herstellung von hochreinem Praseodym, Neodym und Dysprosium mit hoher Ausbeute und hoher Produktivität aus Rohmischungen aus Abfallmagneten. Grüne Chem. 22, 3769–3783 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Deblonde, GJP et al. Charakterisierung von Americium- und Curiumkomplexen mit dem Protein Lanmodulin: ein potenzieller makromolekularer Mechanismus für die Mobilität von Aktiniden in der Umwelt. Marmelade. Chem. Soc. 143, 15769–15783 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Deblonde, GJ-P. et al. Einfangen eines schwer fassbaren, aber entscheidenden Elements: Natürliches Protein ermöglicht die Aktiniumchemie. Wissenschaft. Adv. 7, eabk0273 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mattocks, JA, Cotruvo, JA Jr. & Deblonde, GJP Entwicklung der Selektivität von Lanmodulin für Actiniden gegenüber Lanthaniden durch Steuerung der Lösungsmittelkoordination und Wechselwirkungen in der zweiten Sphäre. Chem. Wissenschaft. 13, 6054–6066 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Singer, H., Drobot, B., Zeymer, C., Steudtner, R. & Daumann, LJ Americium bevorzugt: Lanmodulin, ein natürliches Lanthanoid-bindendes Protein, bevorzugt ein Actinid gegenüber Lanthaniden. Chem. Wissenschaft. 12, 15581–15587 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mattocks, JA, Ho, JV & Cotruvo, JA Jr. Ein selektiver, proteinbasierter Fluoreszenzsensor mit pikomolarer Affinität zu Seltenerdelementen. Marmelade. Chem. Soc. 141, 2857–2861 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Featherston, ER, Issertell, EJ & Cotruvo, JA Jr. Die Untersuchung der Lanthanid-Erkennung von Lanmodulin mittels sensibilisierter Lumineszenz liefert eine Plattform für die Quantifizierung von Terbium in sauren Minenentwässerungen. Marmelade. Chem. Soc. 143, 14287–14299 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hussain, Z. et al. Wiederholte Gewinnung von Seltenerdelementen mithilfe eines hochselektiven und thermoresponsiven genetisch kodierten Polypeptids. Adv. Funktion. Mater. 32, 2109158 (2022).

Artikel MathSciNet CAS Google Scholar

Agafonova, NV, Kaparullina, EN, Grouzdev, DS & Doronina, NV Hansschlegelia quercus sp. nov., ein neuartiges methylotrophes Bakterium, das aus Eichenknospen isoliert wurde. Int. J. Syst. Entwicklung Mikrobiol. 70, 4646–4652 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Renner, M., Danielson, MA & Falke, JJ Kinetische Kontrolle der Ca(II)-Signalübertragung: Abstimmung der Ionendissoziationsraten von EF-Hand-Ca(II)-Bindungsstellen. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 90, 6493–6497 (1993).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zallot, R., Oberg, N. & Gerlt, JA Die EFI-Webressource für genomische Enzymologie-Tools: Nutzung von Protein-, Genom- und Metagenom-Datenbanken zur Entdeckung neuer Enzyme und Stoffwechselwege. Biochemistry 58, 4169–4182 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lidstrom, ME in The Prokaryotes Vol. 2 (Hrsg. Dworkin, M. et al.) 618–634 (Springer, 2006).

Mattocks, JA, Tirsch, JL & Cotruvo, JA Jr. Bestimmung der Affinitäten von Lanthanoid-bindenden Proteinen mittels chelatorgepufferter Titrationen. Methoden Enzymol. 651, 23–61 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Pol, A. et al. Seltenerdmetalle sind für methanotrophes Leben in vulkanischen Schlammtöpfen unerlässlich. Umgebung. Mikrobiol. 16, 255–264 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wehrmann, M., Billard, P., Martin-Meriadec, A., Zegeye, A. & Klebensberger, J. Funktionelle Rolle von Lanthaniden bei der enzymatischen Aktivität und Transkriptionsregulation von Pyrrolochinolinchinon-abhängigen Alkoholdehydrogenasen in Pseudomonas putida KT2440. mBio 8, e00570-17 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Gut, NM et al. Die Hyperakkumulation von Gadolinium durch Methylorubrum extorquens AM1 zeigt Auswirkungen von Lanthaniden auf zelluläre Prozesse, die über die Methylotrophie hinausgehen. Vorderseite. Mikrobiol. https://doi.org/10.3389/fmicb.2022.820327 (2022).

Grant, TD Ab-initio-Bestimmung der Elektronendichte direkt aus Lösungsstreuungsdaten. Nat. Methoden 15, 191–193 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Deng, YW, Ro, SY & Rosenzweig, AC Struktur und Funktion der Lanthanid-abhängigen Methanoldehydrogenase XoxF aus dem Methanotrophen Methylomicrobium buryatense 5GB1C. J. Biol. Inorg. Chem. 23, 1037–1047 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Habenschuss, A. & Spedding, FH Die Koordination (Hydratation) von Seltenerdionen in wässrigen Chloridlösungen aus Röntgenbeugung. II. LaCl3, PrCl3 und NdCl3. J. Chem. Physik. 70, 3758–3763 (1979).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Hu, A., MacMillan, SN & Wilson, JJ Makrozyklische Liganden mit einem beispiellosen Größenselektivitätsmuster für die Lanthanoidionen. Marmelade. Chem. Soc. 142, 13500–13506 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Choi, TS & Tezcan, FA Überwindung universeller Einschränkungen der Metallselektivität durch Proteindesign. Natur 603, 522–527 (2022).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Altschul, SF et al. Gapped BLAST und PSI-BLAST: eine neue Generation von Proteindatenbank-Suchprogrammen. Nukl. Säuren Res. 25, 3389–3402 (1997).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Teufel, F. et al. SignalP 6.0 sagt alle fünf Arten von Signalpeptiden mithilfe von Proteinsprachmodellen voraus. Nat. Biotechnologie. 40, 1023–1025 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shannon, P. et al. Cytoscape: eine Softwareumgebung für integrierte Modelle biomolekularer Interaktionsnetzwerke. Genomres. 13, 2498–2504 (2003).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

R-Kernteam. R: Eine Sprache und Umgebung für statistische Berechnungen. http://www.R-project.org/ (R Foundation for Statistical Computing, Wien 2018).

Edgar, RC Hochpräzise Alignment-Ensembles ermöglichen unvoreingenommene Bewertungen der Sequenzhomologie und Phylogenie. Nat. Komm. https://doi.org/10.1038/s41467-022-34630-w (2022).

Kalyaanamoorthy, S., Minh, BQ, Wong, TKF, von Haeseler, A. & Jermiin, LS ModelFinder: schnelle Modellauswahl für genaue phylogenetische Schätzungen. Nat. Methoden 14, 587–589 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Minh, BQ et al. IQ-TREE 2: Neue Modelle und effiziente Methoden zur phylogenetischen Inferenz im genomischen Zeitalter. Mol. Biol. Entwicklung 37, 1530–1534 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bouckaert, R. et al. BEAST 2.5: eine fortschrittliche Softwareplattform für die Bayes'sche Evolutionsanalyse. PLoS Comput. Biol. 15, e1006650 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yu, G., Smith, DK, Zhu, H., Guan, Y. & Lam, TT ggtree: ein R-Paket zur Visualisierung und Annotation phylogenetischer Bäume mit ihren Kovariaten und anderen zugehörigen Daten. Methoden Ecol. Entwicklung 8, 28–36 (2017).

Artikel Google Scholar

Featherston, ER, Mattocks, JA, Tirsch, JL & Cotruvo, JA Jr. Heterologe Expression, Reinigung und Charakterisierung von Proteinen im Lanthanom. Methoden Enzymol. 650, 119–157 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gasteiger, E. et al. in The Proteomics Protocols Handbook (Hrsg. Walker, JM) 571–607 (Humana, 2005).

Manalastas-Cantos, K. et al. ATSAS 3.0: erweiterte Funktionalität und neue Tools für die Analyse von Kleinwinkelstreudaten. J. Appl. Kristall. 54, 343–355 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Franke, D. et al. ATSAS 2.8: eine umfassende Datenanalysesuite für Kleinwinkelstreuung aus makromolekularen Lösungen. J. Appl. Kristall. 50, 1212–1225 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Konarev, PV, Volkov, VV, Sokolova, AV, Koch, MHJ & Svergun, DI PRIMUS – ein Windows-PC-basiertes System für die Analyse von Kleinwinkelstreuungsdaten. J. Appl. Kristall. 36, 1277–1282 (2003).

Artikel CAS Google Scholar

Otwinowski, Z. & Minor, W. Verarbeitung von im Oszillationsmodus gesammelten Röntgenbeugungsdaten. Methoden Enzymol. 276, 307–326 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

McCoy, AJ, Storoni, LC & Read, RJ Einfacher Algorithmus für eine Maximum-Likelihood-SAD-Funktion. Acta Crystallogr. D 60, 1220–1228 (2004).

Artikel PubMed Google Scholar

Zwart, PH et al. Automatisierte Strukturlösung mit der PHENIX Suite. Methoden Mol. Biol. 426, 419–435 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Grosse-Kunstleve, RW & Adams, PD Substruktursuchverfahren für makromolekulare Strukturen. Acta Crystallogr. D 59, 1966–1973 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Terwilliger, TC et al. Iterative Modellbildung, Strukturverfeinerung und Dichteänderung mit dem PHENIX AutoBuild-Assistenten. Acta Crystallogr. D 64, 61–69 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Emsley, P. & Cowtan, K. Coot: Modellbauwerkzeuge für molekulare Grafiken. Acta Crystallogr. D 60, 2126–2132 (2004).

Artikel PubMed Google Scholar

Afonine, PV et al. Auf dem Weg zur automatisierten kristallographischen Strukturverfeinerung mit phenix.refine. Acta Crystallogr. D 68, 352–367 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Adams, PD et al. PHENIX: ein umfassendes Python-basiertes System zur Lösung makromolekularer Strukturen. Acta Crystallogr. D 66, 213–221 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, VB et al. MolProbity: Validierung der Gesamtatomstruktur für die makromolekulare Kristallographie. Acta Crystallogr. D 66, 12–21 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Doutch, J., Hough, MA, Hasnain, SS & Strange, RW Herausforderungen der Schwefel-SAD-Phaseneinstellung als Routinemethode in der makromolekularen Kristallographie. J. Synchrotron Rad. 19, 19–29 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Zheng, H. et al. CheckMyMetal: ein Validierungstool für makromolekulare Metallbindungen. Acta Crystallogr. D 73, 223–233 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Chaudhuri, D., Horrocks, WD, Amburgey, JC & Weber, DJ Charakterisierung der Bindung von Lanthanoidionen an das EF-Hand-Protein S100β durch Lumineszenzspektroskopie. Biochemistry 36, 9674–9680 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Supkowski, RM & Horrocks, WD Zur Bestimmung der Anzahl von Wassermolekülen q, die an Europium(III)-Ionen in Lösung koordiniert sind, anhand der Lebensdauer des Lumineszenzzerfalls. Inorg. Chim. Acta 340, 44–48 (2002).

Artikel CAS Google Scholar

Seitz, M., Oliver, AG & Raymond, KN Die Lanthanoidkontraktion erneut aufgegriffen. Marmelade. Chem. Soc. 129, 11153–11160 (2007).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cramer, RE, Rimsza, JM & Boyle, TJ Die Lanthanoidkontraktion ist eine Variable. Inorg. Chem. 61, 6120–6127 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Drake, SK, Lee, KL & Falke, JJ Abstimmung der Gleichgewichtsionenaffinität und -selektivität des EF-Hand-Calciumbindungsmotivs: Substitutionen an der Gateway-Position. Biochemistry 35, 6697–6705 (1996).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

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Diese Arbeit wurde hauptsächlich durch den Zuschuss DE-SC0021007 des Energieministeriums (DOE) (an JAC) sowie durch den NSF-Zuschuss CHE-1945015 (an JAC) finanziell unterstützt, wodurch die Hans-LanM- bzw. Mex-LanM-Arbeit unterstützt wurde. AKB dankt dem National Institutes of Health-Stipendium GM119707 und C.-YL dankt einem Stipendium des Jane Coffin Childs Memorial Fund for Medical Research. DMP, CSK-Y. und ZD danken dem Critical Materials Institute für die finanzielle Unterstützung, einem Energieinnovationszentrum, das vom DOE, Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, Advanced Materials and Manufacturing Technologies Office, finanziert wird. Ein Teil dieser Arbeit wurde unter der Schirmherrschaft des DOE vom Lawrence Livermore National Laboratory unter dem Vertrag DEAC52-07NA27344 (LLNL-JRNL-840467) durchgeführt. Diese Forschung nutzte Ressourcen der Advanced Photon Source, einer Benutzereinrichtung des DOE Office of Science, die vom Argonne National Laboratory unter der Vertragsnummer DE-AC02-06CH11357 betrieben wird. Der Einsatz des Life Sciences Collaborative Access Team Sector 21 wurde von der Michigan Economic Development Corporation und dem Michigan Technology Tri-Corridor (Zuschuss 085P1000817) unterstützt. NHY würdigt die SIG-Auszeichnungen S10-OD0215145 der National Institutes of Health für die isotherme Titrationskalorimetrie-Instrumentierung, S10-OD028589 für die SAXS-Instrumentierung und S10-OD030490 für das SEC-MALS-dynamische Lichtstreuungssystem. Wir danken J. Fecko für experimentelle Unterstützung und Y. Jiao und G. Deblonde für Diskussionen.

Fakultät für Chemie, Pennsylvania State University, University Park, PA, USA

Joseph A. Mattocks, Jonathan J. Jung, Chi-Yun Lin, Emily R. Featherston, Timothy A. Hamilton, Amie K. Boal und Joseph A. Cotruvo Jr

Critical Materials Institute, Direktion für Physik und Biowissenschaften, Lawrence Livermore National Laboratory, Livermore, CA, USA

Ziye Dong, Christina S. Kang-Yun und Dan M. Park

Die Huck Institutes of the Life Sciences, die Pennsylvania State University, University Park, PA, USA

Neela H. Yennawar

Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie, Pennsylvania State University, University Park, PA, USA

Amie K. Boal

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JAC identifizierte Hans-LanM und konzipierte und leitete die Studie. JAM reinigte Hans-LanM und führte die meisten biochemischen Analysen durch, mit Unterstützung von TAHJJJ kristallisierte die Proteine, und JJJ und C.-YL lösten die Strukturen mit Input von AKBNHY, führten SAXS-Studien durch und überwachten einige biophysikalische Datensammlungen. ERF gereinigtes Mex-LanM. CSK-Y. führte bioinformatische Analysen durch. ZD führte Metalltrennungsexperimente mit Beiträgen von DMPJAM durch, NHY, AKB und JAC verfassten den Artikel mit Beiträgen aller Autoren. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript bearbeitet und genehmigt.

Korrespondenz mit Dan M. Park, Amie K. Boal oder Joseph A. Cotruvo Jr.

JAM, JJJ, C.-YL, ZD, ERF, CSK-Y., DMP, AKB und JAC sind Erfinder einer auf dieser Arbeit basierenden Patentanmeldung der Pennsylvania State University.

Nature dankt Scott Banta und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Der Hans-Cluster umfasst LanMs von Bakterien der Gattungen Hansschlegelia, Ancylobacter, Methylopila, Oharaeibacter, Starkeya und Xanthobacter. Obwohl diese Gattungen auf diesen Cluster beschränkt sind, sind Mitglieder auf Familienebene im gesamten Netzwerk verstreut zu finden, darunter ein Xanthobacteraceae und 42 Methylocystaceae.

Sowohl DyIII (bis zu 0,3 µM) als auch CaII (bis zu 5,5 mM) induzieren eine ähnliche, unvollständige Konformationsänderung im Protein im Vergleich zu der durch NdIII und LaIII induzierten Konformationsänderung. Die Daten im rechten Feld von a sind eine repräsentative Titration der drei Datensätze, die zur Erstellung des Diagramms im linken Feld verwendet wurden. Die Daten in b und c sind repräsentative Titrationen aus den drei Datensätzen, die zur Erstellung des Diagramms in Abb. 1d verwendet wurden. Bedingungen: 15 μM Protein, 20 mM Acetat, 100 mM KCl, 10 mM EDTA (für Ca- und Nd-Titrationen) oder EGTA (für Dy-Titration), 0–10 mM Metallion. Jeder Datenpunkt in (a, linkes Feld) ist der Mittelwert ± Standardabweichung für drei unabhängige Messungen.

Quelldaten

a, Gesamtstruktur der asymmetrischen Einheit, die aus zwei Hans-LanM-Dimeren und zwei Citratmolekülen aus der Kristallisationslösung besteht. Die Struktur jedes Monomers des Dimers stimmt mit der NMR-Lösungsstruktur von YIII-gebundenem Mex-LanM überein, wobei die EF-Hände 2 und 3 gepaart sind und die EF-Hände 1 und 4 gepaart sind5. b–e, Details der Metallkoordination in den vier EF-Händen von LaIII-Hans-LanM. Die Koordinationssphären der LaIII-Ionen in den EF-Händen 1, 2 und 3 bestehen aus der Seitenkette Oδ von N1 (einzähnig), den Carboxylatseitenketten von D3, D5, E9 und E12 (alle zweizähnig) und a Rückgrat-Carbonyl aus S7 (EF1) oder T7 (EF2 und EF3), was einer Gesamtkoordinationszahl von 10 entspricht. Alle LaIII-Ligand-Abstände betragen 2,5–2,7 Å. Der Kristallradius für 10-koordiniertes LaIII wird von Shannon mit 1,41 Å angegeben;7 wenn man 1,26 Å als Radius von 6-koordiniertem O2- angibt, wird 2,57 Å für den LaIII-O-Abstand geschätzt, was mit unseren Ergebnissen übereinstimmt. Das Metallion in EF4 wurde aufgrund der kürzeren Metall-Ligand-Abstände, der niedrigeren Koordinationszahl und der Anwesenheit von Natrium in der Kristallisationslösung als NaI modelliert. CaII kann nicht vollständig ausgeschlossen werden, da es schon früher bei der Proteinreinigung vorhanden war; Allerdings wurde das Protein am Ende der Reinigung mit Chelex behandelt und die kristallographischen Daten stimmten mit der vom CheckMyMetal-Server ermittelten NaI-Zuordnung überein65. Dieses Ion wird in einer verzerrten fünfeckigen bipyramidalen Geometrie durch einzähnige D1-, N3- und D5-Seitenketten, die zweizähnige E12-Seitenkette, das Rückgrat-Carbonyl von Lys113 und ein einzelnes Lösungsmittelmolekül koordiniert, was einer Gesamtkoordinationszahl von 7 entspricht. Die NaI-Protein-Ligandenabstände betragen 2,3–2,5 Å, mit einem Lösungsmittelmolekül bei 2,7 Å. Im Fall von Mex-LanM haben biochemische Daten4,26 und NMR-Spektroskopie5 auch gezeigt, dass EF4 eine schlechte Lanthanid-Bindungsstelle ist, und es wurde ohne ein Metallion in der NMR-Lösungszustandsstruktur modelliert5.

a, eines der Dimere in der asymmetrischen Einheit, bestehend aus den Ketten A und B. Beachten Sie, dass EF4 unerwartet mit DyIII besetzt ist, während EF1 nur in Kette A besetzt ist. b, Gesamtstruktur der asymmetrischen Einheit, die aus zwei Hans-LanM besteht Dimere. Im Gegensatz zur LaIII-Hans-LanM-Struktur weisen die beiden Dimere – und die Monomere innerhalb jedes Dimers – bei DyIII-Hans-LanM erhebliche Unterschiede auf. EF2-4 sind in allen Ketten durch DyIII besetzt, wohingegen EF1 nur in Kette A besetzt und geordnet ist; In den Ketten B und C ist kein Metallion in der EF-Hand gebunden, und in Kette D ist ein DyIII-Ion gebunden, aber die ersten fünf Reste von EF1 (Asn34 – Asp38) konnten nicht modelliert werden. Unsere Entscheidung, DyIII in alle vier EF-Hände zu modellieren, wird durch anomale Beugungsdatensätze gestützt (Ergänzungstabellen 9–10, Ergänzende Abbildungen 25–26). Die biochemischen Daten deuten darauf hin, dass in Lösung mindestens eine DyIII-Bindungsstelle schwach ist (siehe Abb. 1d und ergänzende Abb. 2), und basierend auf Studien mit Mex-LanM ist es wahrscheinlich, dass EF2/3 die engeren Bindungsstellen sind. Dieser Vorschlag wird durch die Dy-Anomaldaten (Ergänzungstabelle 10) gestützt, und die Besetzung schwacher Metallbindungsstellen resultiert wahrscheinlich aus der hohen Proteinkonzentration, die für die Kristallographie verwendet wird. c, Details der Metallkoordination in den EF-Händen von DyIII-Hans-LanM. In der oberen Reihe sind die drei verschiedenen EF1-Strukturen in der asymmetrischen Einheit dargestellt. Nur in Kette A ist die EF1-Metallstelle nahezu identisch mit den Stellen in EF2 und EF3 (im Gegensatz zu LaIII-Hans-LanM, wo EF1-3-Stellen sehr ähnlich sind, Extended Data Abb. 3). In EF1 (Kette A), EF2 und EF3 sind die koordinierenden Liganden dieselben wie bei LaIII-Hans-LanM, mit der Ausnahme, dass die E9-Reste (Glu42, Glu66 und Glu91) zur einzähnigen Koordination verschoben wurden, was zu einer 9-Koordination führt . Die niedrigere Koordinationszahl mit DyIII steht im Einklang mit der Lanthanoidkontraktion68,69 und wird bei anderen Liganden beobachtet (ein aktuelles Beispiel, Lit. 39). Die DyIII-Ligand-Abstände betragen meist 2,3–2,5 Å, etwa 0,2 Å kürzer als für LaIII-Hans-LanM. In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung wird der Kristallradius für 9-koordiniertes DyIII von Shannon7 mit 1,22 Å angegeben, was 0,19 Å kürzer ist als für 10-koordiniertes LaIII (Extended Data Abb. 3). Die Carboxylatverschiebung des Glu-Rests an der 9. Position ist bemerkenswert, da diese Position für die Gating-Affinität und -Selektivität in anderen EF-Hand-Proteinen wichtig ist70. In EF4 ist DyIII 7-koordiniert mit fünfeckiger bipyramidaler Geometrie, ähnlich der Natriumstelle in LaIII-Hans, jedoch mit etwas kürzeren Metall-Ligand-Abständen (2,2–2,5 Å); Auch hier stimmen diese Abstände mit der Erwartung für 7-koordiniertes DyIII überein (Lit. 7).

Die Emissionswerte werden für die Fluoreszenz des Apoproteins auf 1,0 normiert. Beachten Sie, dass die Fluoreszenzintensität der Trp-Reste von Hans-LanM vom RE-gebundenen zum Apo-Zustand abnimmt (ergänzende Abbildung 30), wohingegen die Intensität der Tyr-Reste von Mex vom RE-gebundenen zum Apo-Zustand zunimmt 4, 6. Ausgangsbedingungen: 20 μM Protein, 40 μM RE, 20 mM Acetat, 100 mM KCl, pH 5,0, für alle Experimente, in die steigende Konzentrationen an Citrat eintitriert wurden. Die Citratkonzentrationen, bei denen 50 % jedes Metalls unter diesen Bedingungen desorbiert werden ([Citrat] 1/2), sind in der Ergänzungstabelle 11 zusammengefasst und in Abb. 4a dargestellt. a, Hans-LanM. b, Hans-LanM(R100K). Der komprimierte Unterschied zwischen den [Citrat]1/2-Werten für La und Nd in Hans-LanM(R100K) im Vergleich zu Wildtyp-Hans-LanM veranschaulicht die Rolle der Dimerisierung bei der Verstärkung der Affinitätsunterschiede für die LREs, insbesondere LaIII. c, Mex-LanM. Nd- und Dy-Daten wurden von Dong et al.6 berichtet. d, Vergleich der Verhältnisse des [Citrat]1/2-Werts für Nd zu dem für Dy für jedes Protein, was die größere Nd/Dy-Selektivität von Hans-LanM im Vergleich zu Mex-LanM veranschaulicht. Die Verhältnisse für Wildtyp-Hans-LanM und die R100K-Variante unterscheiden sich im zweiseitigen t-Test nicht signifikant (p > 0,05), was darauf hindeutet, dass das Wasserstoffbrückennetzwerk, an dem Arg100 beteiligt ist, relativ wenig zur NdIII/HRE-Selektivität beiträgt wirkt sich erheblich auf die LaIII-Selektivität aus (Abb. 4a). Alle Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (a–c) oder Standardabweichung (d) für Daten aus drei unabhängigen Experimenten angezeigt.

Quelldaten

Das Desorptionsschema bestand aus drei abgestuften Konzentrationen von Malonat (30, 50, 90 mM; siehe rechte Achse), gefolgt von HCl mit einem pH-Wert von 1,5. Die Ergebnisse zeigten, dass mit Hans-LanM im Vergleich zur R100K-Variante Dy mit etwas geringerer Reinheit erzeugt wurde (83,6 % vs. 98 % Dy-Reinheit bei ähnlicher Ausbeute; vergleiche mit Abb. 4d). Während in Gleichgewichtsbindungsexperimenten mit La-Dy ähnliche Selektivitätsprofile für die immobilisierten Proteine ​​für La bis Gd beobachtet wurden, divergierte das Selektivitätsmuster bei Tb (Abb. 4c). Der Selektivitätsunterschied zwischen Hans-LanM und der R100K-Variante wurde durch die Verwendung eines Nd/Dy-Binärsystems bestätigt, da die Unsicherheiten bei der Bestimmung des Verteilungsfaktors für Dy in der 9-Elemente-RE-Gruppe die Unterscheidung kleiner Unterschiede im Dy/Dy-System unmöglich machten. Nd-Trennfaktor zwischen Proteinen (Ergänzungstabellen S13–S14). In diesem binären Nd/Dy-Experiment (erweiterte Datentabelle 3) haben wir einen Trennfaktor von 8,12 ± 0,40 für Hans-LanM und 12,7 ± 1,3 für die R100K-Variante ermittelt, was mit der verbesserten Dy-Trennwirksamkeit von R100K übereinstimmt. Die Ergebnisse stimmen zwar mit den aus dem 9-Elemente-Experiment abgeleiteten Werten überein, unterscheiden sich jedoch geringfügig von den Gleichgewichtsbindungsergebnissen mit den freien Proteinen Hans-LanM und Hans-LanM(R100K), die eine ähnlich hohe Selektivität für Nd gegenüber Dy zeigten (Abb. 4a). ,b), was wahrscheinlich auf eine schwächere LRE-induzierte Dimerisierung in der R100K-Variante bei der niedrigen Proteinkonzentration (20 µM) der Lösungsexperimente mit freiem Protein zurückzuführen ist. Die La/Nd-Selektivität auf der Säule unterscheidet sich auch von der, die mit den scheinbaren Kd-Werten der freien Proteine ​​(Wildtyp und R100K) in Lösung beobachtet wird, obwohl die Experimente mit freien Proteinen Einzelelementlösungen verwendeten und Effekte aus der Bindung gemischter Metalle auftreten können Auswirkungen auf die Daten in der Spalte haben. Die R100K-Variante verhält sich auch auf der Säule besser, wie die 2:1-RE:Protein-Stöchiometrie zeigt. Eine mögliche Erklärung für diese Ergebnisse könnte sein, dass die Immobilisierung die Dimerisierung beeinträchtigt; Abb. 2b zeigt jedoch die N- und C-Termini des Hans-LanM-Dimers, was darauf hinweist, dass die C-Termini etwa 20 Å vom nächstgelegenen Teil der Dimerschnittstelle entfernt sind, was darauf hindeutet, dass keine Störung durch die Immobilisierung an sich zu erwarten ist diese Schnittstelle. Es muss jedoch berücksichtigt werden, dass für ein funktionelles Dimer zwei C-Termini in unmittelbarer Nähe immobilisiert werden müssten, was bei den Immobilisierungsdichten unserer Säulen unwahrscheinlich ist. Insgesamt vermuten wir daher, dass das Dimerisierungsgleichgewicht nur bei einer Minderheit der auf der Säule immobilisierten Proteineinheiten anwendbar ist. Wir gehen davon aus, dass die vollständigere Ausnutzung des Dimerisierungsgleichgewichts im Säulenformat zu noch robusteren Trennungen führen würde. Der sicherste Weg, homogene Populationen von Dimeren auf der Säule zu erhalten, wäre wahrscheinlich die Verknüpfung zweier Monomere miteinander (z. B. mit einer Polypeptidkette), die Abstimmung der Dimerisierungsaffinität durch Mutagenese der Reste, die zu Wechselwirkungen zwischen den Monomeren beitragen, und die Immobilisierung dieses Dimers durch a einzelner Befestigungspunkt. Die Dimerisierung könnte auch in anderen Trennformaten genutzt werden. Diese Richtungen sind Gegenstand aktueller Bemühungen.

Quelldaten

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Nachdrucke und Genehmigungen

Mattocks, JA, Jung, JJ, Lin, CY. et al. Verbesserte Seltenerdtrennung mit einem metallempfindlichen Lanmodulin-Dimer. Natur 618, 87–93 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05945-5

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Eingegangen: 29. Dezember 2022

Angenommen: 13. März 2023

Veröffentlicht: 31. Mai 2023

Ausgabedatum: 01. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05945-5

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