Die Entfernung von astrozytärem APOE4 bietet zerebrovaskulären Schutz trotz erhöhter zerebraler Amyloidangiopathie

Molecular Neurodegeneration Band 18, Artikelnummer: 17 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Sowohl die Alzheimer-Krankheit (AD) als auch die zerebrale Amyloidangiopathie (CAA) sind durch die Ansammlung von Amyloid-β (Aβ) im Gehirn gekennzeichnet, obwohl sich Aβ bei AD hauptsächlich im Gehirnparenchym und bei CAA im Gehirngefäßsystem ablagert. Das Vorhandensein von CAA kann die klinischen Ergebnisse von AD-Patienten verschlechtern, indem es spontane intrazerebrale Blutungen und Ischämie fördert, die zu einem CAA-assoziierten kognitiven Rückgang führen. Genetisch gesehen teilen AD und CAA das ε4-Allel des Apolipoprotein E (APOE)-Gens als stärksten genetischen Risikofaktor. Obwohl enorme Anstrengungen unternommen wurden, um die Rolle von APOE4 bei der Pathogenese parenchymaler Plaques bei AD aufzudecken, fehlen noch mechanistische Studien, die die Rolle von APOE4 bei CAA untersuchen. Hier haben wir untersucht, ob die Abschaffung von APOE4, das von Astrozyten, den Hauptproduzenten von APOE, erzeugt wird, ausreicht, um CAA und CAA-assoziierte Gefäßschäden zu lindern.

Wir haben transgene Mäuse erzeugt, die sowohl CAA als auch Plaques abgelagert haben, in denen die APOE4-Expression in Astrozyten selektiv unterdrückt werden kann. Im Alter von zwei Monaten, einem Zeitpunkt vor CAA und Plaquebildung, wurde APOE4 aus Astrozyten von 5XFAD APOE4-Knock-in-Mäusen entfernt. Mäuse wurden im Alter von 10 Monaten auf Aβ-Plaque- und CAA-Pathologie, Gliose und Gefäßintegrität untersucht.

Durch die Reduzierung der APOE4-Spiegel in Astrozyten verschob sich die Ablagerung von fibrillärem Aβ vom Hirnparenchym zum Gehirngefäßsystem. Trotz erhöhter CAA verringerte die Entfernung von astrozytischem APOE4 jedoch die Aβ-vermittelte Gliose insgesamt und führte auch zu einer erhöhten zerebrovaskulären Integrität und Funktion in Gefäßen, die CAA enthielten.

In einem CAA-Mausmodell reicht die Reduktion von APOE4, das speziell aus Astrozyten stammt, trotz erhöhter fibrillärer Aβ-Ablagerung im Gefäßsystem aus, um Aβ-vermittelte Gliose und zerebrovaskuläre Dysfunktion zu reduzieren.

Zerebrale Amyloidangiopathie (CAA) und Alzheimer-Krankheit (AD) sind klinisch unterschiedlich, weisen jedoch überlappende molekulare und genetische Merkmale auf. Der früheste erkennbare pathologische Marker beider neurodegenerativer Erkrankungen ist beispielsweise die Akkumulation von Amyloid-β (Aβ). Aβ lagert sich im Gehirngefäßsystem als CAA und als neuritische Plaques bei AD ab, obwohl CAA in 85–95 % der postmortalen AD-Gehirne gleichzeitig auftritt [1]. Die klinischen Manifestationen sind jedoch unterschiedlich: Hyperphosphorylierte aggregierte Formen von Tau sind mit kortikaler Atrophie verbunden, die stark mit der kognitiven Leistung bei AD korreliert [2, 3], wohingegen CAA-assoziierte Blutungen und Ischämie zu Gefäßdysfunktionen führen [4]. Dies beschleunigt die kognitive Beeinträchtigung bei AD- und Nicht-AD-Fällen [5,6,7]. Die vaskuläre Aβ-Toxizität erhöht nicht nur das Risiko intrazerebraler Blutungen, sondern beeinträchtigt auch die neurovaskuläre Einheit [8], indem sie Gefäßzellen unempfindlich gegenüber physiologischen Ereignissen macht [9] und die perivaskuläre Drainage beeinträchtigt [10], was allesamt das Fortschreiten der AD verschlimmern kann.

Trotz unterschiedlicher Mechanismen, durch die CAA und AD die Aβ-vermittelte Pathologie verschlimmern, haben CAA und AD einen signifikanten genetischen Risikofaktor gemeinsam, der die Prävalenz und Schwere beider Krankheiten erhöht. Apolipoprotein E (APOE) spielt eine entscheidende Rolle beim Lipidtransport (11), obwohl das ε4-Allel des APOE-Gens sowohl für CAA (5, 12, 13, 14, 15) als auch für AD (16, 17) schädlich ist, indem es pathogen verstärkt Aβ-Aggregation und Beeinträchtigung der Aβ-Clearance [18, 19]. Diese beeinträchtigte Clearance fördert einen sich selbst verstärkenden Zyklus, der zu einer weiteren Ablagerung von Aβ entlang der Gefäße und im Parenchym führt, um AD und CAA zu verschlimmern [10, 20, 21]. Darüber hinaus ist APOE ein Hauptbestandteil sowohl von CAA [22] als auch von Plaques [22,23,24]. APOE ist für die Entwicklung von CAA erforderlich und trägt maßgeblich zur Bildung fibrillärer parenchymaler Plaques bei [25, 26]. APOE4 zeigt auch Aβ-abhängige und -unabhängige Wirkungen [27] auf das Gehirngefäßsystem, indem es den zerebralen Blutfluss verringert [28, 29] und die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​erhöht [30, 31, 32]. Obwohl sicherlich ein Zusammenhang zwischen APOE und CAA bei zerebrovaskulärer Dysfunktion besteht, bleiben die zugrunde liegenden Mechanismen unklar.

Im Zentralnervensystem (ZNS) sind Astrozyten die Hauptproduzenten von APOE, obwohl auch reaktive Mikroglia [33, 34], verletzte Neuronen [35] und bestimmte Gefäßwandzellen [36, 37] APOE erzeugen. APOE4-exprimierende Astrozyten unterliegen mit oder ohne Schädigung durch Krankheiten wie CAA einer umfassenden transkriptionellen, morphologischen und funktionellen Umgestaltung in einen pathologischen Zustand, der durch einen Verlust der physiologischen Funktion gekennzeichnet ist [38,39,40,41,42,43,44, 45,46]. Durch die selektive Löschung von APOE4 aus Astrozyten werden Astrozyten und andere Zellen im ZNS wieder in einen „homöostatischeren“ Zustand versetzt, was in Mausmodellen für Amyloidose [47, 48] und Tauopathie [49] Schutz vor dem Fortschreiten der Krankheit bietet. In beiden Studien, in denen astrozytäres APOE4 entfernt wurde, wurde ein Rückgang der reaktiven Mikroglia festgestellt, was wahrscheinlich mit einem allgemeinen Rückgang der ZNS-Entzündung und folglich einer Förderung der Neuroprotektion verbunden ist. Darüber hinaus wurde auch pathogenes Aβ oder Tau reduziert, obwohl CAA in diesen Modellen in sehr niedrigen bis nicht nachweisbaren Mengen vorlag und daher nicht quantifiziert wurde. In einer anderen Studie reichte die Entfernung von astrozytischem APOE4 bei ansonsten nicht transgenen Mäusen aus, um einen gewissen BHS-Schutz zu gewährleisten [50]. Angesichts der entscheidenden Rolle von Astrozyten unter basalen Bedingungen und der schädlichen Auswirkungen des ε4-Allels von APOE auf CAA und das Gehirngefäßsystem stellten wir die Hypothese auf, dass eine Verringerung der APOE4-Expression in Astrozyten in einem CAA-Mausmodell CAA-abhängige und/oder -unabhängige Gefäße verbessern würde Schaden. Um diese Hypothese anzugehen, verwendeten wir induzierbare transgene Aldh1l1-Cre/ERT2-BAC-Mäuse [51], die mit 5XFAD-Mäusen (Linie 7031) [52] gekreuzt wurden, die menschliches APOE4flox/flox [53] exprimierten, ein Modell mit umfangreicher CAA, um die APOE4-Expression selektiv zu löschen in Astrozyten nach der Verabreichung von Tamoxifen. Zusätzlich zur Feststellung, ob die Entfernung von APOE4 aus Astrozyten das Gehirngefäßsystem schützt, untersuchten wir auch die Beiträge von astrozytischem APOE4 zur CAA-Bildung und -Progression.

Alle durchgeführten Tierstudien folgten den Protokollen des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), die vom Animal Studies Committee der Washington University in St. Louis genehmigt wurden. 5XFAD-Mäuse (Linie Tg7031), ein Geschenk von R. Vassar an der Northwestern University [52], wurden über mehrere Generationen mit APOE4flox/flox-Mäusen gekreuzt [53], um 5XFAD APOE4flox/flox-Mäuse zu erzeugen. Aldh1l1-Cre/ERT2-Mäuse (Jackson Laboratories, Best.-Nr. 031008) wurden über mehrere Generationen hinweg auch mit APOE4flox/flox-Mäusen gekreuzt, um Aldh1l1-Cre/ERT2 APOE4flox/flox-Mäuse zu erzeugen. Um 5XFAD Aldh1l1-Cre/ERT2 APOE4flox/flox-Mäuse zu erzeugen, wurden 5XFAD APOE4flox/flox-Männchen mit Aldh1l1-Cre/ERT2 APOE4flox/flox-Weibchen gekreuzt. Wir bezeichnen Mäuse, die die Gene 5XFAD und Aldh1l1-Cre/ERT2 tragen, als „5X+AL+“ und ihre Wurfgeschwister ohne das Gen Aldh1l1-Cre/ERT2 als „5X+AL-“. Wurfgeschwister ohne das 5XFAD-Transgen werden als „5X-“ Mäuse bezeichnet. Alle Mäuse wurden in einem normalen 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Futter und Wasser gehalten. Es gab keine Geschlechtsunterschiede zwischen Männchen und Weibchen und die Anzahl der verwendeten Mäuse ist den Legenden zu den Figuren zu entnehmen.

Tamoxifen wurde jeden Monat frisch zubereitet, indem es in Maisöl bei 20 mg/ml auf einem Schüttler bei 37 °C für mindestens 12 Stunden aufgelöst wurde. Im Alter von zwei Monaten erhielten alle Mäuse in den Versuchsgruppen an fünf aufeinanderfolgenden Tagen eine tägliche Injektion von Tamoxifen (200 mg/kg, intraperitoneal). Die Behandlung mit Tamoxifen induzierte eine Cre-Kombination, um die Expression von APOE4 in Astrozyten zu reduzieren.

Mäuse wurden zunächst mit Fatal-Plus (200 mg/kg, intraperitoneal) anästhesiert und dann mit gekühlter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 0,3 % Heparin perfundiert. Eine Gehirnhälfte wurde 24 Stunden lang in kaltem 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixiert und dann zur Histologie mit 30 % Saccharose bei 4 °C kryogeschützt. Die andere Hemisphäre wurde in vordere und hintere Kortizes zerlegt und für biochemische und Gentranskriptanalysen schockgefroren.

In 4 % PFA fixierte Hemihirne wurden auf einem Gefrier-Schneidmikrotom (Leica) bei 30 µm koronal geschnitten und bei –20 °C in Kryoschutzmittellösung (0,2 M PBS, 15 % Saccharose, 33 % Ethylenglykol) gelagert.

Die Immunfluoreszenzfärbung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (54). Kurz gesagt, zwei Gehirne Sekten. (180 µm voneinander entfernt) wurden zunächst in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS), die 0,25 % Triton-X100 (TBS-X) enthielt, permeabilisiert und dann mit 3 % Serum in TBS-X blockiert. Hirnschnitte wurden über Nacht in primärem Antikörper, verdünnt in 1 % Serum, in TBS-X bei 4 °C inkubiert. Zu den Primärantikörpern gehören: biotinylierter Antikörper HJ3.4 für menschliches Aβ1–13 (hausintern hergestellt, 2 µg/ml), Kaninchen-Aβ40 (Thermo Fisher, 44.136, 1:500), Kaninchen-Aβ42 (Thermo Fisher, 700.254, 1:500). ), Kaninchen-APOE-Antikörper (Cell Signaling, #13.366, 1:500), biotinyliertes GFAP für Astrozyten (Sigma-Aldrich, MAB3402B, 1:1.000), Kaninchen-Iba1 (Wako, 019–19.741, 1:5.000), Kaninchen-Fibrinogen ( Abcam, ab34269, 1:1000) und Ratten-LAMP1 (Developmental Studies Hybridoma Bank, #1D4B, 1:400). Am folgenden Tag wurden die Schnitte eine Stunde lang mit sekundären Antikörpern (1:1000) gegen die primären Antikörper gefärbt. X34-Farbstoff (Sigma-Aldrich, SML1954, 1:5000) wurde zur Markierung von Amyloid-Plaques und CAA verwendet. Für die X34-Färbung wurden frei schwebende Gehirnschnitte gewaschen (3 x 5 Minuten) und 30 Minuten lang in TBS-X permeabilisiert. Gehirngewebe wurden dann mit X34-Arbeitslösung inkubiert (X34 wurde in einer Verdünnung von 1:5000 zu 40 % Ethanol in TBS-Puffer gegeben, der pH-Wert wurde mit NaOH in einer Verdünnung von 1:500 eingestellt). Nach 20-minütiger Inkubation wurden die Schnitte mit X34-Waschpuffer (40 % Ethanol in TBS, 3 x 2 Min.) entfärbt und dann mit TBS (3 x 5 Min.) gewaschen. Wenn primäre Antikörper verwendet wurden, wurden die Schnitte einem Serumblockierungsschritt wie oben erwähnt unterzogen. Für die Aβ40- und Aβ42-Färbung wurden die Schnitte vor der Färbung zunächst in 88 %iger Ameisensäure inkubiert.

Die Immunfluoreszenzbildgebung an fixierten Hirngewebeschnitten wurde mit 10-facher Vergrößerung auf dem Biotek Cytation 5 Imaging Reader (Abb. 2a, f, 4a, f, 5a (linke Felder), 6a) und 20-facher Vergrößerung mit dem Leica Thunder Imager DMi8 (Abb. 3e, m, S3a, S5a) oder 40X-Ölobjektiv auf dem konfokalen Leica Stellaris 5-Mikroskop mit einer Auflösung von 1024 × 1024 Pixeln (Abb. 4c, h, 5a (rechte Tafeln), S4a). Die Bilder wurden mit der Fiji-Software (ImageJ) 1.52v analysiert. Für die Flächenabdeckung durch Fluoreszenzfärbung wurde für alle Bilder ein einziger Schwellenwert festgelegt, um die prozentuale Flächenabdeckung im Kortex über dem Hippocampus zu bestimmen. CAA und vaskuläres Aβ wurden anhand der Morphologie von parenchymalen Plaques unterschieden. CAA erscheint in diesem Modell als quer verlaufende bandartige Ablagerung von Amyloid auf Strukturen, die morphologisch als pial oder durchdringende Blutgefäße bestimmt wurden. Der Querschnitt von CAA hat ein dünnes, ringförmiges Aussehen, wobei die Mitte hohl ist. Parenchymplaques sind im Allgemeinen kugelförmig und oft kompakt. Um zu bestätigen, dass diese Beurteilung von CAA und Plaques anhand der Morphologie korrekt war, färbten wir 5XFAD APOE4flox/flox-Mäuse gemeinsam auf X34 und CD31 auf Endothelzellen. Wir haben bestätigt, dass es sich bei den von uns identifizierten X34+-CAA-Gefäßen um CD31+-Gefäße handelte, während es sich bei den X34+-Parenchymplaques um CD31− handelte, und bestätigten damit, dass wir CAA-Gefäße mit hoher Sicherheit von Parenchymplaques unterscheiden können. Für die Kolokalisierungsanalyse wurde die Kolokalisierung von APOE mit Mikroglia oder Astrozyten unter Verwendung des integrierten Bildrechners AND-Operator durchgeführt. Der Prozentsatz der Kolokalisierung zwischen den beiden Kanälen (APOE und Mikroglia, APOE und Astrozyten) wurde auf den Plaque- oder CAA-Bereich normalisiert. Die Kolokalisierungsanalyse einzelner CAA-Gefäße wurde hauptsächlich in Gefäßen mit einer Größe von ca. 20 µm durchgeführt. Um die Anzahl der Astrozyten oder Mikroglia rund um CAA oder Plaques zu quantifizieren, wurden Bilder, die nur CAA oder fibrilläre Plaques enthielten, aus kortikalen Regionen aufgenommen, die über dem Hippocampus von n = 8–10 Mäusen pro Gruppe lagen. Die Anzahl der Astrozyten oder Mikroglia, die CAA oder Plaque umgeben, wurde manuell gezählt und auf die CAA- oder Plaquegröße normalisiert. Bilder mit einer gemischten CAA/Plaque-Pathologie, bei der CAA und Plaques gleichzeitig abgelagert waren, wurden nicht verwendet, da CAA- oder Plaque-spezifische Effekte nicht unterschieden werden konnten. Zur Quantifizierung von LAMP1 um Plaques oder CAA herum haben wir die prozentuale Fläche bestimmt, die von LAMP1 um einzelne Plaques oder CAA-Gefäße herum bedeckt ist, und diese Werte auf die prozentuale Fläche normalisiert, die jeweils von X34+-Plaques oder CAA bedeckt ist. Für diese Analyse haben wir sechs CAA-Gefäße oder -Plaques pro Maus bewertet und diese Werte für ein biologisches Replikat gemittelt. Die Bilder wurden blind gegenüber den experimentellen Bedingungen verarbeitet und analysiert.

Die Färbung auf Hämosiderinablagerungen wurde wie zuvor beschrieben mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt [54]. Acht Gehirnschnitte im Abstand von 180 µm wurden 30 Minuten lang in 2 % Kaliumferrocyanid (P3289; Sigma-Aldrich) in 2 % Salzsäure inkubiert. Gehirnschnitte wurden mit dem Nanozoomer 2.0-HT-Objektträgerscanner bei 40-facher Vergrößerung abgebildet. Die Quantifizierung der Größe und Anzahl der Mikroblutungen erfolgte durch manuelles Verfolgen von Hämosiderin + -Ablagerungen mithilfe der NDP.View2-Software. Analysen und Nachverfolgungen wurden von Forschern durchgeführt, die keine Ahnung von der Behandlung hatten.

Die Live-Gefäßbildgebung für die zerebrovaskuläre Funktion wurde wie zuvor beschrieben mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt (54). Um Blutgasproben zu entnehmen, wurde eine Oberschenkelarterie unter Isofluran-Anästhesie (4 % Einleitung, 1,5 % Erhaltungsnarkose) kanüliert (Nova Biomedical, BioProfile pHOx-Analysator). Zur mechanischen Beatmung (Harvard Apparatus, MiniVent Ventilator) wurde eine Tracheotomie durchgeführt, ergänzt durch einen 0,5 %igen Fluss von 100 % O2. Um leptomeningeale Gefäße unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar zu machen, wurde Fluorescein-Dextran (Life Technologies, D1823, 150 µL bei 12,5 mg/ml) retroorbital injiziert. Isofluran ist ein Vasodilatator, daher wurden Mäuse von Isofluran entwöhnt und stattdessen während der Live-Bildgebung mit Pentobarbital (ip, 1,35 ml/kg aus 50 mg/ml Stammlösung für die erste Dosis, 0,70 ml/kg für nachfolgende Dosen) anästhesiert. Als nächstes wurde eine Kraniotomie durchgeführt, indem die Mäuse an einem speziell angefertigten stereotaktischen Gerät befestigt wurden (Instrument Machine Shop an der Washington University School of Medicine) und der rechte Scheitelknochen (4 mm Durchmesser) entfernt wurde. Das Fenster wurde in künstlicher Liquor cerebrospinalis (aCSF, in mM: 125 NaCl, 26 NaHCO3, 1,25 NaH2PO4, 2,5 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2 und 25 mM Glucose) gebadet. CAA auf Pialgefäßen wurde mit X34-Farbstoff markiert. Pialarterien wurden mit dem digitalen Videomikroskopiesystem Nikon Eclipse 600ME (Nikon Instruments Inc.) bei 20 × mit Wasserimmersionslinsen bei 1024 × 1024 Pixeln unter Verwendung der MetaMorph-Bildgebungssoftware Version 7.10.2 (Molecular Devices) abgebildet. Der vaskuläre glatte Muskelzellen-abhängige Vasodilatator S-Nitroso-N-acetylpenicillamin (SNAP; Sigma-Aldrich, N3398, 50 μM) wurde 5 Minuten lang topisch auf das Fenster aufgetragen. Die Bilder wurden mit dem ObjectJ-Software-Plug-in Version 1.04q in Fidschi (ImageJ) analysiert und die Durchmesser von Gefäßsegmenten mit einer Länge von 6–8 ~ 30 µm gemessen. Die Daten wurden als prozentuale vasodilatatorische Veränderung gegenüber dem Ausgangswert berechnet. Gefäßsegmente eines Gefäßes wurden gemittelt und als individuelles biologisches Replikat analysiert. Die Daten wurden aus 9 Gefäßen in 4 Mäusen (5X+AL-) und 6 Gefäßen in 3 Mäusen (5X+AL+) generiert, wobei nicht mehr als zwei Gefäße von einer Maus stammten.

Das Protokoll für die Extraktion von Gewebelysaten und den Nachweis von menschlichem Aβ (55) oder APOE (49) wurde zuvor ausführlich beschrieben. Kortikale Gewebeproben von Mäusen (~ 15 mg) wurden nacheinander mit vorgekühltem PBS und 5 M Guanidinpuffer in Gegenwart von Proteaseinhibitor (Roche, 11.697.498.001) und PhosSTOP-Inhibitor (Roche, 04.906.845.001) homogenisiert. Nach Zugabe von Magnetkügelchen (Next Advance, ZrOB05) und 20 µl PBS/1 mg Gewebe wurde das Gewebe 45 s lang auf einem Kügelchenhomogenisator (Next Advance, Bullet Blender Strom 24) auf Stufe 3 homogenisiert. Anschließend wurden die Homogenate 30 min lang zentrifugiert bei 15.000 U/min bei 4 °C. Der Überstand wurde als salzlösliche PBS-Fraktion gesammelt. Anschließend wurde das gleiche Volumen Guanidinpuffer zum Pellet gegeben und erneut 3 Minuten lang auf Stufe 8 homogenisiert. Die Homogenate wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur rotiert, gefolgt von einer 30-minütigen Zentrifugation bei 15.000 U/min und 4 °C. Schließlich wurde der Überstand als Guanidin-lösliche („unlösliche“) Fraktion gesammelt. Beide Fraktionen wurden bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert. Die Konzentrationen von Aβ40, Aβ42 und APOE in PBS- und 5 M Guanidin-Fraktionen wurden mittels Sandwich-ELISA gemessen und auf das Gewebegewicht normalisiert. Für Aβ40 wurde Anti-Aβ35-40 HJ2 (hausintern) als Fängerantikörper und biotinylierter Anti-Aβ13-18 HJ5.1 (hausintern) als Nachweisantikörper verwendet. Für Aβ42 war Anti-Aβ37-42 HJ7.4 (hausintern, monoklonal von der Maus) der Fängerantikörper und biotinylierter Anti-Aβ13-18 HJ5.1 (hausintern, monoklonal von der Maus) der Nachweisantikörper. Der Beschichtungsantikörper für menschliches APOE war HJ15.3 (hausintern, monoklonal von der Maus) und der Einfangantikörper war HJ15.7-biotinyliert (hausintern, monoklonal von der Maus) [53].

Immunfluoreszierende Schnitte, die X34 und GFAP enthielten, wurden auf dem konfokalen Leica Stellaris 5-Mikroskop (40 × Ölobjektiv, 1024 × 1024 Pixel Auflösung) abgebildet. Für diese Analyse wurden Bilder verwendet, die ausschließlich CAA oder fibrilläre Plaques (keine Mischung aus Plaque/CAA-Pathologie) aus kortikalen Regionen über dem Hippocampus enthielten. Simple Neurite Trace (SNT; ImageJ-Plug-in-Open-Source-Tool) wurde verwendet, um zweidimensionale Dorne von GFAP+-Astrozytenprozessen zu rekonstruieren, um morphologische Messwerte zu generieren, einschließlich Größe (konvexe Hülle), Anzahl der Prozesse, Gesamtsumme der Prozesslänge und Anzahl Anzahl der Prozesspunkte und mittlere Prozesslänge. Vier bis fünf Astrozyten wurden zufällig aus zwei Abschnitten jeder Maus ausgewählt und hatten keine Fortsätze, die eine andere Zelle berührten oder abgeschnitten waren.

RNA wurde mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen) aus gefrorenem vorderem Kortikalisgewebe extrahiert und unter Verwendung des RNA-to-cDNA-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers in cDNA umgewandelt. In Zusammenarbeit mit Genome Technology Access Core an der Washington University wurde die Genexpression mit dem Fluidigm Biomark HD Real-Time PCR System unter Verwendung von Taqman-Primern durchgeführt. Die relative Genexpression wurde auf Actb normalisiert.

Für statistische Analysen wurde GraphPad Prism 9.5.0 verwendet. Wie in den Legenden der Abbildungen angegeben, werden die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) für Gruppengrößen unter 10 dargestellt; andernfalls werden die Daten als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Sofern nicht anders angegeben, waren keine anderen statistischen Vergleiche signifikant. Die statistische Signifikanz zwischen zwei Gruppen wurde mithilfe eines ungepaarten Schüler-T-Tests (zweiseitig) berechnet. Wenn die Daten ungleiche Varianzen aufwiesen, wurde ein t-Test mit Welch-Korrektur verwendet.

Um eine astrozytenspezifische Deletion von APOE4 in einem Mausmodell mit gemischter CAA- und Plaque-Pathologie zu erreichen, haben wir transgene 5XFAD (Linie 7031) APOE4flox/flox-Mäuse entweder mit (5X+AL+) oder ohne (5X+AL-) Aldhl1l-Cre erzeugt /ERT2-Gen [51,52,53]. Eine Cre-vermittelte Rekombination zur Eliminierung der Expression von APOE4 aus Astrozyten wurde durch fünf aufeinanderfolgende Tage intraperitonealer (ip) Tamoxifen-Behandlung bei 2 Monate alten 5X+AL+- oder 5X+AL--Mäusen erreicht, ein Zeitpunkt vor der Plaque-/CAA-Entwicklung (Abb. 1a). Die Behandlung mit Tamoxifen führte bei 10 Monate alten 5X+AL+-Mäusen zu einer starken Reduktion der kortikalen APOE4-mRNA (Abb. 1b) und des Proteins (Abb. 1c, d). Es gab keinen geschlechtsspezifischen Effekt auf die APOE4-mRNA- (Abbildung S1a) und Proteinspiegel (Abbildung S1b, c) vor oder nach der Verabreichung von Tamoxifen.

Die durch Tamoxifen induzierte Cre-Rekombination reduziert sowohl die APOE-mRNA als auch das APOE-Protein. a Schematische Zeitleiste der Tamoxifen-Behandlung (5 tägliche Injektionen mit 200 mg/kg) bei einem 2 Monate alten Kind: 5XFAD (Linie 7031) x APOE4flox/flox (5X+AL-) oder 5XFAD (Linie 7031) x APOE4flox/flox x Aldhl1l- Cre/ERT2 (5X+AL+)-Mäuse, bewertet im Alter von 10 Monaten. b Relative Expression von APOE-mRNA, normalisiert auf Beta-Actin, im Kortex. c, d PBS-lösliche und Guanidin-HCL-lösliche („unlösliche“) APOE-Proteinkonzentrationen, bestimmt durch ELISA aus dem Kortex. Daten ausgedrückt als Mittelwert ± SD, Student-T-Test (zweiseitig), durchgeführt für alle statistischen Analysen mit Ausnahme von (b), wo der Welch-T-Test durchgeführt wurde. ∆ = Männer, ○ = Frauen. ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Sofern nicht anders angegeben, sind keine weiteren statistischen Vergleiche von Bedeutung

Frühere Studien haben gezeigt, dass APOE4 die CAA-Entwicklung erleichtert, wohingegen ein globaler APOE-Mangel bei Mäusen die CAA-Pathologie verhindert [25]. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass die Entfernung von astrozytischem APOE4 sowohl die CAA- als auch die Aβ-Plaque-Belastung bei 10 Monate alten 5X+AL+-Mäusen verringern würde. Tatsächlich stellten wir eine Verringerung der gesamten fibrillären Aβ-Ablagerungen und fibrillären Plaques (Abb. 2a, b, d) sowie der gesamten Aβ-Immunreaktivität (Abb. 2f, g) und Aβ+-Plaques (Abb. 2i) in darüber liegenden kortikalen Regionen fest der Hippocampus. Zu unserer Überraschung führte die Reduzierung von APOE4 aus Astrozyten jedoch zu einem Anstieg des fibrillären Aβ in CAA (Abb. 2c, e). Obwohl sich vaskuläres Aβ meist in fibrillärer Form ablagert, gibt es auch eine Komponente, die Aβ+-immunreaktiv und nicht fibrillär ist. In den Gefäßen wurde eine Aβ+-Färbung festgestellt, die jedoch durch den astrozytären APOE4-Mangel nicht verändert wurde (Abb. 2h). Allerdings nahm der Anteil der Aβ+-Färbung im Gefäßsystem zu (Abb. 2j), was auf eine größere Neigung von Aβ hindeutet, sich in Gefäßen anzusammeln, nachdem APOE4 aus Astrozyten entfernt wurde. Bestimmte Amyloidose-Mausmodelle zeigen einen geschlechtsspezifischen Effekt auf die Aβ-Plaque-Akkumulation, obwohl wir in unserer Studie keinen geschlechtsabhängigen Unterschied in der Abdeckung der kortikalen X34+-Fibrillenlast oder der Aβ+-Immunreaktivität in Gefäßen oder Plaques beobachteten (Abbildung S2). Zusätzlich zur Amyloidbelastung im Kortex haben wir auch die Amyloidpathologie in einer Hirnregion mit dichter Plaque-/CAA-Belastung, dem Subiculum, untersucht (Abbildung S3a). Obwohl sich die gesamte fibrilläre Plaque/CAA-Ablagerung im dorsalen Subiculum nach der Entfernung von astrozytischem APOE4 nicht veränderte (Abbildung S3b), beobachteten wir erneut einen Anstieg der CAA um das Zweifache (Abbildung S3c) und eine zweifache Abnahme der Plaquebedeckung (Abbildung). S3d). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die vollständige embryonale Ablation von APOE aus allen Zelltypen vor dem Fortschreiten der CAA schützt [25], die selektive astrozytische APOE4-Deletion bei erwachsenen Mäusen ab einem Alter von 2 Monaten zu einer verschlimmerten CAA bei 10 Monate alten 5X+-Mäusen führte AL+ Mäuse.

Die Entfernung von astrozytischem APOE4 vor der Amyloidablagerung verschiebt die Aβ-Verteilung von den Plaques zum Gehirngefäßsystem. a–d, X34-Färbung für fibrilläre Plaques/CAA (a) mit prozentualer Flächenabdeckung des gesamten X34 (b), CAA (c) und Amyloid-Plaques (d) im Kortex, der über dem Hippocampus des 10 Monate alten 5X+ liegt AL- oder 5X+AL+-Mäuse nach astrozytischer APOE4-Entfernung im Alter von 2 Monaten. e, Anteil von CAA an der gesamten X34+-Färbung. f–i, Aβ-Immunreaktivität (Aβ-IR) (f) mit prozentualer Flächenabdeckung von Gesamt-Aβ-IR (g), vaskulärem Aβ-IR (h) und Plaques (i) im Kortex, der über dem Hippocampus liegt. j Anteil des vaskulären Aβ am gesamten Aβ-IR. Maßstab: 300 µm. Daten ausgedrückt als Mittelwert ± SD, ungepaarter Schüler-T-Test (zweiseitig), durchgeführt für alle statistischen Analysen mit Ausnahme von (b), wo der Welch-T-Test durchgeführt wurde. ∆ = Männer, ○ = Frauen. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Sofern nicht anders angegeben, sind keine weiteren statistischen Vergleiche von Bedeutung

Der Anstieg der CAA nach der Entfernung von astrozytärem APOE4 veranlasste uns zu der Frage, ob Veränderungen in der Zusammensetzung von Aβ40 gegenüber Aβ42 im Gehirn die Verschiebung der höheren vaskulären Amyloidbelastung erklären könnten. Aβ40 hat eine größere Neigung, sich entlang des Gefäßsystems anzusammeln, obwohl In-vivo- und In-vitro-Studien zeigen, dass Aβ42 für die anfängliche Aussaat der vaskulären Aβ-Ablagerung notwendig ist [21, 56]. Daher kann sich ein Anstieg der CAA in höheren Konzentrationen von Aβ40 widerspiegeln, die sich im Gefäßsystem angesammelt haben. Um diese Hypothese zu klären, führten wir einen Massen-ELISA an kortikalem Gewebe für PBS-lösliches und 5 M Guanidin-HCl-lösliches („unlösliches“) Aβ40 und Aβ42 durch (Abb. 3a – d). Wie erwartet stellten wir eine Verringerung von unlöslichem Aβ42 fest, der Hauptart von Aβ in Plaques (Abb. 3d). Es gab jedoch auch eine Abnahme der Konzentrationen von löslichem Aβ40 (Abb. 3a) und unlöslichem Aβ40-Protein (Abb. 3c) nach der Entfernung von astrozytischem APOE4 trotz erhöhter CAA in der Histologie (Abb. 2c). Eine Einschränkung besteht darin, dass der Massen-ELISA keine Unterscheidung zwischen Aβ40 im Gefäßsystem und Plaque ermöglicht und es möglich ist, dass sich Aβ40 in diesem Mausmodell auch reichlich in Plaques ablagert; Die Senkung des Gesamt-Aβ40-Werts durch ELISA bei Mäusen ohne astrozytäres APOE4 könnte daher stattdessen ein Ausdruck der Plaque-Reduktion sein. Daher haben wir mittels Immunfärbung auch die prozentuale Flächenbedeckung von Aβ40 und Aβ42 gemessen, die entweder auf Plaques oder Gefäßen lokalisiert sind (Abb. 3e – t). Bei Mäusen, denen astrozytisches APOE4 fehlte, kam es zu einer Abnahme des Gesamt-Aβ40 (Abb. 3f) und des Aβ40 in Plaques (Abb. 3h), jedoch nicht des vaskulären Aβ40 (Abb. 3g). Allerdings gab es bei Mäusen mit astrozytischem APOE4 (~ 20 %) eine Verschiebung im Anteil der Aβ40-Ablagerungen in Gefäßen im Vergleich zu denen ohne (~ 60 %), was darauf hindeutet, dass sich Aβ40-Peptide ohne astrozytäres APOE4 in vergleichbaren Mengen in den Gefäßen aggregierten wurden möglicherweise schneller im Gehirnparenchym beseitigt oder abgebaut (Abb. 3i). Dies wird durch unsere ELISA-Daten weiter gestützt, die einen Rückgang des löslichen Aβ40, nicht jedoch des Aβ42 zeigten (Abb. 3a, b), möglicherweise als Folge einer schnelleren Aβ40-Clearance. Wir haben die regionale Ablagerung von Aβ40 weiter analysiert, indem wir seine Abdeckung in leptomeningealen Gefäßen entlang der Gehirnoberfläche im Vergleich zu durchdringenden Gefäßen im Gehirnparenchym bewertet haben. Es gab keine Veränderung in der Pialakkumulation von Aβ40 (Abb. 3j); Es gab jedoch einen zweifachen Anstieg der Aβ40-Ablagerung in den durchdringenden Gefäßen des Gehirnparenchyms (Abb. 3k, P = 0,073; Abb. 3l, P = 0,065). Dies deutet darauf hin, dass nach der Freisetzung von Aβ40 durch Neuronen in das Gehirnparenchym ein Aβ40-Pool vorhanden ist, der nicht mit Plaques aggregiert. Stattdessen können Aβ40-Peptide über die interstitielle Flüssigkeit und den perivaskulären Drainageweg entlang der Parenchymarterien transportiert werden, wo sie sich ansammeln oder über die Pialarterien/CSF austreten. Interessanterweise gibt es keine signifikante Verringerung des gesamten Aβ42 (lösliche oder unlösliche Formen sind histologisch nicht zu unterscheiden; Abb. 3m, n), obwohl wir einen Rückgang der Aβ42-Anreicherung in Plaques feststellen konnten (Abb. 3p). Weitere Analysen zeigten einen fehlenden Unterschied zwischen pialer und durchdringender vaskulärer Aβ42-Akkumulation (Abb. 3r – t), was frühere Erkenntnisse stützte, dass Aβ40 sich bevorzugt um Gefäße herum aggregiert und zu einer stärkeren CAA-Akkumulation bei Mäusen beitragen kann, denen astrozytisches APOE4 fehlt.

Astrozytisches APOE4 reguliert die Verteilung der Aβ40- und Aβ42-Ablagerung in Plaques, Parenchymgefäßen und leptomeningealen Gefäßen. a–d, PBS-lösliche und Guanidin-HCL-lösliche („unlösliche“) Aβ40- und Aβ42-Proteinkonzentrationen, bestimmt durch ELISA aus dem Kortex. e–h Aβ40-Immunreaktivität (IR) (e) mit prozentualer Flächenabdeckung von Gesamt-Aβ40 (f), Gesamt-Gefäß-Aβ40 (g) und Aβ40 in Plaques (h). i Anteil des vaskulären Aβ40 am gesamten Aβ40 IR. j, k Aβ40 IR beschränkt auf Pialgefäße (j) und penetrierende Gefäße (k). (l) Anteil des vaskulären Aβ40 in penetrierenden Gefäßen am gesamten vaskulären Aβ40. m–p, Aβ42-Immunreaktivität (IR) (m) mit prozentualer Flächenabdeckung von Gesamt-Aβ42 (n), Gesamt-Gefäß-Aβ42 (o) und Aβ42 in Plaques (p). q Anteil des vaskulären Aβ42 am gesamten Aβ42 IR. r, s, Aβ42 IR beschränkt auf Pialgefäße (r) und penetrierende Gefäße (s). t Anteil des vaskulären Aβ42 in penetrierenden Gefäßen am gesamten vaskulären Aβ42. Blauer Pfeil = vaskuläres Aβ. Lila Pfeile = Plaketten. Maßstab: 500 µm. Daten ausgedrückt als Mittelwert ± SD, Student-T-Test (zweiseitig), durchgeführt für alle statistischen Analysen mit Ausnahme von (d), wo der Welch-T-Test durchgeführt wurde. ∆ = Männer, ○ = Frauen. *P < 0,05, *P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Sofern nicht anders angegeben, sind keine weiteren statistischen Vergleiche von Bedeutung

Die Cre-vermittelte Rekombination zur Entfernung von astrozytischem APOE4 in unserem Mausmodell reduzierte die gesamten APOE-mRNA- und -Proteinspiegel. Um das Ausmaß der APOE4-Expressionsänderung auf zellulärer Ebene zu beurteilen, untersuchten wir die räumliche Verteilung und Expression von APOE4 in zwei Hauptzelltypen, die ein krankheitsassoziiertes Transkriptionsprofil als Reaktion auf die Aβ-Pathologie hochregulieren [57, 58]: Astrozyten und Mikroglia. Wie erwartet war APOE ohne Cre-Rekombination (5X+AL- Mäuse) größtenteils in GFAP+-Astrozyten und IBA1+-Mikroglia lokalisiert, die CAA oder Plaques umgeben; Es gab jedoch auch eine APOE-Expression in Astrozyten in kortikalen Regionen ohne Amyloidablagerung, jedoch nicht in Mikroglia (Abbildung S4a). Die Deletion von APOE4 aus Astrozyten führte zu einer Gesamtabnahme des APOE4-Proteins in kortikalen Regionen mit oder ohne CAA/Plaque-Pathologie (Abbildung S4a, b). Die Reduktion von APOE betraf ausschließlich GFAP+-Astrozyten (Abbildung S4c) und wurde in IBA1+-Mikroglia nicht beobachtet (Abbildung S4d), was darauf hinweist, dass die APOE4-Expression in Mikroglia nicht verändert war. Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass wir eine starke, für Astrozyten spezifische APOE4-Proteinreduktion erreicht haben.

Um die Auswirkungen der APOE4-Entfernung auf die Aβ-vermittelte Gliose zu bewerten, untersuchten wir als Nächstes das Expressionsmuster von Astrozyten und Mikroglia im Kortex. Die Färbung auf GFAP+-Astrozyten ergab eine allgemeine Verringerung der kortikalen GFAP+-Astrozytenreaktivität ohne astrozytische Expression von APOE4 (Abb. 4a, b). Im dorsalen Subiculum, einem Bereich ohne vollständige Amyloidreduktion (Abbildung S3), gab es ebenfalls keine Veränderung in der GFAP-Flächenabdeckung (Abbildung S5), was zunächst darauf hindeutet, dass Amyloid, unabhängig vom Kompartiment, in dem es sich ablagert, die GFAP+-reaktive Astrozytose vorantreibt. Die Co-Analyse von GFAP+-Astrozyten mit X34+-Amyloid-Plaques oder CAA ergab jedoch, dass es zwar eine starke Reaktion von GFAP+-Astrozyten auf die Umgebung verbleibender Plaques in Astrozyten ohne APOE4 gab, die Reaktivität von GFAP+-Astrozyten bei CAA jedoch geringer war (Abb. 4c–e). Obwohl APOE4 in Astrozyten rund um Plaques und CAA deutlich reduziert war, blieb der prozentuale Anteil der von GFAP+-Astrozyten rund um Plaques bedeckten Fläche unabhängig von der APOE4-Expression erhalten. Dies deutet darauf hin, dass die Astrozytenreaktivität nach der Bildung von Amyloidplaques auf APOE-unabhängige Weise aufrechterhalten werden kann. Darüber hinaus können reaktive GFAP+-Astrozyten eine deutliche morphologische Umgestaltung durchlaufen, sodass Astrozyten in einem eher „homöostatischen“ Zustand stark verzweigte Fortsätze aufweisen können, wohingegen „reaktive“ Astrozyten je nach Beleidigung oder Verletzung stärker zurückgezogene Fortsätze und Hypertrophie aufweisen. Um zwischen Astrozyten mit oder ohne APOE4, die CAA umgeben, und Plaques zu unterscheiden, haben wir die Morphologie von GFAP-reaktiven Astrozyten untersucht. Insgesamt veränderte die Entfernung von APOE4 aus Astrozyten weder die Größe noch die Komplexität ihrer Morphologie (Abbildung S6a–f). Astrozyten, die Plaques im Vergleich zu CAA angreifen, weisen jedoch eine veränderte Morphologie auf: Astrozyten, die Plaques kontaktieren, hatten eine größere Anzahl (Abbildung S6c) und Länge von Fortsätzen (Abbildung S6d), gekennzeichnet durch eine erhöhte Verzweigung (Abbildung S6e). Im Durchschnitt waren diese Prozesse jedoch kürzer (Abbildung S6f), was repräsentativ für zahlreiche zurückgezogene terminale Prozesse ist und impliziert, dass Amyloidplaques subtile Unterschiede hervorrufen können, wie z. B. eine größere Toxizität als CAA für assoziierte Astrozyten. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass nach der Entfernung von astrozytischem APOE4 weniger GFAP+-Astrozyten mit CAA assoziiert waren und dass sie einen morphologischen Zustand annahmen, der möglicherweise weniger reaktiv war als diejenigen, die mit den wenigen verbliebenen Plaques in Kontakt kamen. Weitere, auch funktionelle, Auswertungen sind erforderlich, um die Komplexität dieser Astrozyten rund um Plaques/CAA zu verstehen.

Der Abbau von APOE in Astrozyten verringert bestimmte krankheitsassoziierte Glia-Signaturen. a–e, GFAP+-Astrozytenfärbung (a) und Quantifizierung der Flächenabdeckung (b) im Kortex von 10 Monate alten 5X+AL- oder 5X+AL+-Mäusen. Maßstab: 300 µm. Repräsentative Bilder (c) und Quantifizierung der Anzahl der Astrozyten rund um CAA (d) oder Plaques (e). Maßstab: 20 µm. Jeder Punkt stellt die Anzahl der Astrozyten dar, die eine einzelne CAA oder Plaque umgeben, normalisiert auf diese CAA- oder Plaquefläche von n = 8–10 Mäusen pro Gruppe. f–j, IBA1+-Mikrogliaabdeckung (f) und Quantifizierung der Flächenabdeckung (g) im Kortex über dem Hippocampus. Maßstab: 300 µm. Pro Plaque-Analyse der Anzahl der Mikroglia-Cluster-CAA (h, i) oder Plaques (j). Maßstab: 20 µm. Jeder Punkt stellt die Anzahl der Mikroglia dar, die eine einzelne CAA oder Plaque umgeben, normalisiert auf diese CAA- oder Plaquefläche von n = 8–10 Mäusen pro Gruppe. k, l, Relative mRNA-Expression homöostatischer und krankheitsassoziierter Astrozyten- (k) und Mikroglia-Gene (l). Daten für Clec7a-mRNA (Spalte 10) unterstellt, aber nicht in der statistischen Analyse verwendet. Jede Spalte repräsentiert eine einzelne Maus. Daten ausgedrückt als Mittelwert ± SD, Student-T-Test (zweiseitig), durchgeführt für alle statistischen Analysen außer (d), (e), (k – S100β) und (l – Cst7, Cst3, Itgax, Spp1), wobei Welch's t-Test wurde durchgeführt. ∆ = Männer, ○ = Frauen. *P < 0,05, **P < 0,01. Sofern nicht anders angegeben, sind keine weiteren statistischen Vergleiche von Bedeutung

Angesichts der Tatsache, dass es nach der Entfernung von Astrozyten-APOE4 zu einer insgesamt gedämpften GFAP+-Astrozytenreaktion kam, waren wir daran interessiert, ob der Astrozyten-Mikroglia-Crosstalk beeinflusst wurde. Um diese Frage zu beantworten, haben wir die Mikroglia-Reaktion mit IBA1-Färbung bewertet. Durch Immunhistochemie konnten wir keine Veränderungen der IBA1+-Mikroglia im Kortex oder auf der Ebene pro Plaque/CAA feststellen (Abb. 4f – j). Als wir mittels quantitativer PCR (qPCR) nach spezifischen krankheitsassoziierten Glia-Genen suchten, stellten wir eine Verringerung der reaktiven astrozytischen Genexpression fest, einschließlich in Gfap und C3 (Abb. 4k) im Kortex. Interessanterweise stellten wir auch eine Verringerung der Gene für krankheitsassoziierte Mikroglia (DAM)/mikrogliale neurodegenerative Erkrankungen (MGnD) wie Cst7, Clec7a und Spp1 fest (Abb. 4l), was darauf hindeutet, dass Mikroglia trotz keiner Änderungen einen gedämpften DAM/MGnD-Zustand annahm IBA1+-Mikroglia-Färbung. Zusammenfassend deuten diese Daten darauf hin, dass es trotz der Erhöhung der CAA im Gehirn nach der Entfernung des Astrozyten APOE4 zu einer Verringerung mehrerer krankheitsassoziierter Mikroglia- und Astrozytengene kam. Dies deutet auf einen veränderten Glia-Zustand hin, der möglicherweise auf eine veränderte Aβ-Spezies und Konformation zurückzuführen ist, die möglicherweise eine schützende Wirkung auf das Gehirn und die Gehirngefäße hat und die wir in nachfolgenden Funktionstests bestätigen wollten.

Trotz erhöhter CAA stellten wir fest, dass die Entfernung von astrozytischem APOE4 die krankheitsbedingte Neuroinflammation reduzierte, ein Ergebnis, das dem ZNS einen nachgelagerten Schutz bieten könnte. Um zu beurteilen, ob die APOE4-Reduktion einen Neuroschutz für Plaque- und CAA-assoziierte Nervenprozesse bietet, haben wir die neuritische Dystrophie durch Markierung von LAMP1 bewertet, einem lysosomalen Marker, der in großen, geschwollenen Axonen rund um Amyloid und CAA stark angereichert ist [59, 60]. Im Kortex führte das Fehlen von astrozytischem APOE4 zu einer signifikanten Reduzierung der dystrophischen LAMP1+-Neuriten (Abb. 5a, b). Weitere Analysen ergaben, dass die LAMP1+-Reaktivität um CAA herum abnahm (Abb. 5c), wohingegen die LAMP1-Immunreaktivität um verbleibende parenchymale fibrilläre Plaques herum erhöht war (Abb. 5d), ähnlich wie es bei Amyloid-ablagernden APOE-Knockout-Mäusen beobachtet wurde [61]. ]. Da neuritische Dystrophie im Allgemeinen um Plaques stärker ausgeprägt ist als CAA, war die Gesamtreduktion der neuritischen Dystrophie im Kortex von Mäusen ohne astrozytäres APOE4 wahrscheinlich auf die auffällige Reduktion der gesamten fibrillären Plaques im Parenchym zurückzuführen.

Die Entfernung astrozytischer APOE schützt vor dystrophischen Neuriten. a–d, LAMP1-Färbung für dystrophische Neuriten (a) mit Quantifizierung des Prozentsatzes des gesamten LAMP1 im Kortex (b), prozentuale Flächenabdeckung der LAMP1-Färbung um CAA, normalisiert auf prozentuale Fläche, die von X34+ CAA abgedeckt wird (c), und prozentuale Fläche Abdeckung der LAMP1-Färbung um Plaques, normalisiert auf den Prozentsatz der von X34+-Plaques bedeckten Fläche (d). Maßstab: 200 µm. Lila Pfeilspitzen: LAMP1 um Plaketten. Blaue Pfeilspitzen: LAMP1 um CAA. Daten ausgedrückt als Mittelwert ± SD, Student-T-Test (zweiseitig), durchgeführt für alle statistischen Analysen außer (b) und (c), wo der Welch-T-Test durchgeführt wurde. ∆ = Männer, ○ = Frauen. *P < 0,05, **P < 0,01, ****P < 0,0001. Sofern nicht anders angegeben, sind keine weiteren statistischen Vergleiche von Bedeutung

Eine Störung der zerebrovaskulären Integrität ist ein Kennzeichen der CAA, die zu einer Störung der Blut-Hirn-Schranke und einem Verlust der physiologischen Gefäßfunktion führen kann. Um festzustellen, ob die BHS bei 5X+AL+-Mäusen mit einer höheren CAA-Belastung beeinträchtigt war, färbten wir auf das Vorhandensein von Fibrinogen, einem aus dem Blut stammenden Protein, das normalerweise nicht in das Gehirnparenchym gelangt (Abb. 6a). Überraschenderweise kam es trotz des Anstiegs der CAA zu einer verringerten Fibrinogen-Extravasation nach der Entfernung des Astrozyten APOE4 (Abb. 6b). Wir untersuchten auch, ob erhöhtes CAA die CAA-induzierten Mikroblutungen erhöhte, fanden jedoch keine Unterschiede in der Anzahl der Mikroblutungen zwischen den Gruppen (P = 0,07; Abb. 6c, d). Die Verringerung des Fibrinogens bei Kontrollmäusen veranlasste uns zu testen, ob CAA-beladene Gefäße auch eine verbesserte Gefäßfunktion aufweisen. Durch die CAA-Ablagerung in der Schicht der glatten Muskelzellen (SMC) reagieren die Arteriolen weniger auf Moleküle, die die Gefäßerweiterung stimulieren. Bei lebenden, wachen Mäusen haben wir einen SMC-Vasodilatator (S-Nitroso-N-acetylpenicillamin, SNAP) topisch infundiert, der zur Stickoxidproduktion führt, und die vasodilatatorische Reaktion in CAA-haltigen leptomeningealen Gefäßen auf der Oberfläche des Gehirns gemessen (Abb. 6e). ). Im Vergleich zu 5XFAD-Mäusen, die APOE4 exprimierten, stellten wir fest, dass SNAP bei 5XFAD-Mäusen nach Entfernung des Astrozyten APOE4 zu einer signifikant erhöhten Vasodilatation führte (Abb. 6f). Die Entfernung von Astrozyten bot daher Schutz für die BHS und förderte die Vasoreaktivität in SMCs. Zusammenfassend deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass das Fehlen von APOE4 in Astrozyten zu mehr CAA, aber weniger parenchymalen Plaques führte, was die Aβ-assoziierte Gliose reduzierte und die zerebrovaskuläre Funktion verbesserte.

Die Gefäßdegeneration wird trotz erhöhter CAA gebessert. a, b Färbung für das aus dem Blut stammende Protein Fibrinogen (a) mit Quantifizierung der prozentualen bedeckten Fläche (b) im Kortex von 10 Monate alten 5X+AL- oder 5X+AL+-Mäusen. Gelber Pfeil: Fibrinogen-Färbung. Maßstab: 100 µm. c, d, Durchschnittliche Anzahl (c) und Größe (d) der Mikroblutungen mittels Berliner Blau-Färbung. e, f, In-vivo-Bewertung der leptomeningealen Funktion, gemessen anhand der prozentualen vasodilatatorischen Veränderung gegenüber dem Ausgangswert nach topischer Anwendung des vaskulären glatten Muskelzell-abhängigen Moleküls (SNAP). Lila Pfeilspitzen: Erhöhte Dilatation. Blaue Pfeilspitzen: Keine Änderung der Dilatation. Daten von 9 Gefäßen in 4 Mäusen (5X+AL-) und 6 Gefäßen in 3 Mäusen (5X+AL+). Maßstab: 15 µm. SNAP = S-Nitroso-N-acetylpenicillamin. Daten ausgedrückt als Mittelwert ± SD, Student-T-Test (zweiseitig), durchgeführt für alle statistischen Analysen außer (c) und (d), wo der Welch-T-Test durchgeführt wurde. ∆ = Männer, ○ = Frauen. *P < 0,05, ***P < 0,001. Sofern nicht anders angegeben, sind keine weiteren statistischen Vergleiche von Bedeutung

Das ε4-Allel von APOE beeinflusst stark das Risiko für AD und CAA. APOE4 beeinträchtigt und/oder konkurriert mit Aβ um die Clearance und beschleunigt zusätzlich die Aβ-Aussaat und Fibrillogenese, was möglicherweise zu einem früheren Auftreten der Aβ-Pathologie bei APOE4-Trägern mit AD führt. In ähnlicher Weise kommt es bei APOE4-Trägern mit CAA zu einer beschleunigten Prävalenz und einem erhöhten Schweregrad von CAA [5, 12], mit dem zusätzlichen Risiko eines früheren Blutungsbeginns [13]. Die zugrunde liegenden Mechanismen der APOE4-Beiträge zur CAA sind nicht klar. Kürzlich hat unser Labor gezeigt, dass die Entfernung von APOE4, das von Astrozyten abgesondert wird, ausreicht, um die Belastung durch parenchymale Aβ-Plaques [48] sowie die Tau-vermittelte Neurodegeneration [49] durch potenzielle Veränderung des Astrozyten-Mikroglia-Crosstalks stark zu reduzieren. Unser Ziel in dieser aktuellen Studie war es, die Beiträge von astrozytischem APOE4 zu CAA und CAA-assoziierter Gefäßdysfunktion zu untersuchen.

Unsere Gruppe hat zuvor gezeigt, dass die genetische Ablation von murinem APOE ausreicht, um die Entwicklung von CAA bei Aβ-ablagernden Mäusen zu verhindern [25]. Allerdings ist die vollständige genetische Ablation von APOE im gesamten Körper möglicherweise kein praktikabler therapeutischer Ansatz, da sowohl periphere als auch aus dem Gehirn stammende APOE eine entscheidende Rolle im Lipidstoffwechsel spielen. Daher fragten wir, ob die selektive Entfernung von APOE aus Astrozyten, den Hauptproduzenten von APOE im Gehirn, ausreicht, um CAA und CAA-bedingte Gefäßschäden zu reduzieren. Wir stellten die Hypothese auf, dass eine Senkung des Gesamt-APOE4-Spiegels durch Entfernung von astrozytischem APOE4 (ca. 75 % Reduzierung des Gesamt-APOE4) sowohl die Aβ-Plaque- als auch die CAA-Belastung in einem Mausmodell mit gemischter CAA/Plaque-Ablagerung (5X+AL+) verringern würde. Tatsächlich waren Aβ und Amyloid-Plaques bei 5X+AL+-Mäusen reduziert. Interessanterweise kam es jedoch gleichzeitig zu einem Anstieg der CAA, sodass sich die Aβ-Ablagerung in parenchymalen Plaques von etwa 50 % auf etwa 20 % und in CAA von etwa 50 % auf etwa 80 % verschob. Ähnlich wie bei früheren Erkenntnissen weisen die verbleibenden parenchymalen Amyloidplaques bei Mäusen ohne astrozytäres APOE4 eine eher verteilte statt dichte Kernmorphologie auf [48]. Zu unserer Überraschung führte der in Abwesenheit von astrozytischem APOE4 festgestellte Anstieg der CAA jedoch nicht zu einer Verschärfung der CAA-assoziierten Schädigung, sondern förderte vielmehr eine verbesserte Gefäßfunktion. Im Folgenden diskutieren wir (1) mögliche Erklärungen für die Verlagerung von Aβ vom Gehirnparenchym zum Gehirngefäßsystem, (2) die schützende Wirkung der APOE-Entfernung auf das Gehirngefäßsystem trotz erhöhter vaskulärer Aβ und (3) die Auswirkungen unserer Erkenntnisse auf APOE- basierte Therapeutika.

Im Gehirn kann APOE als „Samen“ für die Selbstorganisation fungieren [62] oder Aβ direkt für die Fibrillenbildung binden [63,64,65,66,67]. Tatsächlich haben transgene Mäuse, die Aβ-Plaques ablagern, in Abwesenheit von APOE eine erhöhte Clearance von löslichem Aβ [68], was darauf hindeutet, dass entweder APOE mit Aβ um die Clearance konkurriert und/oder Aβ im Gehirn zurückhält, um die Clearance zu reduzieren. Aβ wird aus dem Gehirn über den perivaskulären Weg [10], BHS-Transzytose [69], zelluläre Aufnahme [70] und/oder den Massenfluss von interstitieller Flüssigkeit/Zerebrospinalflüssigkeit (ISF/CSF) [71] entfernt. APOE ist notwendig, um Aβ in die Fibrillen des Gefäßsystems einzusäen und so für die Entwicklung von CAA zu sorgen [25]. In unserer Studie haben wir die Gesamtproteinkonzentration von APOE4 im Gehirn um ~ 75 % reduziert. Das verbleibende APOE4 stammt aus krankheitsassoziierten Mikroglia, perivaskulären Makrophagen, Endothelzellen, Perizyten, perivaskulären Fibroblasten oder Zellen der glatten Muskulatur [72] und trug wahrscheinlich zur CAA-Entwicklung bei. Obwohl die Beiträge von APOE aus verschiedenen Zelltypen zur Aβ-Fibrillenbildung unbekannt sind, deuten die aktuellen Daten darauf hin, dass von Mikroglia abgesonderte APOE-Partikel kleiner (und daher weniger lipidiert) sind als die von Astrozyten [53]. Wir kennen derzeit nicht die molekularen Eigenschaften von APOE, die von vaskulären Wandzellen sezerniert werden, und ihren genauen Beitrag zur CAA, obwohl APOE4-Perizyten möglicherweise eine wichtige Rolle beim Fortschreiten der Krankheit spielen [37]. Ungeachtet dessen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass APOE aus verschiedenen zellulären Quellen ein unterschiedliches Aβ-Seeding-Potenzial haben könnten. Interessanterweise haben andere Studien an gentechnisch veränderten Mäusen gezeigt, dass die Änderung der Mikrogliafunktion in einen weniger phagozytischen Zustand [73] oder der Abbau der Mikroglia entweder pharmakologisch [74] oder genetisch [75] – was alles wahrscheinlich die von Mikroglia sezernierte APOE verringert – die Menge an erhöht CAA. Inwieweit APOE verändert ist, wurde nicht bestimmt, obwohl eine Studie in einem Mausmodell der Tauopathie einen Kompensationsmechanismus entdeckte, bei dem es nach der pharmakologischen Ablation von Mikroglia zu einem erhöhten APOE-Protein in Astrozyten und Neuronen kam [76]. Darüber hinaus führte der Verlust von Clusterin (APOJ), einem weiteren stark exprimierten Apolipoprotein im Gehirn, das sich in parenchymalen Plaques und CAA ablagert [77], zu einer erhöhten CAA-Ablagerung [78]. Es ist möglich, dass unabhängig von der zellulären Quelle von APOE eine unvoreingenommene Reduzierung von ZNS-APOE zu einer geringeren Aggregation von Aβ und damit zu einer geringeren Retention von Aβ im Gehirnparenchym führen kann. Lösliches Aβ, das im Gehirn produziert und in das Gehirn-ISF freigesetzt wird, wird teilweise über den perivaskulären Weg ausgeschieden, eine wahrscheinliche Quelle für Aβ, das sich als CAA ablagert. Laut einer verwandten Studie hatte die Entfernung von APOE aus Astrozyten keinen Einfluss auf die APP-Spaltung und -Produktion [48], was darauf hindeutet, dass die Verschiebung der Aβ-Lokalisierung nicht auf eine veränderte Aβ-Produktion zurückzuführen ist. Obwohl wir einen zweifachen Anstieg von Aβ40 in penetrierenden Gefäßen festgestellt haben, ist nicht bekannt, ob dies auf eine erhöhte perivaskuläre Clearance zurückzuführen ist. Daher wäre es von zukünftigem Interesse zu bestimmen, ob die ISF- und perivaskuläre Aβ-Clearance in diesen Mausmodellen, einschließlich unseres, mit Verlust von astrozytischem APOE4 verändert ist. Zukünftige Experimente, bei denen APOE4 selektiv aus verschiedenen ZNS-Zelltypen entfernt wird, könnten wertvolle Einblicke in die Rolle von zellspezifischem APOE bei der Plaque-/CAA-Pathogenese liefern.

In unserer aktuellen Studie war unser vielleicht überraschendstes Ergebnis, dass die Entfernung von astrozytischem APOE4 zu einer erhöhten CAA führte, aber das Gehirngefäßsystem schützte. Astrozyten haben wichtige Grundfunktionen, darunter die Bereitstellung neurotropher Unterstützung, die Regulierung der Ionenhomöostase und die Schaffung einer physischen Barriere gegenüber dem perivaskulären Raum [79, 80]. Entlang des Gehirngefäßsystems besetzen perivaskuläre Astrozytenendfüße eine Barriere, die den Fluss selektiver Moleküle ermöglicht [80]. Unter pathologischen Bedingungen wie CAA oder bei einer entzündlichen Belastung [81] können homöostatische perivaskuläre Astrozyten jedoch einen neurotoxischen Phänotyp annehmen [42] und möglicherweise eine abweichende Grundfunktion aufweisen, z. B. die Unfähigkeit, Wasserkanäle (Aquaporin 4) zu regulieren, die für den Transport gelöster Stoffe wichtig sind [46, 82]. Unter pathologischen Bedingungen wird APOE in Astrozyten hochreguliert, die als krankheitsassoziierte Astrozyten (DAA) bezeichnet werden [41]. Die Entfernung von APOE4 aus einem Mausmodell für Amyloidose verringert die GFAP-Reaktivität bei männlichen Mäusen [48], während die Einzelkern-RNA-Sequenzierung in einem Mausmodell für Tauopathie gezeigt hat, dass zahlreiche DAA-Gene wie Clu und Vim reduziert sind [49]. In unserer Studie haben wir auch eine Reduktion ausgewählter DAA-Gene, einschließlich C3 und Gfap, festgestellt, was darauf hindeutet, dass die Entfernung von APOE4 pathologische Astrozyten in einen homöostatischeren Zustand zurückversetzen könnte, der in gewisser Weise Schutz und Unterstützung für das Gehirngefäßsystem ermöglicht. Aus unserer morphologischen Analyse der Astrozyten ergaben sich bei Mäusen mit oder ohne astrozytären APOE4-Depletion keine offensichtlichen Veränderungen, die auf den Zustand dieser Astrozyten hinweisen würden; Allerdings reagieren GFAP+-Astrozyten offenbar anders auf Plaques als auf CAA. Weitere Studien, die sich auf BHS-assoziierte Astrozyten konzentrieren, sind erforderlich, um ihre Rolle im Krankheitskontext zu verstehen und um festzustellen, ob dieser Zustand vorübergehend und/oder reversibel ist.

Die APOE-Therapie ist ein aktuelles Thema von Interesse als neuartige Strategie zur Bekämpfung mehrerer neurodegenerativer Erkrankungen, einschließlich AD und CAA. Mehrere Strategien, darunter APOE-Immuntherapie [54, 55, 83], Antisense-Oligonukleotide [84] und APOE-mimetische Peptide [85, 86], haben sich als präklinisch vielversprechend für die Behandlung von Amyloidose ohne offensichtliche Nebenwirkungen auf das Gehirngefäßsystem oder periphere Lipide erwiesen Homöostase. Die meisten dieser Studien wurden jedoch nicht an Mäusen mit CAA durchgeführt, einem neuropathologischen Merkmal, das bei praktisch allen AD-Patienten festgestellt wurde. Diese aktuelle Studie ergab, dass in einem Mausmodell mit gemischter CAA/Plaque-Pathologie die Entfernung einer Hauptquelle von APOE, die von Astrozyten produziert wird, die CAA erhöhte, aber Schutz bot, indem sie die neuritische Dystrophie reduzierte und CAA-induzierte Gefäßschäden linderte. Sowohl APOE4 als auch CAA werden mit der Verschlimmerung von Schäden im AD-Gehirn in Verbindung gebracht [4]. Zukünftige Studien zur Untersuchung von APOE sollten die Verwendung und Analyse von CAA zusätzlich zu Aβ-Plaques einbeziehen, um die menschliche Aβ-Pathologie genauer zu modellieren. Kürzlich hat unsere Gruppe einen Antikörper entwickelt, der selektiv auf eine Form von nicht lipidiertem APOE4 abzielt, das nur in Amyloid-Plaques und CAA vorkommt [54], und hat seine Wirkung direkt mit einem auf Aβ gerichteten Antikörper verglichen. Als der auf Aβ gerichtete Antikörper 5XFAD/APOE4-Mäusen verabreicht wurde, die CAA und Plaques entwickeln, verringerte er die CAA nicht und führte zu einem Anstieg der GFAP+-Astrozyten, die CAA auskleiden, was stark mit Mikroblutungen korrelierte, einer schwerwiegenden Nebenwirkung als Reaktion auf bestimmte Aβ-Immuntherapien [54]. Im Gegensatz dazu verringerte der Anti-APOE-Antikörper die CAA, verbesserte die Gefäßfunktion und führte nicht zu einem Anstieg der Mikroblutungen oder der GFAP+-Astrozyten, die die CAA auskleiden [54]. In Anbetracht unserer aktuellen Erkenntnisse wäre es für die aktuellen Herausforderungen der Aβ-Immuntherapie besonders relevant zu bestimmen, ob eine genetische oder pharmakologische Veränderung dieser GFAP+-Astrozyten einen neuro-/vaskulären Schutz bieten und die durch Aβ-Antikörper vermittelten vaskulären Nebenwirkungen abschwächen würde. Angesichts der Tatsache, dass vaskuläre Nebenwirkungen (amyloidbedingte Bildanomalien, ARIA) einen großen Rückschlag für viele auf Aβ gerichtete Antikörper darstellen, ist dies eine entscheidende Frage, die gelöst werden muss.

APOE4 und CAA sind beide Hauptrisikofaktoren für Gefäßdysfunktionen [87] durch gemeinsame und unterschiedliche Mechanismen. Unsere Studie hat ergeben, dass die Abschwächung der APOE4-Pathologie durch Reduzierung der astrozytischen APOE4-Produktion ausreicht, um Schutz vor CAA-assoziierten Gefäßschäden zu bieten, einschließlich der Verbesserung der BHS-Leckage und der Verbesserung der Vasoreaktivität. Durch die Entfernung von APOE4 können Astrozyten, einschließlich CAA-assoziierter Astrozyten, von einem pathologischen in einen physiologischen Zustand zurückgeführt werden, der neuro- und gefäßschützend ist. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Einsatz von APOE-Targeting-Strategien zur Behandlung von CAA und AD ein therapeutisches Potenzial bietet. Es sind jedoch weitere Folgestudien erforderlich, um die komplexe Beziehung zwischen zellspezifischen APOE-Beiträgen zur CAA-Entwicklung und der Gefäßfunktion zu entkoppeln.

Generierte Datensätze, die für Analysen in dieser Studie verwendet werden, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

5 Familiäre AD-Mutationen

Amyloid-β

Alzheimer

Amyloid-Vorläuferprotein

Apolipoprotein E

Apolipoprotein J

Amyloidbedingte Bildanomalien

Zerebrale Amyloidangiopathie

Zentrales Nervensystem

Liquor cerebrospinalis

Krankheitsassoziierte Astrozyten

Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Gliafaseriges saures Protein

Ionisiertes Calcium-bindendes Adaptermolekül 1

Interstitielle Flüssigkeit

Intraperitoneal

Lysosomal-assoziiertes Membranprotein 1

Quantitative Polymerase-Kettenreaktion

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Tris-gepufferte Kochsalzlösung

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Referenzen herunterladen

Wir danken R. Vassar für die Schenkung von 5XFAD-Mäusen (Linie 7031), dem Animal Surgery Core am Hope Center for Neurological Disorders für Beratungen zu Mausoperationen, M. Miracle für Skripte, J. Jankowsky für das Aβ40-Immunfluoreszenzprotokoll und D. Seo für Beratungen zur morphologischen Analyse von Astrozyten und das Genome Technology Access Center in der Abteilung für Genetik der Washington University School of Medicine für Genomanalysen.

Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse AG062027 (MX), RF1NS090934 (DMH), RF1AG047644 (DMH), R01 NS034467 (DMH), P01 AG078106 (DMH), die BrightFocus-Stiftung A2018128F (CW) und A2020257F (MG) sowie den Cure Alzheimer's Fund unterstützt (DMH) und die JPB Foundation (DMH). Die mit dem digitalen Pathologiesystem Hamamatsu NanoZoomer gescannten Bilder wurden mit freundlicher Genehmigung des Hope Center Alafi Neuroimaging Laboratory zur Verfügung gestellt.

Monica Xiong, Chao Wang und Maud Gratuze trugen gleichermaßen bei.

Abteilung für Neurologie, Hope Center for Neurological Disorders, Knight Alzheimer's Disease Research Center, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, 63110, USA

Monica Xiong, Maud Gratuze, Fareeha Saadi, Xin Bao, Megan E. Bosch, Choonghee Lee, Hong Jiang, Javier Remolina Serrano, Ernesto R. Gonzales, Michal Kipnis und David M. Holtzman

Abteilung für Biologie und biomedizinische Wissenschaften (DBBS), Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, 63110, USA

Monica Xiong

Aktuelle Adresse: Genentech, 1 DNA Way, South San Francisco, CA, 94080, USA

Monica Xiong

Institut für Hirnforschung und Krankheiten, Medizinische Universität Chongqing, Chongqing, 400016, China

Chao Wang

Aktuelle Adresse: Institut für Neurophysiopathologie (INP UMR7051), CNRS, Aix-Marseille Université, Marseille, 13005, Frankreich

Maud Gratuze

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MX und DMH haben die Studie konzipiert und gestaltet. MX, CW, MG und DMH analysierten die Daten. MX, CW und MG führten die meisten Experimente durch, unterstützt von XB, FS, MEB, HJ, JRS, CL, und MKCW, MX, XB und JRS führten die Tamoxifen-Injektionen durch. FS führte die morphologische Analyse der Astrozyten durch. MX und ERG führten die Gefäßfunktionsstudie durch. MX und DMH haben das Manuskript unter Mitwirkung aller Mitautoren geschrieben. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit David M. Holtzman.

Unzutreffend.

Unzutreffend.

MX ist Mitarbeiter von Genentech. DMH ist als Erfinder eines von der Washington University an NextCure lizenzierten Patents für den therapeutischen Einsatz von Anti-APOE-Antikörpern beteiligt. DMH ist Mitbegründer und Mitglied des wissenschaftlichen Beirats von C2N Diagnostics. DMH ist Mitglied des wissenschaftlichen Beirats von Denali, Genentech und Cajal Neuroscience und berät Alector. Alle anderen Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen zur Offenlegung haben.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Keine Geschlechtsunterschiede in der APOE4-mRNA-Expression und den Proteinkonzentrationen bei Mäusen mit oder ohne Cre-Expression. a: Relative Expression von APOE-mRNA, normalisiert auf Beta-Actin, im Kortex. b, c, PBS-lösliche und Guanidin-HCL-lösliche („unlösliche“) APOE-Proteinkonzentrationen, bestimmt durch ELISA aus dem Kortex. Daten ausgedrückt als Mittelwert ± SD, Zwei-Wege-ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest, der für alle statistischen Analysen durchgeführt wurde. Sofern nicht anders angegeben, sind keine statistischen Vergleiche von Bedeutung.

Keine Geschlechtsunterschiede in der Amyloid- oder Aβ-Pathologie bei Mäusen mit oder ohne Cre-Expression. a–c, X34-Färbung für fibrilläre Plaques/CAA mit prozentualer Flächenabdeckung der gesamten X34 (a), CAA (b) und Amyloid-Plaques (c) im Kortex, der über dem Hippocampus von 10 Monate alten 5X+AL- oder liegt 5X+AL+-Mäuse nach astrozytischer APOE4-Entfernung im Alter von 2 Monaten. d–f, Aβ-Immunreaktivität (Aβ-IR) mit prozentualer Flächenabdeckung von Gesamt-Aβ-IR (d), vaskulärem Aβ-IR (e) und Plaques (f) im Kortex über dem Hippocampus. Daten ausgedrückt als Mittelwert ± SD, Zwei-Wege-ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest, der für alle statistischen Analysen durchgeführt wurde. Sofern nicht anders angegeben, sind keine statistischen Vergleiche von Bedeutung.

Erhöhte CAA und Reduzierung der Amyloidplaques im Subiculum, jedoch keine Veränderung des Gesamtamyloids. a–d, X34-Färbung für fibrilläre Plaques/CAA (a) mit prozentualer Flächenabdeckung des gesamten X34 (b), CAA (c) und Amyloid-Plaques (d) im dorsalen Subiculum von 10 Monate alten 5X+AL- oder 5X+AL+-Mäuse nach astrozytischer APOE4-Entfernung im Alter von 2 Monaten. e, Anteil von CAA an der gesamten X34+-Färbung. Maßstab: 300 µm. ∆ = Männer, ○ = Frauen. Daten ausgedrückt als Mittelwert ± SD, Student-T-Test (zweiseitig), durchgeführt für alle statistischen Analysen mit Ausnahme von (b), wo der Welch-T-Test durchgeführt wurde. **P < 0,01, ***P < 0,001. Sofern nicht anders angegeben, sind keine weiteren statistischen Vergleiche von Bedeutung.

Tamoxifen-induzierte Reduktion von astrozytischem APOE4 in kortikalen Regionen mit und ohne CAA/Plaques. a, Repräsentative Bilder von X34 für Amyloid-Plaques/CAA, APOE, GFAP+-Astrozyten und IBA1+-Mikroglia. Pfeilspitze: APOE im Astrozyten. Pfeil: APOE in Mikroglia. Maßstab: 50 µm. b, Prozentsatz der APOE-Abdeckung in kortikalen Regionen mit CAA, Plaques oder ohne CAA/Plaques. c, d, Verhältnis von APOE in GFAP+-Astrozyten (c) oder IBA1+-Mikroglia-Flächenabdeckung (d), normalisiert auf CAA/Plaque-Belastung. ∆ = Männer, ○ = Frauen. Daten ausgedrückt als Mittelwert ± SEM, Student-T-Test (zweiseitig), durchgeführt für alle statistischen Analysen außer (b – keine Plaques, CAA, Plaques), (c – keine Plaques, CAA, Plaques) und (d – keine Plaques). , CAA), wo der Welch-t-Test durchgeführt wurde. *P < 0,05, **P < 0,01. Sofern nicht anders angegeben, sind keine weiteren statistischen Vergleiche von Bedeutung.

Keine Veränderung der GFAP+-Astrozytenbedeckung im Subiculum. a, b, GFAP-Färbung für Astrozyten (a) mit prozentualer Flächenabdeckung der gesamten GFAP-Immunreaktivität (b) im dorsalen Subiculum von 10 Monate alten 5X+AL- oder 5X+AL+-Mäusen nach astrozytischer APOE4-Entfernung nach 2 Monaten -volljährig. Maßstab: 300 µm. ∆ = Männer, ○ = Frauen. Daten ausgedrückt als Mittelwert ± SD, Student-T-Test (zweiseitig), durchgeführt für alle statistischen Analysen. Sofern nicht anders angegeben, sind keine statistischen Vergleiche von Bedeutung.

Charakterisierung morphologischer Reaktionen von GFAP+-Astrozyten auf CAA oder Plaques. a: Repräsentative Rekonstruktion von GFAP+-Astrozyten um CAA- oder Amyloid-Plaques mit Simple Neurite Tracer. b–f, Morphologische Analysen der GFAP + Astrozytengröße (Convex-Hull-Analyse) (b), Anzahl der Prozesse (c), Gesamtlänge der Prozesse (d), Anzahl der Verzweigungspunkte (e) und mittlere Prozesslänge (f). Maßstab: 50 µm. ∆ = Männer, ○ = Frauen. Daten ausgedrückt als Mittelwert ± SD, Zwei-Wege-ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest, der für alle statistischen Analysen durchgeführt wurde. *P < 0,05, **P < 0,01. ***P < 0,001. Sofern nicht anders angegeben, sind keine weiteren statistischen Vergleiche von Bedeutung.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Xiong, M., Wang, C., Gratuze, M. et al. Die Entfernung von astrozytärem APOE4 bietet zerebrovaskulären Schutz trotz erhöhter zerebraler Amyloidangiopathie. Mol Neurodegeneration 18, 17 (2023). https://doi.org/10.1186/s13024-023-00610-x

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Eingegangen: 01. September 2022

Angenommen: 02. März 2023

Veröffentlicht: 16. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13024-023-00610-x

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