Strukturelle Basis für die Signalübertragung des FGF-Hormons

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α/βKlotho-Korezeptoren greifen gleichzeitig die Hormone des Fibroblasten-Wachstumsfaktors (FGF) (FGF19, FGF21 und FGF23)1,2 und ihre zugehörigen FGF-Rezeptoren auf der Zelloberfläche (FGFR1–4) an und stabilisieren so den endokrinen FGF-FGFR-Komplex3,4,5,6 . Allerdings benötigen diese Hormone immer noch Heparansulfat (HS)-Proteoglykan als zusätzlichen Korezeptor, um die FGFR-Dimerisierung/-Aktivierung zu induzieren und somit ihre wesentlichen Stoffwechselaktivitäten auszulösen6. Um den molekularen Mechanismus aufzudecken, der der Korezeptorrolle von HS zugrunde liegt, haben wir Kryo-Elektronenmikroskopie-Strukturen von drei unterschiedlichen quartären 1:2:1:1-Komplexen FGF23–FGFR–αKlotho–HS mit den „c“-Spleißisoformen von FGFR1 (FGFR1c) gelöst. , FGFR3 (FGFR3c) oder FGFR4 als Rezeptorkomponente. Diese Strukturen, gestützt durch zellbasierte Rezeptorkomplementierungs- und Heterodimerisierungsexperimente, zeigen, dass eine einzelne HS-Kette es FGF23 und seinem primären FGFR innerhalb eines ternären 1:1:1-FGF23-FGFR-αKlotho-Komplexes ermöglicht, gemeinsam ein einzelnes sekundäres FGFR-Molekül zu rekrutieren, was dazu führt asymmetrische Rezeptordimerisierung und -aktivierung. αKlotho ist jedoch nicht direkt an der Rekrutierung des sekundären Rezeptors/der Dimerisierung beteiligt. Wir zeigen auch, dass der asymmetrische Modus der Rezeptordimerisierung auf parakrine FGFs anwendbar ist, die ausschließlich HS-abhängig signalisieren. Unsere strukturellen und biochemischen Daten stellen das aktuelle symmetrische FGFR-Dimerisierungsparadigma auf den Kopf und liefern Blaupausen für die rationale Entdeckung von Modulatoren der FGF-Signalübertragung2 als Therapeutika für menschliche Stoffwechselerkrankungen und Krebs.

Die Familie der Säugetier-Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGF) umfasst 18 Polypeptide mit β-Kleeblatt-Homologiedomänen, die in fünf parakrine Unterfamilien und eine endokrine Unterfamilie unterteilt sind7. Parakrine Unterfamilien steuern mehrere Ereignisse während der Embryonalentwicklung8, wohingegen Mitglieder der endokrinen Unterfamilien (FGF19, FGF21 und FGF23) Hormone sind, die die Homöostase von Gallensäure, Lipid, Glukose, Vitamin D und Mineralionen regulieren1,4,9,10. FGF-Hormone sind vielversprechende Ziele für die Behandlung eines Spektrums von Stoffwechselerkrankungen, darunter Typ-II-Diabetes, Fettleibigkeit, nichtalkoholische Steatohepatitis, primäre biliäre Zirrhose, Gallensäuredurchfall, renale Phosphatverschwendungsstörungen und chronische Nierenerkrankungen2,11,12,13, 14,15,16,17,18,19. FGFs vermitteln ihre Wirkung durch Bindung, Dimerisierung und dadurch Aktivierung von Single-Pass-Transmembran-FGF-Rezeptor-Tyrosinkinasen (FGFR1–4)20,21. Die extrazelluläre Region eines prototypischen FGFR enthält drei Immunglobulin (Ig)-ähnliche Domänen (D1, D2 und D3). D2, D3 und der kurze D2-D3-Linker sind für die Ligandenbindung und Rezeptordimerisierung notwendig und ausreichend. In FGFR1–FGFR3 verändert das alternative Spleißen von zwei sich gegenseitig ausschließenden Exons (mit „b“ und „c“ bezeichnet) die Zusammensetzung der wichtigsten Ligandenbindungsstellen innerhalb der D3-Domänen dieser drei FGFRs, wodurch die Anzahl der wichtigsten FGFR-Isoformen effektiv auf sieben erhöht wird (das heißt FGFR1b–3b, FGFR1c–3c und FGFR4)22,23,24.

Parakrine FGFs sind auf Heparansulfat (HS)-Glykosaminoglykane als zwingenden Korezeptor angewiesen, um ihre zugehörigen FGFRs stabil zu binden und zu dimerisieren. HS sind lineare Glykanketten von HS-Proteoglykanen (HSPGs), die in der extrazellulären Matrix aller Gewebe reichlich exprimiert werden25. Gemäß der Kristallstruktur des 2:2:2-FGF2-FGFR1c-HS-Dimers greift HS gleichzeitig an den HS-Bindungsstellen von parakrinem FGF und FGFR an und erzwingt so die FGF-FGFR-Nähe. Dadurch erhöht HS (1) die FG-FGFR-Bindungsaffinität im Verhältnis 1:1; und (2) verstärkt die Wechselwirkungen zwischen zwei 1:1-Komplexen, wodurch zweifach symmetrische 2:2-Dimere entstehen26. Die extrazelluläre FGFR-Dimerisierung fördert die Bildung eines thermodynamisch schwachen asymmetrischen Komplexes der intrazellulären Kinasedomänen27, der die (A)-Loop-Tyrosin-Transphosphorylierung und damit die Kinaseaktivierung und intrazelluläre Signalübertragung vermittelt.

Die HS-Bindungsstellen von FGF-Hormonen weichen sowohl in der Zusammensetzung als auch in der Konformation von denen parakriner FGFs ab, was ihre Affinität für HS28 dramatisch schwächt. Folglich vermeiden FGF-Hormone den Einschluss durch die HSPGs in der extrazellulären Matrix und können in den Kreislauf gelangen. Darüber hinaus haben FGF-Hormone aufgrund von Substitutionen ihrer wichtigsten Rezeptorbindungsreste eine schwache Affinität zu FGFRs28,29. Während diese strukturellen und biochemischen Eigenheiten eine hormonelle Wirkungsweise verleihen, führen sie dazu, dass HS nicht ausreicht, damit endokriner FGF FGFR binden und die Rezeptordimerisierung induzieren kann. Um diese Mängel auszugleichen, haben FGF-Hormone tatsächlich eine absolute Abhängigkeit von αKlotho oder βKlotho als zusätzlichem Korezeptor für die Signalübertragung entwickelt. α- und βKlotho sind Single-Pass-Transmembranproteine ​​mit einer großen extrazellulären Domäne, die zwei Tandem-Glycosidase-ähnliche Domänen (KL1 und KL2) umfasst, und einer kurzen intrazellulären Domäne3,5. Der αKlotho-Korezeptor (oder βKlotho-Korezeptor) bindet gleichzeitig das FGF-Hormon und seinen zugehörigen FGFR und erzwingt dadurch die Bindung von endokrinem FGF an FGFR. Klotho-Korezeptoren verfügen über einzigartige FGF-Hormon- und FGFR-Bindungsspezifitäten, die letztendlich die FGFR-Bindungsspezifität und die Zielgewebe-/Organselektivität endokriner FGFs bestimmen. αKlotho bindet ausschließlich an FGF23 (Ref. 30), während βKlotho sowohl FGF19 als auch FGF21 bindet (Ref. 31, 32, 33, 34). In Bezug auf die FGFR-Interaktion zeigen αKlotho und βKlotho eine gemeinsame Spezifität für FGFR1c und FGFR4, erkennen jedoch nicht die „b“-Spleißisoformen von FGFR1–3. Sie zeigen jedoch eine entgegengesetzte Spezifität gegenüber FGFR2c und FGFR3c, wobei αKlotho FGFR3c, aber nicht FGFR2c bindet, während βKlotho FGFR2c, aber nicht FGFR3c bindet (Lit. 35).

Der Korezeptormechanismus von αKlotho bei der FGF23-Signalübertragung wurde durch die Kristallstruktur eines ternären Komplexes beleuchtet, der FGF23, die FGFR1c-Ligandenbindungsdomäne6 und die lösliche Ektodomäne von αKlotho (einer natürlich vorkommenden Isoform, die durch Abspaltung der Transmembranform entsteht) umfasst36,37. In der Struktur erstreckt sich die lange α1β1-Schleife (als Rezeptorbindungsarm (RBA) bezeichnet) von der KL2-Domäne von αKlotho und umschließt eine hydrophobe Furche in der D3-Domäne von FGFR (ein konserviertes Kennzeichen von FGFR1c–3c und FGFR4), während eine große Die Spalte an der Verbindungsstelle zwischen KL1 und KL2 umfasst den langen C-Schwanz von FGF23. Auf diese Weise erzwingt αKlotho die Nähe zwischen FGF23 und FGFR und die Stabilität des Komplexes. Bezüglich der Rolle von HS haben wir zuvor postuliert, dass HS es ermöglicht, dass sich zwei 1:1:1-FGF23-FGFR-αKlotho-Komplexe zu einer symmetrischen 2:2:2:2 FGF23-FGFR-αKlotho-HS-Quaternärsignaleinheit zusammenfügen, die an 2 erinnert :2:2 parakrine FGF-FGFR-HS-Dimere6. Um den Mechanismus zu ermitteln, der der dualen Korezeptor-(d. h. αKlotho und HS)-abhängigen FGFR-Dimerisierung/Aktivierung durch FGF-Hormone zugrunde liegt, haben wir kryogene Elektronenmikroskopie (Kryo-EM)-Strukturen aller drei physiologisch möglichen quartären FGF23-FGFR-αKlotho-HS-Komplexe gelöst. Unerwarteterweise zeigen diese Strukturen, gestützt durch umfassende zellbasierte Daten, dass HS die Wechselwirkungen von FGF23 und seinem primären FGFR innerhalb eines 1:1:1-FGF23-FGFR-αKlotho mit einem sekundären einsamen FGFR verstärkt und dadurch eine asymmetrische Rezeptordimerisierung und -aktivierung induziert. Bemerkenswert ist, dass der asymmetrische Modus der Rezeptordimerisierung auf parakrine FGFs verallgemeinert werden kann, was somit unser aktuelles symmetrisches Modell für die FGFR-Dimerisierung und -Aktivierung auf den Kopf stellt 26 .

Wir haben quartäre 1:1:1:1-Mischungen aus reifem menschlichem FGF23 in voller Länge, den extrazellulären Ligandenbindungsteilen (d. h. einschließlich D2- und D3-Domänen) von drei humanen verwandten FGFRs von FGF23 (d. h. FGFR1c, FGFR3c und) hergestellt FGFR4), die gesamte Ektodomäne des menschlichen αKlotho-Korezeptors und ein vollständig sulfatiertes Heparin-Dodecasaccharid (im Folgenden als HS bezeichnet). Die drei resultierenden quartären Komplexe (d. h. FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS, FGF23–FGFR3c–αKlotho–HS und FGF23–FGFR4–αKlotho–HS) wurden durch Größenausschlusschromatographie (SEC) isoliert und direkt zur Vitrifizierung verwendet. Kryo-EM-Bildsammlung und Strukturbestimmung (Extended Data Abb. 1, Extended Data Table 1 und Supplementary Abb. 2). Im Gegensatz zu unserer Vorhersage zeigen alle drei Kryo-EM-Strukturen identische asymmetrische quaternäre 1:2:1:1 FGF23-FGFR-αKlotho-HS-Anordnungen, in denen HS einem ternären 1:1:1 FGF23-FGFR-αKlotho-Komplex die Rekrutierung von a ermöglicht einzelne FGFR-Kette (als FGFRS bezeichnet, um sie vom „primären“ Rezeptor FGFRP innerhalb des ternären Komplexes zu unterscheiden) (Abb. 1). Am membranfernen Ende jedes quartären Komplexes geht HS dreiteilige Wechselwirkungen mit nebeneinander liegenden HS-Bindungsstellen von FGF23, FGFRP und FGFRS ein (Abb. 2a). Auf diese Weise verstärkt HS die Wechselwirkungen von FGF23 und FGFRP aus dem ternären FGF23-FGFRP-αKlotho-Komplex mit der FGFRS-Kette und induziert so die Dimerisierung des Rezeptors (d. h. FGFRP-FGFRS) (Abb. 3a). Bemerkenswert ist, dass die Nähe und Ausrichtung (senkrecht zur Plasmamembran) der C-terminalen Enden der FGFR-Ketten (ungefähr 25 Å voneinander entfernt) mit der Bildung eines transphosphorylierenden asymmetrischen A-Loop-Dimers der intrazellulären Kinasedomäne vereinbar ist (Extended Data Abb. 2a). Obwohl αKlotho FGFRS nicht direkt angreift, leitet es die FGFRS-Rekrutierung, indem es den FGF23-FGFRP-Komplex stabilisiert. Ohne die Unterstützung von αKlotho kann HS nicht selbstständig einen stabilen FGF23-FGFRP-Komplex erzeugen, der für die Rekrutierung eines sekundären FGFRS erforderlich ist. Tatsächlich bestätigen zellbasierte Experimente, dass die FGF23-Signalübertragung ausschließlich von αKlotho abhängig ist (Extended Data, Abb. 2b). Die Konformation des ternären FGF23-FGFRP-αKlotho-Komplexes innerhalb der quartären 1:2:1:1-Anordnungen FGF23-FGFR-αKlotho-HS ähnelt der Röntgenstruktur des HS-freien ternären FGF23-FGFR-αKlotho-Komplexes (Root Mean Square Deviation (RMSD) von nur 1,16 Å, Extended Data Abb. 2c)6. Allerdings nimmt die FGFRS-Komponente des quartären Komplexes eine verzerrte Konformation an, die mit der Ligandenbindung nicht kompatibel ist, was somit die ausgeprägte Asymmetrie des quartären Komplexes erklärt (ergänzende Abbildung 4).

Gesamtansicht der Kryo-EM-Rekonstruktionen der quartären Komplexe FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS (a), FGF23–FGFR3c–αKlotho–HS (b) und FGF23–FGFR4–αKlotho–HS (c), angezeigt bei Schwellenwerten von 0,6, 0,45 bzw. 0,5. Der quartäre Komplex wird in zwei unterschiedlichen Ausrichtungen dargestellt, die durch eine 180°-Drehung entlang der vertikalen Achse miteinander verbunden sind. FGF23 ist orange gefärbt, αKlotho ist tiefblau und HS ist magentafarben. Der Primärrezeptor (FGFRP) und der Sekundärrezeptor (FGFRS) sind im FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS-Komplex in Grün und Hellblau, im FGF23–FGFR3c–αKlotho–HS-Komplex in Hellbraun und Rosa und in Gold und Hellgelb dargestellt der FGF23–FGFR4–αKlotho–HS-Komplex. Zwei Tandem-Glycosidase-ähnliche Domänen (KL1 und KL2) und RBA von αKlotho sind markiert. Die Relevanz der besonders schwachen Dichte (in Grau), die in allen drei quartären 1:2:1:1-Komplexen zu sehen ist, wird in der ergänzenden Abbildung 3 diskutiert.

a, asymmetrischer quartärer FGF23-FGFR1c-αKlotho-HS-Komplex, dargestellt als Hybrid aus Cartoon (FGF23, FGFR und HS) und Oberfläche (αKlotho) in der gleichen Ausrichtung wie in Abb. 1a (links). b, Erweiterte Ansicht der umrahmten Region in Panel a, die die dreiteilige Wechselwirkung von HS mit FGF23, FGFRP und FGFRS zeigt. Mit HS interagierende Reste werden als Stäbchen dargestellt und beschriftet. Wasserstoffbrückenbindungen sind in dieser und den folgenden Abbildungen als schwarze gestrichelte Linien dargestellt. In den Figuren sind Stickstoff-, Sauerstoff- und Schwefelatome jeweils blau, rot und gelb gefärbt. Alle Strukturdarstellungen wurden mit Pymol (v.2.5.2) erstellt. C, L6-FGFR1CWT, L6-FGFR1C & dgr; HBS1, L6-FGFR1C & Dgr; HBS1 oder L6-FGFR1C & dgr; HBS1 + 2 wurden mit 20 nm 1: 1-Mischung von FGF23WT + αKLOTO oder FGF23R48A/R140A (FGF23WT + αKLODO) + ​​αKLOTO/R140A (FGF23WT + αKLOTO) + αKLOTO/R140A (FGF2WT + αKLOSHBS) + αKLOTO (in der Fgf23wt) (in der FGF23wt) (in der FGF23WT) + αKLOTO (in der FGF23WT) wurden cotreated. Nur t ) oder unbehandelt bleiben. Gesamtzelllysate wurden mit einem Anti-pY656/Y657-FGFR-, Anti-pY783-PLCγ1-, Anti-pY196-FRS2α-, Anti-pT202/Y204-ERK- und Anti-β-Tubulin-Antikörper (Beladungskontrolle) immungeblottet. d, Verlust der Fähigkeit von FGF23ΔHBS- und FGFR1cΔHBS-Mutanten, die Bildung des quartären FGF23-FGFR1c-αKlotho-HS-Komplexes zu induzieren, wie durch PLA sichtbar gemacht. Rote Flecken bedeuten quartäre FGF23-FGFR1c-αKlotho-HS-Komplexe auf der Zelloberfläche und blau gefärbte große Kreise/Ovale sind Zellkerne. Beachten Sie, dass es im Vergleich zu FGF23WT-behandelten L6-FGFR1cWT-Zellen weitaus weniger rote Flecken in FGF23ΔHBS-behandelten L6-FGFRcWT- und FGF23WT-behandelten L6-FGFR1cΔHBS-Zellen gibt. Maßstabsbalken, 10 μm. Immunblotting (c, normalisiert gegen Wildtyp-FGFR1 und FGF23, n = 3 biologisch unabhängige Experimente) und PLA (d, n = 6 zufällig ausgewählte Mikroskopfelder aus zwei biologisch unabhängigen Experimenten) wurden wie im Abschnitt „Methoden“ beschrieben quantifiziert und werden wie folgt dargestellt: der Mittelwert ± Standardabweichung. Die P-Werte wurden durch eine Zwei-Wege-ANOVA bestimmt, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichen nach dem Post-hoc-Test.

Quelldaten

a, Darstellung der komplexen Struktur FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS als Mischung aus Cartoon (FGF23 und FGFR) und Oberfläche (αKlotho). Die Ansicht ist mit der in Abb. 1a (rechts) durch eine 90°-Drehung entlang der vertikalen Achse verknüpft. Die Kontaktstellen 1 und 2 der FGFR1cP-FGFR1cS-Dimerschnittstelle sind blau bzw. schwarz eingerahmt. Beachten Sie, dass αKlotho nicht direkt an der Rekrutierung von FGFR1S beteiligt ist. Linke, vergrößerte Ansicht von Stelle 1 mit D2-Domäne von FGFR1cP und D2, D2-D3-Linker und D3 von FGFR1cS. Rechts, Nahaufnahme von Stelle 2 zwischen den D3-Domänen von FGFR1cP und FGFR1cS. Seitenketten der interagierenden Reste sind als Stäbchen dargestellt. Ausgewählte Sekundärstrukturelemente werden beschriftet. Hydrophobe Kontakte werden als semitransparente Oberfläche hervorgehoben. Ein Cu2+-Ion (orangefarbene Kugel) wird durch analoge Histidinreste von FGFR1cP und FGFR1cS koordiniert. Die Cu2+-Zuordnung basierte auf einer früheren Veröffentlichung, die spezifische Cu2+-Wechselwirkungen mit extrazellulären Domänen von FGFRs implizierte39. Cu2+-Ionen stammen wahrscheinlich aus Zellkulturmedien (DMEM und DME/F12), die zum Züchten von HEK293S-GnTI−-Zellen verwendet werden, die minimal glykosylierte FGFR-Ektodomänen sezernieren. b–d, Immunblot-Analysen ganzer Zellextrakte, die wie in Abb. 2c aus unstimulierten oder FGF23 (20 nM) und αKlotho (20 nM) costimulierten FGFR1c (b), FGFR3c (c) oder FGFR4 (d) exprimierten L6-Zelllinien untersucht wurden. Die Immunblotting-Daten wurden wie im Abschnitt „Methoden“ beschrieben quantifiziert und werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Daten normalisiert gegen Wildtyp-FGFR und FGF23, n = 3 biologisch unabhängige Experimente. Die P-Werte wurden durch eine Zwei-Wege-ANOVA bestimmt, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichen nach dem Post-hoc-Test.

Quelldaten

FGF23-HS-Wechselwirkungen werden durch drei Reste (Arg48, Arg140 und Tyr154) von der atypischen HS-Bindungsstelle im Kern von FGF23 vermittelt (Abb. 2b). Im Vergleich zu FGF23-HS-Kontakten interagiert HS in den D2-Domänen der beiden FGFR-Ketten stärker mit HBS, wobei die Reste Lys177, Lys207, Arg209 und Ser214 von FGFR1cP sowie Lys175, Lys177, Val208, Arg209 und Thr212 von FGFR1cS beteiligt sind (Abb. 2b). ). Um die physiologische Bedeutung der Drei-Wege-Wechselwirkungen von HS mit FGF23, FGFR1cP und FGFR1cS für die Induktion der Rezeptordimerisierung (d. h. FGFRP-FGFRS) zu validieren, führten wir eine R48A/R140A-Doppelmutation in FGF23 (FGF23ΔHBS) und K175Q/K177Q ein und K207Q/R209Q-Doppelmutationen (FGFR1cΔHBS1 und FGFR1cΔHBS2) einzeln oder in Kombination (K175Q/K177Q/K207Q/R209Q, bezeichnet als FGFR1cΔHBS1+2) in das FGFR1c voller Länge. Wildtyp-FGFR1c (FGFR1cWT) und seine mutierten Varianten wurden stabil auf der Oberfläche von Ratten-Skelett-Myoblastenzellen (L6), einer αKlotho- und FGFR-defizienten Zelllinie, exprimiert. Die Behandlung von Zelllysaten mit Endoglycosidase H (Endo H) und Peptid:N-Glycosidase F (PNGase F), gefolgt von einer Immunoblot-Analyse mit FGFR-spezifischen Antikörpern, zeigte, dass mutierte FGFR1c-Varianten komplexe Zucker enthalten, was bedeutet, dass sie sich auf der Zelloberfläche befinden (Erweitert). Daten Abb. 3a). Die gleiche Homogenität/Menge der FGF23WT- und FGF23ΔHBS-Proben wurde durch SDS-PAGE verifiziert (ergänzende Abbildung 2d). Die gleichzeitige Behandlung mit FGF23WT und löslichem αKlotho von L6-FGFR1cWT führte zu einer robusten FGFR1c-Aktivierung/-Signalisierung, gemessen durch Phosphorylierung von FGFR1c an A-Loop-Tyrosinen, seinen beiden direkten Substraten PLCγ1 (am regulatorischen Y783) und FRS2α (an der Grb2-Rekrutierungsstelle Y196). und anschließende Aktivierung eines RAS-Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK)-Signalwegs, überwacht durch extrazelluläre signalregulierte Kinase (ERK)-Phosphorylierung an T202/Y204. Im Gegensatz dazu erlitten sowohl die Doppelmutanten FGFR1cΔHBS1 als auch FGFR1cΔHBS2 erhebliche Verluste in ihrer Fähigkeit, die FGF23-Signalisierung zu induzieren, und die Vierfachmutante FGFR1cΔHBS1+2 verstummte völlig (Abb. 2c). Ebenso war die Fähigkeit von FGF23ΔHBS, L6-FGFR1cWT in Gegenwart von löslichem αKlotho zu aktivieren, deutlich verzögert. Die FGFR-Aktivierungs-/Signalisierungsdaten wurden durch Daten des Proximity Ligation Assay (PLA) gespiegelt. Insbesondere führte die gleichzeitige Behandlung mit FGF23WT und αKlotho zum Auftreten zahlreicher und intensiver punktförmiger Fluoreszenzsignale auf der Oberfläche der L6-FGFR1cWT-Zelllinie. Im Gegensatz dazu gab es bei gleichzeitiger Behandlung weitaus weniger Fluoreszenzsignale auf der Oberfläche der Zelllinien FGFR1cΔHBS1, FGFR1cΔHBS2 und FGFR1cΔHBS1+2. In ähnlicher Weise waren auf der Oberfläche der L6-FGFR1cWT-Zelllinie deutlich weniger fluoreszierende Punkte vorhanden, wenn sie gleichzeitig mit FGF23ΔHBS und löslichem αKlotho behandelt wurden (Abb. 2d). Diese zellbasierten Daten bestätigen die Unentbehrlichkeit von FGF23-HS- und FGFR1c-HS-Kontakten für die Bildung eines quartären Signalkomplexes FGF23-FGFR1c-αKlotho-HS auf der Zelloberfläche. In Übereinstimmung mit der 1:2:1:1-FGF23-FGFR-αKlotho-HS-Stöchiometrie in den Kryo-EM-Strukturen zeigten Größenausschlusschromatographie-Mehrwinkel-Lichtstreuexperimente, dass der quartäre FGF23-FGFR1c-αKlotho-HS-Komplex als wandert eine einzelne Spezies mit einer berechneten Molekülmasse von ungefähr 220 kDa, was genau dem theoretischen Wert für ein 1:2:1:1 FGF23-FGFR1c-αKlotho-HS (215 kDa) entspricht (ergänzende Abbildung 2e).

Alle drei Subdomänen (d. h. D2, D2-D3-Linker und D3) der FGFRP- und FGFRS-Ketten sind an der Rekrutierung von FGFRS in den ternären Komplex und damit an der Förderung der Rezeptordimerisierung beteiligt (Abb. 3a). Die direkten FGFRP-FGFRS-Kontakte bedecken eine kleine, dem Lösungsmittel ausgesetzte Oberfläche (1542,6 Å2) und bleiben zwischen den drei Kryo-EM-Strukturen erhalten. Die FGFRP-FGFRS-Schnittstelle kann in zwei Standorte aufgeteilt werden (d. h. Standorte 1 und 2). An Stelle 1 packen sich Reste aus diskontinuierlichen Schleifenregionen (d. h. βA'-βB- und βE-βF-Schleifen) an der unteren (C-terminalen) Ecke von D2 von FGFRP asymmetrisch gegen D2, D2-D3-Linker und D3 von FGFRS (Abb. 3a). An Stelle 2 greift ein zusammenhängender Restabschnitt, der den D2-D3-Linker, den βA-Strang, die βA-βA'-Schleife und den βB'-Strang von D3 umfasst, pseudosymmetrisch in die entsprechende Region des sekundären Rezeptors ein (Abb. 3a und Ergänzung). Tabelle 1). Bemerkenswert ist, dass die FGFRP-FGFRS-Schnittstelle zwei entscheidende Ligandenbindungsreste von FGFRS einfängt, nämlich Arg250 und Ser346, was FGFRS weiter von der Ligandenbindung abhält (ergänzende Abbildung 4b).

Wir zielten auf Stelle 2 der FGFRP-FGFRS-Schnittstelle in jedem der drei Quartärkomplexe ab, indem wir vier verschiedene Punktmutationen einzeln in FGFR1c (E249A, R254A, I256A, Y280A), FGFR3c (E247A, R252A, I254A, Y278A) in voller Länge einführten FGFR4 (E243A, R248A, I250A, Y274A). Darüber hinaus haben wir als Vertreter der drei quartären Komplexe eine A170D/A171D/S219K-Dreifachmutation in FGFR1c eingeführt, um auf die Zielstelle 1 der FGFR1cP-FGFR1cS-Dimerschnittstelle abzuzielen (Abb. 3a). FGFR1c-, FGFR3c- und FGFR4-Varianten in voller Länge wurden zusammen mit ihren Wildtyp-Gegenstücken stabil in L6-Zellen exprimiert. Wie oben wurde die Endo H-Empfindlichkeit verwendet, um sicherzustellen, dass die Mutationen die Glykosylierung/Reifung des Rezeptors und die Präsentation auf der Zelloberfläche nicht beeinträchtigen (Erweiterte Daten, Abb. 3b – d). Abgesehen von FGFR1cI256A und der entsprechenden FGFR4I250A-Mutante zeigten alle Mutanten vergleichbare Verhältnisse von Endo H-resistenten zu gesamten FGFR-proteinähnlichen Wildtyp-FGFRs. Diese Daten deuten darauf hin, dass nur FGFR1cI256A und das entsprechende FGFR4I250A eine verringerte Zelloberflächenexpression aufwiesen. Wie im Fall der L6-FGFR1cWT-Zelllinie stimulierte die gleichzeitige Behandlung mit FGF23 und löslichem αKlotho der L6-FGFR3cWT- und L6-FGFR4WT-Zelllinien die FGFR-Signalübertragung stark, was durch Phosphorylierung/Aktivierung von FGFRs und nachgeschalteten PLCγ1/FRS2α/ERK-Signalwandlern nachgewiesen wurde. Im Gegensatz dazu hatten Zellen, die mutiertes FGFR1c, FGFR3c und FGFR4 exprimierten, die Tyrosinphosphorylierung der FGFR-A-Schleife verringert und die Aktivierung von PLCγ1, FRS2α und MAPK verringert (Abb. 3b – d). Es ist unwahrscheinlich, dass die beeinträchtigte Signalübertragung durch FGFR1cI256A und FGFR4I250A ausschließlich auf eine verringerte Zelloberflächenexpression zurückzuführen ist, da die Glykosylierung und Zelloberflächenexpression des entsprechenden FGFR3cI254A davon nicht betroffen ist.

FGF23 ist auch an der Rekrutierung von FGFRS für den ternären Komplex und damit an der Unterstützung der FGFRP-FGFRS-Dimerisierung beteiligt. Diese sekundären FGF23-FGFRS-Kontakte werden sowohl durch den starren Kleeblattkern als auch durch den flexiblen N-Terminus von FGF23 vermittelt. Insbesondere greifen die Schleifen β8–β9 und β10–β12 im Kleeblattkern von FGF23 in die Schleifen βC–βD und βE–βF am unteren Rand (C-terminal) der FGFRS-D2-Domäne ein (Abb. 4a). Parallel dazu erstrecken sich hydrophobe Reste am äußersten Ende des FGF23-N-Terminus vom FGF23-FGFRP-αKlotho-Komplex und interagieren mit einer hydrophoben Furche in der FGFRS-D3-Domäne, die der D3-Furche in FGFRP entspricht, an der die RBA von αKlotho beteiligt ist ( Abb. 4a und erweiterte Daten Abb. 4a). Dadurch wird der N-Terminus von FGF23 wahrscheinlich die Bindung eines anderen αKlotho an FGFRS behindern und trägt somit zur Asymmetrie des quartären Komplexes bei. Im Vergleich zur Kristallstruktur des HS-freien 1:1:1-FGF23-FGFR-αKlotho-Komplexes zeigt der N-Terminus von FGF23 eine wesentliche Konformationsänderung im 1:2:1:1-FGF23-FGFR-αKlotho-HS-Quaternär komplex (Extended Data Abb. 4b–d). Bemerkenswerterweise sind in allen drei Kryo-EM-Strukturen die Elektronendichten für den FGF23-N-Terminus schlecht definiert, was darauf hindeutet, dass der FGF23-N-Terminus FGFRS D3 auf eher degenerierte und flexible Weise angreift (Abb. 1a – c und erweiterte Daten Abb. 4e). ). Wechselwirkungen des FGF23-N-Terminus mit FGFRS D3 wurden durch eine 300-ns-Allatom-Molekulardynamiksimulation (MD) des FGF23-FGFR1c-αKlotho-HS-Komplexes bestätigt (Extended Data Abb. 4f – i). Ähnlich wie die FGFRP-FGFRS-Schnittstelle ist auch die FGF23-FGFRS-Schnittstelle (Ergänzungstabelle 2) unter den drei quartären Komplexen konserviert und maskiert einen eher bescheidenen oberflächenexponierten Bereich (1668,6 Å2). Bemerkenswerterweise greifen der FGF23-N-Terminus und D3 des FGFRS in der Nähe von Stelle 2 der FGFRP-FGFRS-Schnittstelle ineinander (Abb. 4a). Dies impliziert, dass FGF23-FGFRS- und FGFRP-FGFRS-Kontakte gemeinsam wirken, um FGFRS für den ternären Komplex zu rekrutieren und die Rezeptordimerisierung (d. h. FGFRP-FGFRS) zu fördern.

a, Cartoon-Darstellung der FGF23-FGFR-αKlotho-HS-Struktur in der gleichen Ansicht wie in Abb. 1a (rechts). Orangefarbene und schwarze Kästchen kennzeichnen die beiden Kontaktregionen zwischen FGF23 und FGFRS, nämlich die D2-Domäne FGF23core:FGFR1cS (links, orangefarbenes Kästchen) und die D3-Domäne FGF23NT:FGFR1cS (rechts). b, L6-FGFR1cWT-Zellen wurden mit zunehmenden Konzentrationen von FGF23WT, FGF23ΔNT oder FGF23ΔSRBS behandelt und Ganzzelllysate wurden wie in Abb. 2 untersucht. Die gleiche Homogenität/Menge der FGF23WT-, FGF23ΔNT- und FGF23ΔSRBS-Proben wurde durch SDS-PAGE überprüft (ergänzende Abbildung). 2d). c, Verlust der Fähigkeit von FGF23ΔNT- und FGF23ΔSRBS-Mutanten, die Bildung des quartären FGF23-FGFR-αKlotho-HS-Komplexes (d. h. Rezeptordimerisierung) im Vergleich zu FGF23WT zu induzieren, wie durch PLA beurteilt. Beachten Sie, dass es in Zellen, die mit FGF23-Mutanten stimuliert wurden, im Vergleich zu FGF23WT weitaus weniger rote Flecken gibt. d, L6-FGFR1cWT-Zellen wurden mit FGF23WT (40 nM) allein, FGF23WT (40 nM) gemischt mit FGF23ΔSRBS (40 nM) oder FGF23ΔNT (40 nM) behandelt und ganze Zellextrakte wurden mit pFGFR-Antikörpern untersucht. Maßstabsbalken, 10 μm. Immunblotting (b und d, n = 3 biologisch unabhängige Experimente) und PLA (c, n = 6 zufällig ausgewählte Mikroskopfelder aus zwei biologisch unabhängigen Experimenten) wurden wie im Abschnitt „Methoden“ beschrieben quantifiziert und als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Die P-Werte wurden durch eine Zwei-Wege-ANOVA bestimmt, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichen nach dem Post-hoc-Test.

Quelldaten

Als nächstes untersuchten wir den Einfluss einer Störung der sekundären FGF23-FGFRS-Kontakte auf die Bildung des quaternären 1:2:1:1-Signalkomplexes FGF23-FGFR-αKlotho-HS. Zu diesem Zweck haben wir zwei FGF23-Varianten generiert: einer fehlen die ersten 12 N-terminalen Reste (d. h. Y25 bis W36; FGF23ΔNT genannt) und die andere trägt eine M149A/N150A/P151A-Dreifachmutation innerhalb der Kernregion von FGF23 (bezeichnet als FGF23ΔSRBS). Den Kryo-EM-Strukturen zufolge wird vorhergesagt, dass die M149A/N150A/P151A-Dreifachmutation und die N-terminale Verkürzung sekundäre Wechselwirkungen von FGF23 mit D2- bzw. D3-Domänen von FGFRS aufheben und somit die FGF23-Signalübertragung beeinträchtigen (Abb. 4a). Um dies zu testen, wurde eine L6-Zelllinie, die FGFR1cWT und Transmembran-αKlotho koexprimiert, erzeugt und steigenden Konzentrationen von FGF23WT, FGF23ΔNT oder FGF23ΔSRBS ausgesetzt. Die Wirksamkeit der Rezeptordimerisierung/-aktivierung bei steigenden Ligandenkonzentrationen wurde durch Immunoblotting auf FGFR-A-Loop-Tyrosinphosphorylierung und durch PLA bewertet (Abb. 4b, c). Ein Vergleich der Dosis-Wirkungs-Kurven zeigte, dass weder FGF23ΔNT noch FGF23ΔSRBS bei allen Konzentrationen die maximale Aktivität (Emax) erreichen konnten, die FGF23WT in beiden Tests ausübte. Darüber hinaus fungierten sowohl FGF23ΔSRBS als auch FGF23ΔNT in Kombination mit FGF23WT als kompetitive Antagonisten und führten zu einer Nettoabnahme der FGFR1c-Aktivierung (Abb. 4d). Im Vergleich zu FGF23ΔNT zeigte FGF23ΔSRBS jedoch einen größeren Verlust seiner Dimerisierungs-/Signalkapazität (Abb. 4b – d), was darauf hindeutet, dass die über den Kern des FGF23 vermittelten FGF23-FGFRS-Kontakte mehr zur Gesamtstabilität und Funktionalität von beitragen FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS quartärer Signalkomplex als diejenigen, die durch den FGF23-N-Terminus vermittelt werden.

Wir haben einen zellbasierten Rezeptorkomplementierungstest entwickelt, um die Asymmetrie der quartären Signalkomplexe FGF23–FGFR–αKlotho–HS zu untersuchen. Basierend auf den unterschiedlichen Rollen, die primäre und sekundäre Rezeptoren bei der asymmetrischen Dimerisierung spielen, haben wir insbesondere zwei FGFR1c-Varianten entwickelt, die ausschließlich entweder als primärer oder sekundärer Rezeptor fungieren können. Wir kamen zu dem Schluss, dass diese Varianten zwar einzeln dysfunktional wären, sich aber gegenseitig ergänzen und als Reaktion auf FGF 23 und αKlotho einen funktionellen quartären 1:2:1:1-Komplex bilden sollten (Abb. 5a und erweiterte Daten Abb. 5a, b). Um eine FGFR1c-Variante zu erzeugen, die ausschließlich als primärer Rezeptor fungiert, haben wir eine I203E/S223E-Doppelmutation in ihrer D2-Domäne eingeführt. Wie oben erwähnt, gehen diese beiden Reste in FGFR1cS hydrophobe und Wasserstoffbrückenbindungskontakte mit Resten im Kern des FGF23 (d. h. FGF23-FGFR1cS-Schnittstelle, Abb. 4a) ein, die für die Rekrutierung von FGFR1cS in den ternären Komplex unerlässlich sind impliziert durch den schweren Funktionsverlust von FGF23ΔSRBS (Abb. 4b, c). Die entsprechenden Reste in FGFR1cP sind jedoch für die Bildung quartärer Komplexe entbehrlich und dem Lösungsmittel ausgesetzt (Extended Data Abb. 5b). Folglich wird vorhergesagt, dass der resultierende mutierte FGFR1c (genannt FGFR1cΔSLBS) die Fähigkeit verliert, als sekundärer Rezeptor zu fungieren, aber die Fähigkeit, als primärer Rezeptor zu dienen, behalten sollte. Um eine FGFR1c-Variante in die Lage zu versetzen, ausschließlich als sekundärer Rezeptor zu fungieren, haben wir eine A167D/V248D-Doppelmutation in ihre D2-Domäne eingeführt. Die A167D/V248D-Doppelmutation hebt die Bildung von hochkonserviertem Wasserstoff und hydrophoben Kontakten zwischen FGF23 und der FGFR1P-D2-Domäne auf (Extended Data Abb. 5a,b). Daher wird vorhergesagt, dass die resultierende FGFR1cA167D/V248D-Mutante (genannt FGFR1cΔPLBS) die Fähigkeit verliert, als primärer Rezeptor zu fungieren (d. h. einen ternären Komplex zu bilden). Allerdings sollte FGFR1cΔPLBS seine Fähigkeit behalten, als sekundärer Rezeptor zu fungieren, da die entsprechenden Reste in FGFR1cS keine Rolle bei der Bildung des quartären Komplexes spielen und vollständig dem Lösungsmittel ausgesetzt sind.

a, Schematische Darstellung, die zeigt, dass sich FGFR1cΔSLBS und FGFR1cΔPLBS als Reaktion auf die gleichzeitige Behandlung mit FGF23 und αKlotho gegenseitig ergänzen und einen asymmetrischen 1:1:1:1:1-Komplex FGF23–FGFR1cΔSLBS–FGFR1cΔPLB–αKlotho–HS bilden können. b, Immunoblot-Analysen ganzer Extrakte aus unbehandelten oder FGF23- und αKlotho-kobehandelten L6-Zelllinien, die einzeln FGFR1cWT, FGFR1cΔPLBS und FGFR1cΔSLBS exprimieren oder FGFR1cΔSLBS mit FGFR1cΔPLBS koexprimieren, die wie in Abb. 2 untersucht wurden. c, schematisches Diagramm, das zeigt, dass FGF23, αKlotho und FGFR4ΔSLBS (dient als primärer Rezeptor) bildet einen ternären Komplex und rekrutiert FGFR1cΔPLBS als sekundären Rezeptor in Gegenwart von HS. d, FGF23- und αKlotho-cobehandelte L6-Zelllinien, die FGFR4WT, FGFR4ΔSLBS allein oder FGFR4ΔSLBS zusammen mit FGFR1cΔPLBS stabil exprimieren, wurden auf FGFR-Aktivierung/-Signalisierung unter Verwendung von Western Blot von gesamten Zelllysaten analysiert, wie in Abb. 2. e, Schematische Darstellung, die zeigt, dass in Als Reaktion auf parakrines FGF1/4 und HS können sich FGFR1cΔSLBS und FGFR1cΔPLBS ergänzen und 1:1:1:1 asymmetrische FGF-FGFR1cΔSLBS-FGFR1cΔPLBS-HS-Signalkomplexe bilden. f, L6-Zelllinien, die FGFR1cΔSLBS und FGFR1cΔPLBS einzeln oder gemeinsam exprimieren, wurden mit FGF1 (1 nM) behandelt und Zellextrakte wurden wie in Abb. 2 immungeblottet. g, Schematische Darstellung, die zeigt, dass FGF1, HS und FGFR4ΔSLBS (als primärer Rezeptor dienen). ) bilden einen stabilen Komplex, der anschließend FGFR1cΔPLBS als sekundären Rezeptor rekrutiert. h, L6-Zelllinien, die FGFR4WT oder FGFR4ΔSLBS einzeln exprimierten oder FGFR4ΔSLBS mit FGFR1cΔPLBS co-exprimierten, wurden mit FGF1 (1 nM) behandelt und Zellextrakte wurden wie in Abb. 2 immungeblottet. Experimente wurden in biologischen Dreifachversuchen mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt. CT, C-Terminus; NT, N-Terminus.

Um den Komplementationstest durchzuführen, wurde eine L6-Zelllinie, die FGFR1cΔSLBS und FGFR1cΔPLBS (L6-FGFR1cΔSLBS + FGFR1cΔPLBS) coexprimiert, zusammen mit zwei Kontroll-L6-Zelllinien erzeugt, die einzeln FGFR1cΔSLBS (L6-FGFR1cΔSLBS) und FGFR1cΔPLBS (L6-FGFR1cΔPLBS) exprimierten. Diese drei Zelllinien und L6-FGFR1cWT (Positivkontrolle) wurden über zunehmende Zeitintervalle einer festen Konzentration von FGF23 und löslichem αKlotho ausgesetzt. Die FGFR1c-Signalübertragung wurde durch Überwachung der Tyrosinphosphorylierung von FGFR, PLCγ1 und FRS2α und der anschließenden Aktivierung des MAPK-Signalwegs bewertet. Im Vergleich zur L6-FGFR1cWT-Zelllinie gab es in L6-FGFR1cΔPLBS- oder L6-FGFR1cΔSLBS-Zellen eine vernachlässigbare FGFR-Signalübertragung (Abb. 5b), was bedeutet, dass diese Varianten allein keine signalkompetenten quartären Komplexe bilden können. Im Gegensatz dazu führte die Koexpression von FGFR1cΔSLBS mit FGFR1cΔPLBS (Abb. 5b) zu einer robusten Aktivierung eines FGFR-Signalwegs. Diese Daten deuten darauf hin, dass FGFR1cΔSLBS FGFR1cΔPLBS bei der Bildung eines signalkompetenten quaternären FGF23-FGFR1cΔSLBS-FGFR1cΔPLBS-αKlotho-HS-Komplexes ergänzen kann, in dem FGFR1cΔSLBS die Rolle des primären Rezeptors übernimmt, während FGFR1cΔPLBS als sekundärer Rezeptor übernommen wird (Abb. 5a). Die Bildung eines asymmetrischen FGF23-FGFR1cΔSLBS-FGFR1cΔPLBS-αKlotho-HS-Signalkomplexes wurde auch durch PLA validiert (Extended Data Abb. 5c). Im Vergleich zu L6-FGFR1cWT-Zellen erzeugte die gleichzeitige Behandlung mit FGF23 und αKlotho keine Fluoreszenzsignale auf der Oberfläche von L6-FGFR1cΔSLBS- und L6-FGFR1cΔPLBS-Zellen, was bedeutet, dass FGFR1cΔSLBS- und L6-FGFR1cΔPLBS-Varianten allein keine Rezeptordimerisierung (d. h. quartär) durchlaufen Komplexbildung). Im Gegensatz dazu führte die Stimulation von L6-FGFR1cΔSLBS + FGFR1cΔPLBS-koexprimierenden Zellen mit FGF23 und αKlotho zum Auftreten zahlreicher und intensiv fluoreszierender Puncta, was darauf hindeutet, dass FGFR1cΔSLBS und FGFR1cΔPLBS sich gegenseitig ergänzt und zu einem asymmetrischen FGF23–FGFR1cΔSLBS–FGFR1cΔPLBS–αKlotho– zusammengesetzt haben. HS-Signalkomplex.

Wie oben erwähnt, sind sowohl die FGFRP-FGFRS- als auch die FGF23-FGFRS-Schnittstelle zwischen den drei quartären Komplexen nahezu invariant. Diese Beobachtung bot uns eine weitere Gelegenheit, die Asymmetrie des Komplexes zu hinterfragen. Insbesondere gingen wir davon aus, dass ein primäres FGFR1cP in der Lage sein sollte, sich mit FGFR3c oder FGFR4 als sekundärem Rezeptor zu paaren, um funktionelles 1:2:1:1 FGF23–FGFR1c–FGFR3c–αKlotho–HS oder FGF23–FGFR1c–FGFR4–αKloth–HS zu ergeben heterodimere quartäre Komplexe (Abb. 5c). Um diese Möglichkeit zu testen, führten wir einen Rezeptorkomplementationstest durch, wobei wir eine FGFR4-Variante mit einer doppelten I197E/S217E-Mutation (als FGFR4ΔSLBS bezeichnet) – entsprechend FGFR1cΔSLBS – als primären Rezeptor und FGFR1cΔPLBS als sekundären Rezeptor verwendeten. Es wurde eine L6-Zelllinie abgeleitet, die FGFR1cΔPLBS zusammen mit FGFR4ΔSLBS (L6-FGFR1cΔPLBS + FGFR4ΔSLBS) exprimiert, zusammen mit Kontrollzelllinien, die einzeln FGFR4WT (L6-FGFR4WT) und FGFR4ΔSLBS (L6-FGFR4ΔSLBS) exprimieren. Diese Zelllinien wurden mit FGF23 plus αKlotho co-behandelt und die Bildung quartärer Signalkomplexe wurde durch Immunoblot-Analyse und PLA untersucht. Wie bei FGFR1cΔSLBS und FGFR1cΔPLBS konnte auch FGFR4ΔSLBS als Reaktion auf die gleichzeitige Behandlung mit FGF23 plus αKlotho nicht aktiviert werden. Allerdings fand eine starke Aktivierung eines FGFR-Signalwegs in der L6-FGFR1cΔPLBS + FGFR4ΔSLBS co-exprimierenden Zelllinie statt (Abb. 5d). Die Zellsignalisierungsdaten wurden von der PLA gespiegelt (Extended Data Abb. 5c). Insbesondere war nach Kostimulation mit FGF23 und αKlotho ein unbedeutendes Fluoreszenzsignal auf der Oberfläche der L6-FGFR4ΔSLBS-Zelllinie vorhanden. Im Gegensatz dazu traten zahlreiche und intensive punktförmige Fluoreszenzflecken auf der Oberfläche von L6-FGFR1cΔPLBS + FGFR4ΔSLBS-koexprimierenden Zellen auf, was darauf hindeutet, dass sich auf der Oberfläche lebender Zellen ein heterodimerer quartärer FGF23-FGFR1c-FGFR4-αKlotho-HS-Komplex bilden kann. Diese zellbasierten Rezeptorkomplementierungs- und Hererodimerisierungsdaten bestätigen eindeutig die Asymmetrie unseres strukturell abgeleiteten 1:2:1:1 FGF23-FGFR1c-αKlotho-HS-Signaltransduktionskomplexes.

Da der αKlotho-Korezeptor nicht direkt an der FGFRS-Rekrutierung beteiligt ist, schlugen wir vor, dass der asymmetrische Modus der Rezeptordimerisierung, der durch unsere FGF23-FGFR-αKlotho-HS-Kryo-EM-Strukturen aufgedeckt wird, auch für parakrine FGFs relevant sein könnte. Um diese Vermutung zu testen, untersuchten wir die Auswirkungen asymmetrischer FGFRP-FGFRS-Dimer-Schnittstellenmutationen auf die Fähigkeiten von FGFR1c und FGFR2b, parakrine FGF-Signale zu vermitteln. Diese beiden FGFR-Isoformen wurden aufgrund ihres überlappenden und einzigartigen Ligandenbindungsspezifitäts-/Promiskuitätsprofils ausgewählt (Extended Data Abb. 5d). FGFR1c reagiert auf parakrinen FGF1 (ein Pan-FGFR-Ligand) und FGF4, während FGFR2b die Wirkungen von FGF1, FGF3, FGF7, FGF10 und FGF22 vermittelt. Für FGFR2b-Studien haben wir L6-Zelllinien generiert, die entweder Wildtyp- (FGFR2bWT) oder FGFR2b-Mutanten (d. h. FGFR2bE250A, FGFR2bR255A, FGFR2bI257A und FGFR2bY281A) exprimieren, analog zu den oben genannten FGFR1c-Mutanten. Sowohl FGFR1c- als auch FGFR2b-Mutanten waren in ihrer Fähigkeit zur ligandeninduzierten Tyrosin-Trans-Autophosphorylierung beeinträchtigt, was sich auch in einer verringerten PLCγ1- und FRS2α-Phosphorylierung widerspiegelte (Extended Data, Abb. 6).

Als nächstes führten wir Rezeptorkomplementierungs- und Heterodimerisierungstests durch, wie es für FGF23 durchgeführt wurde. Für die FGFR2b-Komplementationsstudie haben wir L6-FGFR2bΔSLBS-, L6-FGFR2bΔPLBS- und L6-FGFR2bΔSLBS + FGFR2bΔPLBS-Zelllinien etabliert, die den für die FGF23-Studie verwendeten FGFR1c-Zelllinien entsprechen. Als Reaktion auf die FGF1- oder FGF4-Stimulation lösten Zellen, die FGFR1cΔPLBS oder FGFR1cΔSLBS allein exprimierten, keine nennenswerten FGFR1c-Signale aus, wohingegen L6-FGFR1cΔSLBS + FGFR1cΔPLBS-Zellen mit robuster FGFR1c-Aktivierung und -Signalisierung reagierten (Abb. 5e, f). Ebenso induzierten FGF1, FGF3, FGF7 und FGF10 jeweils nur in L6-FGFR2bΔSLBS + FGFR2bΔPLBS-Coexpressoren die FGFR-Aktivierung und -Signalisierung (Extended Data Abb. 7). Schließlich untersuchten wir die Möglichkeit einer FGFR-Heterodimerisierung durch parakrine FGFs, indem wir uns auf Folgendes konzentrierten: (1) FGFR1c-FGFR4- und FGFR1b-FGFR2b-Heterodimerisierungen durch FGF1; (2) FGFR1b-FGFR2b-Heterodimerisierung durch FGF10; und (3) FGFR2b-FGFR3b-Heterodimerisierung durch FGF3. Für den FGFR1b-FGFR2b-Heterodimerisierungstest haben wir eine L6-Zelllinie generiert, die FGFR1bΔSLBS exprimiert, was FGFR2bΔSLBS entspricht. Für die FGF2b-FGFR3b-Heterodimerisierung durch FGF3 verwendeten wir Wildtyp-FGFR3b (FGFR3bWT) als ΔPLBS-Äquivalent, da diese Isoform natürlicherweise nicht auf FGF3 reagiert. FGF1 konnte die FGFR-Signalübertragung in den Zelllinien FGFR1cΔPLBS und FGFR4ΔSLBS nicht aktivieren. Allerdings wurde in der FGFR1cΔPLBS + FGFR4ΔSLBS koexprimierenden Zelllinie als Reaktion auf die FGF1-Stimulation eine starke FGFR-Signalübertragung beobachtet (Abb. 5g, h). Ebenso induzierten sowohl FGF1 als auch FGF10 eine robuste FGFR-Aktivierung/-Signalisierung nur in der koexprimierenden Zelllinie FGFR1bΔSLBS + FGFR2bΔPLBS, nicht jedoch in den Zelllinien L6-FGFR1bΔSLBS und L6-FGFR2bΔPLBS (Extended Data Abb. 8a – c). Schließlich löste FGF3 eine Signalübertragung in der FGFR2bΔSLBS + FGFR3bWT-koexprimierenden Zelllinie aus, jedoch nicht in den L6-FGFR2bΔSLBS- und L6-FGFR3bWT-Zellen (Extended Data Abb. 8d, e). Basierend auf diesen umfangreichen zellbasierten Daten kommen wir zu dem Schluss, dass die parakrine FGF-Signalisierung über HS-induzierte asymmetrische 1:2 FGF-FGFR-Dimere vermittelt wird, die an die HS- und Klotho-induzierten endokrinen 1:2 FGF23-FGFR-Dimere erinnern (Extended Data Abb . 9).

Die in diesem Manuskript vorgestellten asymmetrischen quartären Komplexstrukturen 1:2:1:1 FGF23–FGFR–αKlotho–HS und unterstützende biochemische Daten zeigen, wie Klotho- und HS-Glycosaminoglycan-Korezeptoren gemeinsam wirken, um die asymmetrische 1:2-endokrine FGF-FGFR-Dimerisierung zu fördern, die für erforderlich ist Rezeptoraktivierung und damit FGF-Hormonsignalisierung. In diesem Modell binden Klotho-Korezeptoren das FGF-Hormon und seinen primären Rezeptor aneinander und erzeugen so einen stabilen endokrinen FGF-FGFRP-Komplex im Kontext von ternären 1:1:1-FGF-FGFRP-Klotho-Komplexen. Auf diese Weise gleichen Klotho-Korezeptoren effektiv die HS-Inkompetenz bei der Stabilisierung des endokrinen FGF-FGFRP-Komplexes aus (Extended Data Abb. 9). Der stabilisierte endokrine FGF-FGFRP-Komplex wird dann von einem HS-Korezeptor bei der Rekrutierung eines sekundären FGFRS unterstützt. Wichtig ist, dass die Klotho-Korezeptor-Abhängigkeit den Wirkungsort der FGF-Hormone auf Klotho-exprimierende Gewebe/Organe beschränkt (d. h. Nieren und Nebenschilddrüsen im Fall von FGF23). In Übereinstimmung mit dem Fehlen einer direkten Rolle von Klotho bei der FGFRS-Rekrutierung zeigen wir, dass der asymmetrische Modus der Rezeptordimerisierung auch auf parakrine FGFs anwendbar ist. Im Gegensatz zu FGF-Hormonen haben parakrine FGFs eine erhebliche Affinität zu HS und können sich daher ausschließlich auf HS als obligatorischen Korezeptor verlassen, um sowohl FGFRP stabil zu binden als auch FGFRS zu rekrutieren. Trotz struktureller Ähnlichkeit sind Klotho- und HS-induzierte endokrine 1:2-FGF-FGFR-Dimere den HS-induzierten parakrinen 1:2-FGF-FGFR-Dimeren thermodynamisch unterlegen. Aufgrund der schwachen HS-Bindungsaffinität des FGF-Hormons wird FGFRS insbesondere im endokrinen 1:2-FGF-FGFR-Dimer weniger fest gebunden, was für die schwächere Rezeptoraktivierung/Signalkapazität von FGF-Hormonen im Vergleich zu parakrinen FGFs verantwortlich ist, wie von postuliert unser „Schwellenwertmodell“ für die FGF-Signalspezifität38. Bemerkenswerterweise ist das asymmetrische Rezeptordimerisierungsmodell mit der Rezeptorheterodimerisierung kompatibel, die wahrscheinlich als zusätzlicher Mechanismus zur qualitativen und quantitativen Feinabstimmung der FGF-Signalisierung dient.

Das ligationsunabhängige In-Fusion HD-Klonierungskit (Nr. 639648, Clontech) wurde verwendet, um Neomycin- und Hygromycin-resistente pEF1α-IRES-neo- und pEF1α-IRES-hygro-lentivirale Vektoren zu konstruieren, die für menschliches Wildtyp-FGFR2c, FGFR3c und voller Länge kodieren FGFR4 gemäß dem zuvor für das humane lentivirale Expressionskonstrukt FGFR1c beschriebenen Protokoll6. Das pET-30a-basierte bakterielle Expressionskonstrukt für N-terminal his-markiertes menschliches FGF23 (Reste Tyr25 bis Ile251) wurde bereits beschrieben6. pHLsec-Expressionsvektoren, die die extrazelluläre Ligandenbindungsregion (d. h. D2-D3-Region) von FGFR3c (Reste Asp142 bis Arg365; FGFR3cecto) und FGFR4 (Reste Asp142 bis Arg365; FGFR4ecto) kodieren, wurden nach der gleichen Strategie hergestellt, die zuvor für den Menschen beschrieben wurde FGFR1cecto (Ref. 6). Mit einem ortsspezifischen Q5-Mutagenese-Kit (Nr. E0554S, New England Biolabs Inc.) wurden Mutationen und Verkürzungen an einzelnen und mehreren Stellen in Expressionskonstrukte eingeführt, die für die Wildtyp-Proteine ​​kodieren. Die Expressionskonstrukte wurden durch Restriktionsenzymverdauung und DNA-Sequenzierung verifiziert.

Um minimal glykosylierte Ektodomänen von FGFR1c, 3c und 4 zu produzieren, wurden N-Acetylglucosaminyltransferase I (GnTI−) defiziente HEK293S-Zellen vorübergehend mit entsprechenden pHLsec-Expressionskonstrukten über kationisches Polymer Polyethylenimin (PEI, Nr. 23966-1, Polysciences, Inc.) transfiziert ein veröffentlichtes Protokoll40. Dann wurde 24 Stunden nach der Transfektion Trypton N1 (TN1, Katalog-Nr. 19553, Organotechnie) zum Medium hinzugefügt, um die Proteinexpression zu fördern. Am dritten Tag wurden sekretierte FGFR-Ektodomänen aus 1 l konditioniertem Medium auf einer Heparin-Affinitäts-HiTrap-Säule (Nr. 17040703, GE Healthcare) eingefangen und mit 20 Säulenvolumen Salzgradient (0–2 M) eluiert. Fraktionen, die FGFRecto-Proteine ​​enthielten, wurden gepoolt, auf 5 ml konzentriert und auf eine Superdex-75-Gelfiltrationssäule (Nr. 28989333, GE Healthcare) aufgetragen. FGFRecto-Proteine ​​wurden isokratisch in 25 mM HEPES-Puffer, pH = 7,5, der 1 M NaCl enthielt, eluiert. Wildtyp- und mutierte FGF23-Proteine ​​wurden in E. coli als Einschlusskörperchen exprimiert, in vitro neu gefaltet und mittels sequenziellem Kationenaustausch und SEC nach einem etablierten Protokoll6 bis zur Homogenität gereinigt. Sekretiertes αKlothoecto wurde aus konditionierten Medien einer HEK293S-GnTI−-Zelllinie, die die gesamte extrazelluläre Domäne von menschlichem αKlotho (Reste Met1 bis Ser981; αKlothoecto) stabil exprimiert, unter Verwendung einer Heparin-Affinitäts-HiTrap-Säule, gefolgt von SOUCRE Q-Anionen- und Superdex 200-Säulenchromatographie, wie beschrieben, gereinigt vorher6.

Die quartären Komplexe FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS, FGF23–FGFR3c–αKlotho–HS oder FGF23–FGFR4–αKlotho–HS wurden durch Mischen von FGF23 mit einer der FGFR-Ektodomänen, αKlothoecto und einem Heparin-Dodecasaccharid 12 (HO12, Iduron Ltd) hergestellt ein Molverhältnis von 1:1:1:1. Die Gemische wurden auf etwa 5 mg ml-1 konzentriert, auf eine Superdex 200-Säule (Nr. 28989335, GE Healthcare) aufgetragen und isokratisch in 25 mM HEPES-Puffer, pH = 7,5, der 100 mM NaCl enthielt, eluiert. Peakfraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert und Topfraktionen, die die höchste Konzentration und Reinheit des quartären Komplexes enthielten, wurden ohne weitere Konzentration direkt für die Gittervorbereitung verwendet, um Proteinaggregation zu vermeiden. Die Endkonzentrationen der Komplexe FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS, FGF23–FGFR3c–αKlotho–HS und FGF23–FGFR4–αKlotho–HS für die Gittervorbereitung betrugen 1,5, 2,4 bzw. 1,5 mg ml−1.

Zur Herstellung der Kryo-EM-Gitter wurden 2–3 μl gereinigter Proteinkomplex mit etwa 1,5–2,5 mg ml−1 auf ein durch Glimmentladung entladenes Goldgitter (UltrAuFoil) aufgetragen. Das Gitter wurde dann 1–2 s lang unter 0 oder 1 Kraft bei 100 % Luftfeuchtigkeit mit einem Mark IV Vitrobot (FEI) abgetupft, bevor es in flüssiges Ethan getaucht wurde. Mikroaufnahmen der Komplexe FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS und FGF23–FGFR4–αKlotho–HS wurden mit einem Talos Arctica-Mikroskop mit K2-Direktelektronendetektor bei 36.000-facher Vergrößerung (entsprechend 1,096 Å pro Pixel) aufgenommen. Die verwendeten akkumulierten Dosen betrugen 50,37 e−/Å2 und 53,84 e−/Å2 für FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS bzw. FGF23–FGFR4–αKlotho–HS. Mikroaufnahmen des FGF23-FGFR3c-αKlotho-HS-Komplexes wurden mit einem Titan-Krios-Mikroskop aufgenommen, das mit einem K2-Direktelektronendetektor und einem Energiefilter ausgestattet war. Die verwendete Vergrößerung betrug 130.000-fach, mit einer Pixelgröße von 1,048 Å und einer akkumulierten Dosis von 72,44 e–/Å2. Leginon41 wurde verwendet, um die Löcher mit einer Eisdicke von 5–100 nm anzuvisieren, was dazu führte, dass 10.186, 6.409 und 16.602 Mikroaufnahmen für jeden der drei quartären Komplexe gesammelt wurden.

WARP42 wurde für die Bewegungskorrektur und die Schätzung der Kontrastübertragungsfunktion für alle drei Kryo-EM-Datensätze verwendet. Mikroskopische Aufnahmen mit einer Gesamtauflösung von weniger als 5,5 Å wurden ausgeschlossen. Die endgültige Anzahl der verwendeten Mikroaufnahmen betrug 9.501, 5.164 bzw. 15.049, was mehr als eine Million Partikel für jeden Komplex ergab. Anschließend wurden Partikelstapel zur zweidimensionalen Klassifizierung, Ab-initio-Rekonstruktion mit drei oder vier Modellen und dreidimensionaler Klassifizierung in cryoSPARC43 importiert. Schließlich wurden 1.497.967 (FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS), 291.540 (FGF23–FGFR3c–αKlotho–HS) und 856.877 (FGF23–FGFR4–αKlotho–HS) Partikel für die heterogene Verfeinerung mit C1-Symmetrie verwendet, was zu 2,74, 3,20 und führte Auflösungen von jeweils 3,03 Å. Komponenten/Domänen aus FGF23–FGFR1c–αKlotho-Röntgenstrukturen (PDB: 5W21) wurden mithilfe von Chimera44 manuell in Kryo-EM-Dichtekarten angedockt und der starre Körper wurde verfeinert. Die ersten Modelle wurden dann in Coot45 angepasst und in Phenix46 im realen Raum verfeinert. Verfeinerungs- und Modellstatistiken sind in der erweiterten Datentabelle 1 dargestellt. Repräsentative Kryo-EM-Bilder, zweidimensionale Klassenmittelwerte und dreidimensionale Karten jedes Quartärkomplexes sind in der erweiterten Datentabelle 1 dargestellt.

Die Kryo-EM-Struktur des quartären FGF23-FGFR1c-αKlotho-HS-Komplexes wurde in einer Wasserbox von 16 × 16 × 16 nm3 solvatisiert. Zur Generierung der Konfiguration, Topologie47,48,49,50 und der Parameterdateien mit dem Kraftfeld CHARMM36m51 wurde der CHARMM-GUI-Server verwendet. Zusätzlich zu den Proteinmolekülen umfasste das Simulationssystem etwa 138.073 Wassermoleküle, 393 Natrium- und 393 Chloridionen (imitiert die im Proteinpuffer vorhandene 150 mM NaCl), was insgesamt 439.298 Atome ergab. Mit GROMACS 2021 (Ref. 52) wurde bei 303 K und einem Zeitschritt von 2 fs eine 300-ns-Allatom-MD-Simulationstrajektorie generiert. Bei den Simulationen wurde die kubisch-periodische Randbedingung verwendet und die Van-der-Waals-Wechselwirkung von 1 nm auf 1,2 nm ausgeschaltet. Die weitreichenden elektrostatischen Wechselwirkungen wurden mit der Partikelnetz-Ewald-Methode (PME) berechnet. Die Energieminimierung wurde unter Verwendung des steilsten Abstiegsalgorithmus durchgeführt, gefolgt von einer 0,4 ns dauernden konstanten Partikelanzahl, einem konstanten Volumen und einer konstanten Temperatur (NVT) und einer 20 ns dauernden Gleichgewichtssimulation mit konstanter Partikelanzahl, einem konstanten Druck und einer konstanten Temperatur (NPT) durch schrittweise Verringerung der Kraftbeschränkungen ab 1000 kJ mol−1 nm−2 bis 400 kJ mol−1 nm−2 (für die NVT-Stufe) und 400 kJ mol−1 nm−2 bis 40 kJ mol−1 nm−2 (für die NPT-Stufe). Am Ende der Gleichgewichtsschritte wurden alle Kraftbeschränkungen entfernt und die MD-Simulation im NPT-Ensemble durchgeführt.

HEK293T-Zellen (verifiziert durch eine Morphologieprüfung unter dem Mikroskop, Mykoplasmen-negativ in 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)) wurden für die Verpackung lentiviraler Vektoren und die Produktion von Viruspartikeln mit hohem Titer verwendet. Eine L6-Myoblastenzelllinie (Nr. GNR 4, National Collection of Authenticated Cell Cultures) wurde als Wirt für die stabile Expression von menschlichem FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c, FGFR4 in voller Länge (Transmembran) und Mutanten davon verwendet. L6-Zellen exprimieren endogen HSPGs, verfügen jedoch nicht über FGFRs und den αKlotho-Korezeptor und reagieren daher von Natur aus nicht auf FGF23. Durch kontrollierte ektopische Koexpression verwandter FGFRs und αKlotho oder exogene Ergänzung mit löslichem αKlothoecto können diese Zellen jedoch auf die FGF23-Stimulation reagieren. Dementsprechend sind L6-Zellen ausgezeichnete Wirte für Rekonstitutionsstudien der FGF23-Signalübertragung in einer physiologischen Umgebung. Sowohl HEK293T- als auch L6-Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Nr. C11995500BT, Gibco) gehalten, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS, Nr. FSD500, ExCell Bio), 100 U ml-1 Penicillin und 100 μg ml −1 Streptomycin (Nr. P1400, Solarbio). Die virale Verpackung und Erzeugung der rekombinanten Lentivirus-Partikel in HEK293T-Zellen erfolgte unter Verwendung veröffentlichter Protokolle33. Für eine stabile Expression einzelner Wildtyp- oder mutierter FGFR-Zelllinien wurden 2 × 105 L6-Zellen in Zellkulturschalen mit sechs Vertiefungen ausplattiert und mit Lentivirus-Partikeln infiziert, die das gegebene FGFR in Gegenwart von Polybrene (5 μg ml–1; Nr. sc-134220, Santa Cruz Biotechnology). Stabile Transfektanten wurden unter Verwendung von G418 (0,5 mg ml-1, Nr. HY-17561, MedChemExpress) oder Hygromycin (8 μg ml-1, Nr. HY-B0490, MedChemExpress) ausgewählt. Für die FGFR1c+αKlothoTM-koexprimierende Zelllinie wurden L6-Zellen, die FGFR1cWT stabil exprimieren (resistent gegen G418), mit lentiviralen Partikeln infiziert, die für Wildtyp- oder mutiertes Transmembran-αKlotho (αKlothoTM) kodieren, und die koexprimierenden Zellen wurden unter Verwendung von Hygromycin (80 μg) ausgewählt ml−1, Nr. HY-B0490, MedChemExpress).

Für Zellstimulationsstudien wurden parentale und stabil transfizierte L6-Zellen in Zellkulturplatten mit 12 Vertiefungen in einer Dichte von 1 × 105 Zellen pro Vertiefung ausgesät und 24 Stunden lang dort gehalten. Am nächsten Tag wurden die Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült und dann 12 Stunden lang Serum ausgehungert und 5, 10, 20 und 40 Minuten lang mit FGF23WT und αKlothoecto costimuliert. Für die Stimulation zu einem einzigen Zeitpunkt wurden die Proben nach 5 Minuten entnommen.

Nach der Stimulation wurden die Zellen lysiert und die gesamten Lysatproben durch Western Blot analysiert, wie zuvor beschrieben33. Die folgenden Antikörper wurden verwendet: phosphoryliertes FGFR (1:1000, Nr. 3471S, Cell Signaling Technology), phosphoryliertes FRS2α (1:1000, Nr. 3864S, Cell Signaling Technology), phosphoryliertes PLCγ1 (1:1000, Nr. 2821S, Cell Signaling Technology), phosphoryliertes ERK1/2 (1:1000, Nr. 4370S, Cell Signaling Technology), α-Tubulin (1:20000, Nr. 66031-1-Ig, Proteintech), Gesamt-FGFR1 (1:1000, Nr . 9740S, Cell Signaling Technology), Gesamt-FGFR2 (1:1000, Nr. 23328S, Cell Signaling Technology), Gesamt-FGFR3 (1:1000, Nr. ab133644, Abcam), Gesamt-FGFR4 (1:1000, Nr. 8562S, Cell Signaling Technology), HRP-konjugiertes Ziege-Anti-Maus-IgG (H + L) (1:5000, Nr. SA00001-1, Proteintech), HRP-konjugiertes Ziege-Anti-Kaninchen-IgG (H + L) (1:5000, Nr. SA00001-2, Proteintech). Blots wurden unter Verwendung verstärkter Chemilumineszenzreagenzien (Nr. P10300, NCM Biotech Laboratories) mit dem ChemiDoc XRS+-System (Bio-Rad) oder Amersham ImageQuant 800 (GE) entwickelt.

Die Endoglycosidase H (Endo H)-Sensitivität wurde verwendet, um mögliche Auswirkungen von Ektodomänenmutationen auf die FGFR-Glykosylierung/-Reifung und damit den Transport zur Zelloberfläche zu analysieren. In Immunoblots wandern Wildtyp-FGFRs als Dublett einer großen diffusen oberen und einer kleinen scharfen unteren Bande. Das obere Band stellt den vollständig glykosylierten reifen FGFR dar, dekoriert mit komplexen Zuckern, der die ER-Qualitätskontrolle bestanden hat und erfolgreich an die Zelloberfläche transportiert wurde. Andererseits ist das schneller wandernde untere Band eine unvollständig verarbeitete Form mit hohem Mannosegehalt, die im ER gefangen ist. Mutationen, die die Rezeptorreifung beeinflussen, manifestieren sich in einem Anstieg des Anteils der schneller wandernden ER-residenten Bande. Die mannosereiche Form reagiert empfindlich auf Endo H, das die Bindung zwischen zwei N-Acetylglucosamin (GlcNAc)-Untereinheiten direkt proximal zum Asparaginrest spaltet. Die vollständig glykosylierte Zelloberflächenbande ist jedoch resistent gegen Endo H. Dementsprechend kann die Zelloberflächenhäufigkeit von FGFRs als Verhältnis der Endo H-resistenten Fraktion zur gesamten Rezeptorexpression ausgedrückt werden, die durch Behandlung des Rezeptors mit PNGase F bestimmt wird Dieses Enzym ist eine Amidase, die die Bindung zwischen dem innersten GlcNAc und Asparagin unabhängig vom Gehalt an komplexen Zuckern hydrolysiert und so den FGFR vollständig von allen seinen N-gebundenen Zuckern befreit. Dementsprechend wurden WT- oder mutierte FGFR-Zelllinien in einem NP-40-Lysepuffer (Biotime, Nr. P0013F, ergänzt mit 1 mM PMSF) 15 Minuten lang bei 4 ° C lysiert. Zunächst wurden 20 μg Gesamtprotein (quantifiziert durch BCA-Assay) mit Glykoprotein-Denaturierungspuffer 10 Minuten lang bei 100 °C denaturiert und dann mit 500 Einheiten Endo H (New England Biolabs, Nr. P0702S) oder Peptid-N-Glycosidase F behandelt (PNGase F) (New England Biolabs, Nr. P0704S) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Mit Endo H und PNGase F behandelte Proben wurden wie oben beschrieben mit FGFR-Isoform-spezifischen Antikörpern immungeblottet.

Die Molekülmasse des SEC-gereinigten quartären FGF23-FGFR1c-αKlotho-HS-Komplexes wurde durch Mehrwinkel-Lichtstreuung nach dem etablierten Protokoll6 bestimmt. Vor dem Experiment wurden mindestens 60 ml entgaster Laufpuffer (25 mM HEPES, pH 7,5, enthaltend 150 mM NaCl) durch das System geleitet, um die Säule auszugleichen und stabile Basislinien für Lichtstreuung und Brechungsindexdetektoren festzulegen. Anschließend wurden 50 μl des gereinigten quaternären FGF23-FGFR1c-αKlotho-HS-Komplexes (1,5 mg ml-1) auf die Superdex 200 10/300 GL-Säule injiziert und der Eluent kontinuierlich bei 280 nm Absorption, Laserlichtstreuung und Brechungsindex überwacht bei einer Durchflussrate von 0,5 ml min−1. Als Kontrolle wurden 50 μl einer gereinigten Probe des ternären FGF23-FGFR-αKlotho-Komplexes (1,5 mg ml−1) unter den gleichen Bedingungen analysiert. Die Experimente wurden bei Umgebungstemperatur durchgeführt. Die Laserlichtstreuintensität und die Brechungsindexwerte des Eluenten wurden zur Ableitung der Molekülmasse verwendet, wie von der ASTRA-Software (Wyatt Technology Corp.) implementiert.

Die Zellen wurden auf Mikroskop-Deckgläsern (Nr. WHB-12-CS-LC, WHB) ausgesät, in Zellkulturschalen mit 12 Vertiefungen mit 1 × 105 Zellen pro Vertiefung platziert und 24 Stunden lang anhaften gelassen. Am nächsten Tag wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und das Serum 12 Stunden lang ausgehungert. Nach der Kostimulation mit FGF23WT und αKlothoecto für 20 Minuten wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und vor der PLA 30 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd fixiert. Die PLA-Reaktion wurde mit einem Duolink PLA-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers (Nr. DUO92101, Sigma-Aldrich) durchgeführt und mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. Kurz gesagt, die Objektträger wurden 60 Minuten lang bei 37 °C mit Blockierungslösung behandelt, dreimal mit Waschpuffer A gespült und dann über Nacht bei 4 °C mit zwei verschiedenen Primärantikörpern inkubiert, die in zwei verschiedenen Spezies für jede interessierende FGFR-Isoform gezüchtet wurden (FGFR1 ( 1:20, Nr. PA5-25979, ThermoFisher) aus Kaninchen, FGFR1 (1:100, Nr. ab824, Abcam) aus Maus, FGFR2 (1:100, Nr. 23328S, Cell Signaling Technology) aus Kaninchen, FGFR2 (1 :50, Nr. sc-6930, Santa Cruz Biotechnology) von der Maus, FGFR3 (1:100, Nr. MA5-32620, ThermoFisher) vom Kaninchen, FGFR3 (1:100, Nr. sc-13121, Santa Cruz Biotechnology) von Maus, FGFR4 (1:100, Nr. 8562S, Cell Signaling Technology) vom Kaninchen, FGFR4 (1:100, Nr. sc-136988, Santa Cruz Biotechnology) von der Maus). Nach drei Spülungen mit Waschpuffer A wurden die Objektträger 1 Stunde lang bei 37 °C mit oligogebundenen Sekundärantikörpern (Duolink Anti-Maus-Minus und Anti-Kaninchen-Plus) inkubiert. Die Objektträger wurden erneut mit Waschpuffer A gespült und 30 Minuten lang bei 37 °C in Ligaselösung getaucht, um die Bildung zirkulärer DNA zu ermöglichen, gefolgt von einer 100-minütigen Inkubation mit Polymeraselösung bei 37 °C zur Rolling-Circle-Amplifikation in einem dunklen Raum. Die Objektträger wurden zweimal jeweils 10 Minuten lang mit Waschpuffer B gespült, gefolgt von einem 1-minütigen Spülen mit einer 100-fachen Verdünnung von Puffer B. Für die Bildanalyse wurden die Objektträger mit Deckgläsern abgedeckt, wobei eine minimale Menge Duolink PLA-Eindeckmedium mit DAPI verwendet wurde. Die Objektträger wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (C2si, Nikon) untersucht.

Alle statistischen Analysen wurden mit GraphPad Prism 8.0 durchgeführt. Zur statistischen Analyse der Immunblotting-Daten wurden densitometrische Werte (bestimmt mit ImageJ) aus drei unabhängigen Experimenten verwendet. Zur statistischen Analyse der PLA-Daten wurde eine Anzahl fluoreszierender Punkte und Zellen (manuell gezählt) aus sechs zufällig ausgewählten Mikroskopfeldern aus zwei biologisch unabhängigen Experimenten verwendet. Verarbeitung der Western-Blot- und PLA-Daten in Abb. 2c,d, 3b–d und 4b,c wurden unter Verwendung einer Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Tukey, durchgeführt. Eine Einweg-ANOVA, gefolgt von Tukey, wurde angewendet, um die Western-Blot-Daten in Extended Data Abb. 3 zu verarbeiten. Proteinreinigungen wurden mindestens acht Mal wiederholt, was Proben mit vergleichbarer Reinheit/Menge ergab. Western-Blot-Experimente wurden in biologischen Dreifachversuchen mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt. PLA-Assays wurden mindestens zweimal unabhängig voneinander wiederholt, mit analogen Ergebnissen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Elektronendichtekarten und verfeinerte Modelle für FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS (EMD-34075, PDB: 7YSH), FGF23–FGFR3c–αKlotho–HS (EMD-34082, PDB: 7YSU) und FGF23–FGFR4–αKlotho–HS ( EMD-34084, PDB: 7YSW) quartäre Komplexe wurden in der Electron Microscopy Data Bank hinterlegt und werden nach Annahme des Manuskripts freigegeben. Rohe, unbeschnittene Western-Blot-Bilder sind in der ergänzenden Abbildung 1 zusammengestellt. Quelldaten werden mit diesem Artikel bereitgestellt.

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Finanzielle Unterstützung wurde vom National Key R&D Program of China (2017YFA0506000 an XL), der National Natural Science Foundation of China (82073705 & 82273842 an GC, 82103999 an LC, 81930108 an GL), dem Oujiang Laboratory Startup Fund (OJQD2022007 an MM) bereitgestellt. Kungpeng Action Plan Award (an MM), Natural Science Funding of Zhejiang Province (LR22H300002 an GC, LQ22H300007 an LC), Wenzhou Major Scientific and Technological Innovation Project (ZY2021023 an GC), Qianjiang Talent Plan von Zhejiang (QJD1902016 an GC) und Wenzhou Startup-Fonds des Instituts (UCAS) (WIUCASQD2021043, an YW).

Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Lingfeng Chen, Lili Fu, Jingchuan Sun, Zhiqiang Huang, Mingzhen Fang

Oujiang Laboratory (Zhejiang Lab for Regenerative Medicine, Vision, and Brain Health), School of Pharmaceutical Sciences, Wenzhou Medical University, Wenzhou, China

Lingfeng Chen, Lili Fu, Jingchuan Sun, Zhiqiang Huang, Mingzhen Fang, Xin Liu, Junliang Lu, Zixiang Pan, Yang Wang, Xiaokun Li, Gaozhi Chen und Moosa Mohammadi

Fakultät für Pharmazeutische Wissenschaften, Hangzhou Medical College, Hangzhou, China

Lingfeng Chen & Guang Liang

Institut für Zellwachstumsfaktor, Oujiang Laboratory (Zhejiang Lab for Regenerative Medicine, Vision, and Brain Health), Wenzhou, China

Lili Fu, Zhiqiang Huang, Mingzhen Fang, Xin Liu, Junliang Lu, Zixiang Pan, Gaozhi Chen und Moosa Mohammadi

Staatliches Schlüssellabor für makromolekulare Arzneimittel und großtechnische Vorbereitung, Wenzhou Medical University, Wenzhou, China

Lili Fu & Xiaokun Li

Labor für Zellschicksalkontrolle, School of Life Sciences, Westlake University, Hangzhou, China

Jingchuan Sun

Abteilung für Physiologie und Zellbiophysik, Columbia University Irving Medical Center, New York, NY, USA

Allen Zinkle

Zentrum für biomedizinische Physik, Wenzhou-Institut, Universität der Chinesischen Akademie der Wissenschaften, Wenzhou, China

Yang Wang

Nationales technisches Forschungszentrum für Zellwachstumsfaktor-Medikamente und Proteinbiologika, Wenzhou Medical University, Wenzhou, China

Xiaokun Li

Institut für chronische Nierenerkrankungen, Wenzhou Medical University, Wenzhou, China

Gaozhi Chen

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LC exprimierte, reinigte und präparierte die quartären Komplexe, führte die Größenausschlusschromatographie-Mehrwinkel-Lichtstreuungsanalyse durch und erstellte die Strukturfiguren. LC und JS bereiteten die Kryo-EM-Gitter vor und sammelten und verarbeiteten die Bilder. AZ exprimierte und gereinigte FGFR-Ektodomänen. LF erzeugte die Expressionskonstrukte für Säugetiere. JL exprimierte die mutierten FGF23-Proteine. LF, ZH, MF, XL, ZP und GC generierten Western-Blot- und PLA-Daten und erstellten die entsprechenden Zahlen. YW hat MD-Simulationsdaten generiert. MM konzipierte das Projekt, baute und analysierte die Strukturmodelle und verfasste das Manuskript. Alle Autoren beteiligten sich an der Diskussion und Überarbeitung des Manuskripts.

Korrespondenz mit Xiaokun Li, Gaozhi Chen oder Moosa Mohammadi.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature dankt Makoto Kuro-o und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Bildverarbeitungsworkflow für den quartären FGF23-FGFR-αKlotho-HS-Komplex, der FGFR1c (links), FGFR3c (Mitte) oder FGFR4 (rechts) als Rezeptorkomponente enthält. Die Goldstandard-Fourier-Shell-Korrelation (GSFSC) zeigt globale Auflösungen von 2,74, 3,20 und 3,03 Å für die quartären Komplexe FGF23-FGFR1c-αKlotho-HS, FGF23-FGFR3c-αKlotho-HS und FGF23-FGFR4-αKlotho-HS.

A: Cartoon-Darstellung der Kryo-EM-Struktur des quaternären 1:2:1:1-Komplexes FGF23-FGFR-αKlotho-HS in vier verschiedenen Ausrichtungen, die durch eine 90°-Drehung entlang der vertikalen Achse verbunden sind. Der asymmetrische quartäre Komplex hat eine durchschnittliche Abmessung von 130 Å × 100 Å × 55 Å. Die Nähe der Membraninsertionspunkte von FGFR-Ketten (~25 Å voneinander entfernt) würde die Bildung eines asymmetrischen A-Loop-transphosphorylierenden Dimers der intrazellulären Kinasedomäne begünstigen27. FGF23, αKlotho und HS sind jeweils in Orange, Blau und Magenta dargestellt. Primärer Rezeptor (FGFRP) und sekundärer Rezeptor (FGFRS) sind in Hellgrün und Cyan dargestellt. Gestrichelte Linien bezeichnen die Reste 172–182 von FGF23, dem Linker zwischen dem Kleeblattkern von FGF23 und seiner distalen αKlotho-Bindungsstelle, der aufgrund fehlender interpretierbarer Elektronendichte nicht aufgebaut werden konnte. Diese Region interagiert weder mit αKlotho noch mit FGFR und ist wahrscheinlich ungeordnet/flexibel. Bemerkenswert ist, dass diese Region die regulatorische Subtilisin-ähnliche Proproteinkonvertase (SPC)-Stelle 176RHT178R179/S180AE182 beherbergt, die eine Furin-Typ-Protease-Spaltungsstelle (R179), eine O-Glykosylierungsstelle (T178) und eine Serinphosphorylierungsstelle (S180) umfasst. Drei Enzyme, nämlich GalNAc-T3 (N-Acetylgalactosaminyltransferase3), Fam20C (die Familie mit Sequenzähnlichkeit 20, Mitglied C) und eine noch zu entdeckende Protease vom Furin-Typ, laufen an dieser Stelle zusammen, um die FGF23-Prozessierung zu regulieren. Die hohe Flexibilität dieser Region ist wahrscheinlich für die Wirkung dieser Enzyme notwendig. B, die FGF23-Signalisierung ist streng αKlotho-abhängig. L6-FGFR1cWT-Zellen wurden mit steigenden Konzentrationen von rekombinantem FGF23WT allein, in Kombination mit löslichem αKlotho behandelt oder unbehandelt gelassen. Ganzzelllysate wurden wie in Abb. 2c immungeblottet. Beachten Sie, dass selbst höhere pharmakologische Konzentrationen (bis zu 10 Mikromolar) von FGF23WT die FGFR1c-Signalübertragung nicht aktivieren. Bei gleichzeitiger Behandlung mit löslichem αKlotho induzieren jedoch bereits 10 nM FGF23 eine starke FGFR1c-Aktivierung. Experimente wurden in biologischen Dreifachversuchen mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt. C: Überlagerung der Röntgenstruktur des ternären Komplexes FGF23–FGFR1c–αKlotho (PDB-ID: 5W21, grün gefärbt) mit dem entsprechenden Teil FGF23–FGFR1cP–αKlotho innerhalb der Kryo-EM-Struktur von 1:2:1:1 Der quartäre FGF23-FGFR1c-αKlotho-HS-Komplex (rosa gefärbt) zeigt einen hohen Ähnlichkeitsgrad (RM)D von 1,16 Å].

a, Denaturierte Lysate von L6-FGFR1cWT, L6-FGFR1cK175Q/K177Q (FGFR1cΔHBS1), L6-FGFR1cK207Q/R209Q (FGFR1cΔHBS2) und L6-FGFR1cK175Q/K177Q/K207Q/R209Q (FGFR1cΔHBS1). +2) Zellen wurden mit Endoglykosidase H (Endo H) oder Peptid-N-Glycosidase F (PNGase F) oder unbehandelt. Die Proben wurden mit einem FGFR1c-Isoform-spezifischen Antikörper immungeblottet. Die Immunblotting-Daten wurden wie im Abschnitt „Methoden“ beschrieben quantifiziert und werden als Mittelwert ± SD dargestellt. b–d, Denaturierte Lysate von L6-Zelllinien, die FGFR1cWT, seine vier Standort-2-Mutanten (FGFR1cE249A, FGFR1cR254A, FGFR1cI256A, FGFR1cY280A) und einen Standort-1-Mutanten (FGFR1cA170D/A171D/S219D) stabil exprimieren (b), Wildtyp-FGFR3c (FG FR3cWT) oder seine vier Standort-2-Mutanten (FGFR3cE247A, FGFR3cR252A, FGFR3cI254A, FGFR3cY278A) (c), Wildtyp-FGFR4 (FGFR4WT) oder seine vier Standort-2-Mutanten (E243A, R248A, I250A, Y274A) (d) wurden mit Endo H behandelt, PNGase F oder unbehandelt. Die Proben wurden wie angegeben mit FGFR-Isoform-spezifischen Antikörpern immungeblottet. Experimente wurden in biologischen Dreifachversuchen mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt. Die Quantifizierung erfolgte wie im Abschnitt „Methoden“ beschrieben und wird als Mittelwert ± SD P-Werte dargestellt, die durch eine einfache ANOVA gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichen im Post-hoc-Test bestimmt wurden.

Quelldaten

A, links und Mitte: Cartoon-Darstellungen der FGF23-FGFRS- und FGFRP-αKlotho-Komponenten des quartären Komplexes, dargestellt in der Ausrichtung, die durch Ausrichtung der D2-Domänen von FGFRS und FGFRP erhalten wurde. Rechts: Überlagerung von FGF23-FGFRS- und FGFRP-αKlotho-Komponenten durch Ausrichtung der D3-Domänen der Rezeptoren. Beachten Sie, dass der N-Terminus von FGF23 und die αKlotho-RBA in die entsprechenden hydrophoben Furchen in D3 der FGFRS- und FGFRP-Ketten eingreifen. b–d, der N-Terminus von FGF23 erfährt eine große Konformationsänderung in quartären FGF23-FGFR-αKlotho-HS-Komplexen. Cartoon- und Oberflächendarstellung (nur für FGF23-Komponente) des HS-freien ternären Komplexes (d. h. Röntgenstruktur) (b) und des HS-induzierten quartären Komplexes (d. h. Kryo-EM-Strukturen) (c) in derselben Ausrichtung erhalten durch Ausrichtung ihrer FGF23-Ketten. (d) Cartoon-Darstellung einer Überlagerung zwischen FGF23-FGFR1c aus dem ternären FGF23-FGFR1c-αKlotho-Komplex und FGF23-FGFR1cP aus dem quartären Komplex über FGF23-Alignment. Beachten Sie den dramatischen Unterschied in den Positionen des FGF23-N-Terminus zwischen den beiden Strukturen. e, Elektronendichten des FGF23-N-Terminus in Kryo-EM-Strukturen von quartären FGF23-FGFR1c-αKlotho-HS-Komplexen auf den angegebenen Konturebenen. Beachten Sie, dass die Elektronendichten für den FGF23-N-Terminus schwach und lückenhaft sind. f–i, MD-Simulationsdaten zeigen, dass der N-Terminus von FGF23 D3 von FGFR1cS aktiviert. f, Links: Cartoon-Darstellung der Kryo-EM-Struktur des quartären FGF23-FGFR1c-αKlotho-HS-Komplexes. FGF23, FGFR1cP, FGFR1cS und αKlotho sind jeweils in Orange, Grün, Cyan und Blau erhältlich. Rechts: Vergrößerte Ansicht des eingerahmten Bereichs (links), der den Konformationsverlauf des N-terminalen Schwanzes von FGF23 (d. h. Y25 bis W36) und D3 von FGFR1cS in einer 300-ns-MD-Simulationstrajektorie zeigt, angezeigt durch einen Farbübergang vom Orange (0 ns) bis blau (300 ns) in 60-ns-Intervallen. Der N-Terminus von FGF23 interagiert mit dem dreisträngigen βC:βF:βG-Faltblatt in der FGFR1cS-D3-Domäne. gh, Änderungen in RMSD (g) bzw. Root Mean Square Fluctuation (RMSF, h) des N-terminalen Schwanzes von FGF23 während der MD-Simulation. Beachten Sie, dass sich die RMSD der N-terminalen Reste von FGF23 nach 120 ns bei etwa 4 Å stabilisierte. Wichtig ist, dass die Reste am distalen und proximalen Ende des FGF23-N-Terminus den größten bzw. kleinsten RMSF aufwiesen, was ihre jeweiligen Kryo-EM-Elektronendichten widerspiegelt (vergleiche e und h). i, Änderungen der Abstände von vier ausgewählten Kontaktpaaren (Y25–L342S, S29–R254S, L31–A259S und L32–I256S) zwischen N-terminalen Resten von FGF23 und Resten in D3 von FGFR1cS. Die Abstände der hydrophoben Restpaare Y25–L342S, L31–A259S und L32–I256S schwankten um 5 Å, was auf die Bildung hydrophober Kontakte zwischen diesen Restpaaren hinweist. Ebenso schwankte der paarweise Abstand für S29-R254S nach 120 ns um 4 Å, was auf eine Wasserstoffbrückenbindung zwischen den Seitenketten dieses Restpaars hinweist.

ab, Begründung für den Rezeptorkomplementationstest. Mitte: Cartoon-/Oberflächendarstellung des quartären Komplexes FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS in zwei Ausrichtungen, die durch 180°-Rotation um die Y-Achse in Beziehung stehen. Kreise geben ungefähre Umfänge von Ligandenbindungsstellen in primären und sekundären Rezeptoren an, die für die Mutagenese ausgewählt wurden. a, links: Erweiterte Ansicht der eingekreisten Region auf dem sekundären Rezeptor, die zeigt, dass Ile-203 und Ser-223 von FGFR1cS hydrophobe und Wasserstoffbrückenbindungskontakte mit Resten im Kern von FGF23 eingehen. Rechts: Erweiterte Ansicht der eingekreisten Region auf dem Primärrezeptor, die zeigt, dass Ala-167 und Val-248 von FGFR1cP hochkonservierte hydrophobe Kontakte mit Tyr-124 bzw. Leu-158 von FGF23 eingehen. Darüber hinaus geht Ala-167 auch eine Wasserstoffbrücke mit Tyr-124 ein. b, Links, vergrößerte Ansicht der eingekreisten Region auf dem Primärrezeptor, die zeigt, dass die entsprechenden Ile-203 und Ser-223 in FGFR1cP dem Lösungsmittel ausgesetzt sind. Somit sollte ein manipuliertes FGFR1cI203E/S223E-Molekül (d. h. FGFR1cΔSLBS) die Fähigkeit bewahren, als primärer Rezeptor zu fungieren, obwohl es die Fähigkeit verliert, als sekundärer Rezeptor zu fungieren. Rechte, vergrößerte Ansicht der eingekreisten Region auf dem sekundären Rezeptor, die zeigt, dass die entsprechenden Ala-167 und Val-248 in FGFR1cS keine Rolle bei der Bildung des quartären Komplexes spielen und dem Lösungsmittel ausgesetzt sind. Daher wird vorausgesagt, dass eine manipulierte FGFR1cA167D/V248D-Mutante (d. h. FGFR1cΔPLBS) die Fähigkeit verliert, als primärer Rezeptor zu fungieren, aber immer noch als sekundärer Rezeptor fungieren könnte. c, Demonstration der Rezeptorkomplementierung zwischen FGFR1cΔSLBS und FGFR1cΔPLBS und zwischen FGFR4ΔSLBS und FGFR1cΔPLBS über PLA. Es werden repräsentative Fluoreszenzmikroskopiefelder stabiler Zelllinien gezeigt, die PLA ausgesetzt wurden. Maßstabsbalken, 10 μm. Die Experimente wurden mindestens zweimal biologisch wiederholt und erzielten ähnliche Ergebnisse. d, Strukturbasiertes Sequenz-Alignment der Ligandenbindungsregionen (d. h. D2, D2-D3-Linker und D3) aller sieben FGFR-Isoformen. Als Orientierungshilfe wird eine schematische Darstellung eines prototypischen FGFR gezeigt und seine verschiedenen Domänen beschriftet. Die C-terminale Hälfte von D3, die in FGFR1-FGFR3 alternativ gespleißt wird, ist dunkelblau hervorgehoben. Beachten Sie, dass die ungespleißte N-terminale Hälfte von D3 zwischen den b- und c-Isoformen konserviert ist. Auf der Oberseite der Ausrichtung sind sekundäre Strukturelemente vorgesehen. Die mit HS interagierenden Reste sind alle in der D2-Domäne lokalisiert und in Magenta gefärbt. Rückstände, die die Schnittstellen FGF23-FGFRP und αKlotho-FGFRP vermitteln, sind gelb bzw. grün gefärbt. Beachten Sie, dass Reste, die direkte FGFRP-FGFRS-Kontakte vermitteln (in Hellblau), bei allen sieben Isoformen vollständig konserviert sind. Was die FGF23-FGFRS-Schnittstelle (in Orange) betrifft, sind zwischen den sieben Isoformen nur D2-Reste konserviert, die den Kern von FGF23 kontaktieren. Allerdings sind zwei hydrophobe D3-Reste, die mit dem FGF23-N-Terminus an der FGF23-FGFRS-Schnittstelle interagieren, nur in FGFR1c-3c und FGFR4 konserviert (angezeigt durch schwarze Pfeilspitzen). In FGFR1b-3b werden diese Reste, die mit der Bindungsstelle für RBA von αKlotho überlappen, durch geladene Reste ersetzt. Die Hydrophobie der D3-Furche FGFR1b-3b wird durch das Vorhandensein einer einzigartigen N-verknüpften Glykosylierungsstelle innerhalb ihrer D3-Furche (gekennzeichnet durch ein rotes Kästchen) weiter gestört. In FGFR2c wird ein wichtiger konservierter hydrophober Rest durch ein geladenes Lys-296 (rot unterstrichen) ersetzt, was wahrscheinlich für die Unfähigkeit von FGFR2c verantwortlich ist, αKlotho zu binden.

a, Immunoblots ganzer Zellextrakte aus unbehandelten oder FGF-behandelten (1 nM) untransfizierten und transfizierten L6-Zelllinien, die stabil FGFR1cWT, FGFR1cE249A, FGFR1cR254A, FGFR1cI256A oder FGFR1cY280A exprimieren, sondiert mit Antikörpern gegen phosphoryliertes FGFR, PLCγ1 und FRS2α. b, Immunblots von Ganzzellextrakten aus unbehandelten oder mit FGF behandelten (1 nM für FGF1 und 2 nM für FGF3/7/10/22) behandelten, nicht transfizierten und transfizierten L6-Zelllinien, die stabil FGFR2bWT, FGFR2bE250A, FGFR2bR255A, FGFR2bI257A oder FGFR2bY281A exprimieren, sondiert mit FGFR2b-Isoform-spezifischer Antikörper (oben) oder phosphospezifische Antikörper wie in Panel a. Experimente wurden in biologischen Dreifachversuchen mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt.

a, Schematische Darstellung, die zeigt, dass sich FGFR2bΔSLBS und FGFR2bΔPLBS als Reaktion auf parakrines FGF1/3/7/10 und HS gegenseitig ergänzen und 1:1:1:1 asymmetrische FGF-FGFR2bΔSLBS-FGFR2bΔPLBS-HS-Signalkomplexe bilden können. be, Demonstration der Rezeptorkomplementierung zwischen FGFR2bΔSLBS und FGFR2bΔPLBS mittels Westernblotting. L6-Zelllinien, die FGFR2bWT, FGFR2bΔPLBS, FGFR2bΔSLBS einzeln exprimieren oder FGFR2bΔSLBS mit FGFR2bΔPLBS coexprimieren, wurden mit 1 nM FGF1 (b), 2 nM FGF3 (c), 2 nM FGF7 (d) oder 2 nM FGF10 (e) behandelt In zunehmenden Zeitintervallen wurden die gesamten Zellextrakte wie angegeben immungeblottet. Experimente wurden in biologischen Dreifachversuchen mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt.

a, Schematische Darstellung, die zeigt, dass FGF1 oder FGF10, HS und FGFR1bΔSLBS (die als primärer Rezeptor dienen) stabile Komplexe bilden, die anschließend FGFR2bΔPLBS als sekundären Rezeptor rekrutieren. bc, L6-Zelllinien, die FGFR1bWT oder FGFR1bΔSLBS einzeln exprimierten oder FGFR1bΔSLBS + FGFR2bΔPLBS koexprimierten, wurden in zunehmenden Zeitintervallen mit 1 nM FGF1 (b) oder 2 nM FGF10 (c) behandelt und Zellextrakte wurden immungeblottet. d, Schematische Darstellung, die zeigt, dass FGF3 und FGFR2bΔSLBS (die als primärer Rezeptor dienen) in Gegenwart von HS einen stabilen Komplex bilden und anschließend FGFR3bWT als sekundären Rezeptor rekrutieren. e, L6-Zelllinien, die FGFR3bWT allein exprimierten oder es zusammen mit FGFR2bΔSLBS exprimierten, wurden für zunehmende Zeitintervalle mit 2 nM FGF3 behandelt und Zellextrakte wurden immungeblottet. Experimente wurden in biologischen Dreifachversuchen mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt.

a: Aufgrund der schwachen HS-Bindungsaffinität des FGF-Hormons ist HS allein nicht in der Lage, den endokrinen FGF-FGFR-Komplex zu stabilisieren und eine anhaltende asymmetrische Rezeptordimerisierung/-aktivierung zu induzieren. Unschärfe und lockere Assoziation werden verwendet, um die instabile/vorübergehende Natur des mutmaßlichen ternären FGF-FGFR-HS-Komplexes und die physiologisch unbedeutende Dimerisierung/Aktivierung des Rezeptors hervorzuheben. b: Der membrangebundene Klotho-Corezeptor greift gleichzeitig in die D3-Domäne von FGFR und den C-terminalen Schwanz von FGF ein und stabilisiert so den endokrinen FGF-FGFR-Komplex innerhalb eines ternären Komplexes. Auf diese Weise kompensiert der Klotho-Co-Rezeptor effektiv die HS-Inkompetenz bei der Stabilisierung des binären endokrinen FGF-FGFR-Komplexes. HS ist nun in der Lage, einen zweiten FGFR für den stabilisierten binären Komplex zu rekrutieren und so eine asymmetrische Dimerisierung zu induzieren. Dennoch sind Klotho und HS-induzierte endokrine 1:2 FGF-FGFR-Dimere aufgrund der schwachen HS-Bindungsaffinität des FGF-Hormons den HS-induzierten parakrinen 1:2 FGF-FGFR-Dimeren in Bezug auf Langlebigkeit/Stabilität immer noch unterlegen (angezeigt durch leichte Unschärfe). von FGFRS in b). c, Aufgrund ihrer hohen HS-Bindungsaffinität können sich parakrine FGFs auf HS als einzigen Co-Rezeptor verlassen, um primären FGFR stabil zu binden und einen sekundären FGFR zu rekrutieren, wodurch die Bildung starrer und langlebiger asymmetrischer Rezeptordimere induziert wird.

Ergänzende Abbildungen. 1–4 und Tabellen 1–2.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 06. September 2022

Angenommen: 02. Mai 2023

Veröffentlicht: 07. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06155-9

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