Die Reassortierung des Influenza-A-Virus bei Säugetieren führt zu genetisch unterschiedlichen Influenza-A-Viren

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 6846 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Der genetische Austausch des Influenza-A-Virus (IAV) durch Reassortierung hat das Potenzial, die Virusentwicklung zu beschleunigen und hat eine entscheidende Rolle bei der Entstehung mehrerer Pandemiestämme gespielt. Damit eine Neuordnung stattfinden kann, müssen unterschiedliche Viren dieselbe Zelle gemeinsam infizieren. Die räumlich-zeitliche Dynamik der Virusverbreitung innerhalb eines infizierten Wirts definiert daher die Möglichkeit einer Neuordnung. Hier verwendeten wir Wildtyp- und synonym mit Barcode versehene Variantenviren eines pandemischen H1N1-Stamms, um die Virusdynamik innerhalb des Wirts zu untersuchen, die die Neuordnung bei Meerschweinchen, Frettchen und Schweinen steuert. Die ersten beiden Arten sind etablierte Modelle der menschlichen Influenza, während Schweine ein natürlicher Wirt und ein häufiger Überträger für die Übertragung und Neusortierung zwischen den Arten sind. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Reassortierung bei allen drei Wirten weit verbreitet ist, bei Schweinen jedoch weniger häufig vorkommt als bei Frettchen und Meerschweinchen. Bei Frettchen sind auch gewebespezifische Unterschiede in der Möglichkeit zur Reassortierung erkennbar, wobei im Nasentrakt mehr Reassortanten festgestellt werden als im unteren Atemtrakt. Während zeitliche Trends in der viralen Diversität begrenzt sind, sind räumliche Muster klar, wobei die Heterogenität der viralen Genotypen, die an verschiedenen anatomischen Stellen festgestellt wurden, eine umfassende Kompartimentierung der Neuzusammenstellung und Replikation erkennen lässt. Unsere Daten deuten darauf hin, dass die Dynamik der Virusreplikation bei Säugetieren eine Diversifizierung durch Neusortierung ermöglicht, die räumliche Kompartimentierung von Varianten jedoch wahrscheinlich ihre Entwicklung und Weitergabe beeinflusst.

Influenza-A-Viren (IAVs) haben ein breites Wirtsspektrum, wobei die größte Vielfalt an Wildvogelarten und etablierten Abstammungslinien in Geflügel, Schweinen, Menschen und anderen Säugetierwirten zirkulieren1,2. Das Wirtsspektrum einer bestimmten Abstammungslinie wird durch Artenbarrieren für Infektionen eingeschränkt, aber gelegentliche Spillover-Ereignisse können zu einer anhaltenden Übertragung führen und neue Abstammungslinien hervorbringen3,4. Die Etablierung neuartiger IAVs beim Menschen ist die Quelle von Grippepandemien und hat erhebliche Auswirkungen auf die öffentliche Gesundheit und die Wirtschaft5,6. Die Neuzusammenstellung von Gensegmenten zwischen IAVs, die an verschiedene Wirtsspezies angepasst sind, kann zur Entstehung chimärer Viren mit erhöhtem Potenzial für die Übertragung zwischen Spezies führen7. Prominente Beispiele sind die reassortierenden Stämme, die zu den Grippepandemien von 1957, 1968 und 2009 führten8,9.

Unter den nichtmenschlichen Säugetierarten sind Schweine von besonderem Interesse. Die Übertragung von IAV zwischen Schweinen und Menschen ist relativ häufig, was nicht nur auf eine ausgedehnte Schnittstelle in landwirtschaftlichen Umgebungen zurückzuführen ist, sondern auch auf Ähnlichkeiten zwischen Schweinen und Menschen bei den Wirtsfaktoren, die die Virusreplikation unterstützen10,11. Schweinewirte sind auch etwas anfällig für eine Infektion mit Vogel-IAV, wodurch die Möglichkeit einer Koinfektion und Neusortierung von Viren entsteht, die typischerweise durch Wirtsspeziesbarrieren getrennt sind12. Aus diesem Grund werden Schweine oft als Mischgefäße für die IAV-Umsortierung bezeichnet13,14. Die Rolle des Schweins bei der Influenzapandemie 20099 und die umfangreiche Neuordnung, die IAV bei Schweinen charakterisiert15,16,17,18,19, bieten reichlich Unterstützung für diese Bezeichnung. Obwohl die zentrale Rolle des Schweins in der IAV-Ökologie und -Evolution gut verstanden ist10,13,16, sind die viralen Dynamiken innerhalb des Wirts, die die Neuordnung in diesem Wirt steuern, weniger gut charakterisiert.

Wir haben zuvor berichtet, dass eine IAV-Reassortierung in vivo häufig auftritt20,21,22,23,24. Diese frühere Arbeit konzentrierte sich auf leicht zu beprobende IAV-Populationen, die sich in den oberen Atemwegen von Säugetieren replizieren. Neuere Arbeiten haben jedoch gezeigt, dass sich in verschiedenen Regionen der Atemwege unterschiedliche Subpopulationen innerhalb des Wirts bilden können25. Diese räumliche Struktur kann wiederum die virale Evolutionsdynamik innerhalb und zwischen Wirten beeinflussen26,27. Hier haben wir untersucht, wie die durch Reassortierung erzeugte genotypische Diversität von der Viruspopulationsstruktur innerhalb des Wirts geprägt wird und zu dieser beiträgt.

Wir untersuchten die Diversität innerhalb des Wirts, die durch Neusortierung bei Meerschweinchen, Frettchen und Schweinen entsteht. Während Schweine ein wichtiger natürlicher Wirt sind, sind Meerschweinchen und Frettchen gut charakterisierte Modelle für menschliches IAV28,29,30. Wir stellen fest, dass die Koinfektion auf zellulärer Ebene weit verbreitet ist und reassortierende Viren regelmäßig beobachtet werden. Bei Frettchen wird im oberen Atemtrakt eine deutlich größere virale Genotypvielfalt erzeugt als im unteren Atemtrakt. Darüber hinaus sind die Viruspopulationen an diesen beiden Standorten genetisch sehr unterschiedlich, was eine starke räumliche Kompartimentierung erkennen lässt. Die durch Reassortment erzeugte Diversität ist bei Schweinen im Allgemeinen geringer als bei Meerschweinchen und Frettchen, und wie bei Frettchen ist die virale Diversität bei Schweinen durch eine umfassende räumliche Kompartimentierung gekennzeichnet. Zusammenfassend zeigen unsere Daten, dass die räumliche Struktur im Atemtrakt von Säugetieren ein wesentlicher Faktor ist, der das Ausmaß der IAV-Vielfalt bestimmt, die durch die Neusortierung entsteht.

Um die durch Reassortierung erzeugte virale genotypische Diversität zu bewerten, wurden Meerschweinchen, Frettchen und Schweine mit gut passenden Elternviren des Influenza-A/Niederlande/602/2009 (NL09; pH1N1)-Hintergrunds koinfiziert31. Diese als Wildtyp (WT) und Variante (VAR) bezeichneten koinfizierenden Viren unterscheiden sich durch eine einzige synonyme Mutation, die in jedes Gensegment des VAR-Virus eingeführt wird, und durch unterschiedliche Epitop-Tags, die im offenen Leserahmen von Hämagglutinin jedes Virus kodiert sind. In der Zellkultur zeigen diese beiden Viren eine vergleichbare Fitness (ergänzende Abbildung 1). Nach der Bestimmung der 50 % infektiösen Dosis (ID50) der Virusmischung bei Frettchen und unter Verwendung früherer ID50-Ergebnisse bei Meerschweinchen32 wurde die Neuzusammensetzung bei diesen Arten bei zwei intranasal verabreichten Dosen (1 × 102 und 1 × 105 ID50) analysiert. Bei Schweinen wurde eine Einzeldosis von 2 × 106 PFU sowohl intranasal als auch intratracheal verabreicht, nachdem vorläufige Tests mit niedrigeren, intranasalen Dosen gezeigt hatten, dass die Tiere nicht durchgängig infiziert waren. Alle inokulierten Tiere unterstützten eine robuste Virusreplikation, wie an der Nasenstelle beurteilt, wobei die Titer 4–7 Tage nach der Inokulation bis zur Nachweisgrenze sanken (ergänzende Abbildung 2).

Um die Reassortierung in den oberen Atemwegen zu überwachen, wurden Nasenproben in Längsrichtung gesammelt und die Genotypen der aus jeder Probe abgeleiteten klonalen Isolate bestimmt. Der elterliche Ursprung jedes der acht Segmente wurde definiert, was die Identifizierung aller 254 möglichen Reassortanten-Genotypen und beider Eltern-Genotypen ermöglichte. Dabei wird ein Genotyp als eine Konstellation von acht Gensegmenten definiert und eine eventuell vorhandene Nukleotiddiversität wird nicht berücksichtigt. In allen Proben aller getesteten Arten wurde eine Neusortierung festgestellt (ergänzende Abbildung 3). Um die durch Reassortierung erzeugte virale Diversität zu charakterisieren, haben wir die Häufigkeit einzigartiger Genotypen, die Häufigkeit elterlicher Genotypen, den Reichtum und die Shannon-Weiner-Diversität für jede Probe berechnet (Abb. 1).

Ergebnisse von Meerschweinchen werden in A–D, Frettchen in E–H und Schweine in I–L angezeigt. Gestapelte Diagramme (A, E, I) zeigen Häufigkeiten einzigartiger Genotypen, die bei einem repräsentativen Tier im Laufe der Zeit entdeckt wurden. Blau und Orange stellen die elterlichen Genotypen WT bzw. VAR dar. Die Häufigkeit beider Elterngenotypen zusammen (B, F, J), der Reichtum (C, G, K) und die Shannon-Weiner-Diversität (D, H, L) werden jeweils als Funktion der Zeit aufgetragen. Meerschweinchen und Frettchen, die mit hoher Dosis (1 × 105 ID50) und niedriger Dosis (1 × 102 ID50) geimpft wurden, sind mit gestrichelten bzw. durchgezogenen Linien gekennzeichnet. Die Verteilung der Häufigkeit (M), des Reichtums (N) und der Diversität (O) des Elterngenotyps über alle Zeitpunkte in jeder Art (Meerschweinchen n = 12; Frettchen n = 12; Schweine n = 18) wird mit Violindiagrammen dargestellt. Die Daten werden als Violinplots mit Boxplot dargestellt. Die Grenzen der Box zeigen das erste und dritte Quartil. Whiskers geben das 1,5-fache des Interquartilbereichs an und enthalten ~99 % der Daten für eine Normalverteilung. Die Grenzen der Violindiagramme geben die Minima und Maxima des gesamten Datensatzes an. Die Unterschiede im Artenreichtum und der Diversität zwischen Schweinen und Meerschweinchen (Reichtum p = 0,00065; Diversität p = 0,00014) sowie zwischen Schweinen und Frettchen (Reichtum p = 0,0016; Diversität p = 0,0028) waren signifikant. Die Häufigkeit des Elterngenotyps unterschied sich signifikant zwischen Schweinen und Meerschweinchen (p = 0,003) und war zwischen Schweinen und Frettchen nicht signifikant (p > 0,05). Alle Statistiken wurden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA abgeleitet. Tiersilhouetten wurden mit BioRender.com erstellt.

Bei allen drei Wirtsspezies wird das gleiche reassortierende Virus selten über mehrere Zeitpunkte hinweg nachgewiesen (ergänzende Abbildung 3), was auf einen genotypischen Verlust aufgrund stochastischer Prozesse wie Drift oder Störung durch weitere Reassortierung schließen lässt. Elterngenotypen (WT oder VAR) werden jedoch in den Nasenproben jedes Tieres zu mindestens zwei Zeitpunkten konsistent nachgewiesen (Abb. 1B, F, J, M). Trotz der Bemühungen, mit einer 1:1-Mischung aus WT- und VAR-Viren zu impfen, war VAR vorherrschend; Dies könnte auf eine Verzerrung des Inokulums oder einen Fitnessvorteil von VAR zurückzuführen sein, der nur in vivo erkennbar ist. Da aus jeder Probe 21 Virusisolate genotypisiert wurden, hat die Reichhaltigkeit in unserem Datensatz einen Maximalwert von 21. Der Reichtum ist bei Meerschweinchen und Frettchen oft hoch und liegt zwischen 4 und 18, während der Bereich bei Schweinen zwischen 3 und 10 liegt (Abb. 1C, G, K, N). Diversitätstrends entsprechen denen des Reichtums (Abb. 1D, H, L, O).

Bei Meerschweinchen und Frettchen waren nur geringfügige Dosiseffekte erkennbar (Abb. 1, vergleiche gestrichelte und durchgezogene Linien). Dennoch waren, wie in der ergänzenden Abbildung 4 gezeigt, Unterschiede in der Diversität zwischen den Dosen bei beiden Arten signifikant, wobei die höhere Dosis eine höhere Diversität ergab, wenn alle Zeitpunkte zusammen betrachtet wurden (p = 0,04 bei Meerschweinchen und p = 0,003 bei Frettchen, ANOVA). ). Auch der Reichtum war bei Frettchen, die eine höhere Dosis erhielten, signifikant höher (p = 0,002, ANOVA).

Die Auswirkungen der Dosis sind für die Interpretation von Vergleichen zwischen verschiedenen Arten relevant, da bei Schweinen nur eine relativ hohe Dosis getestet wurde. Ein Vergleich der Arten über alle Zeitpunkte und Dosierungen hinweg zeigt, dass bei Meerschweinchen und Frettchen ein signifikant höherer Artenreichtum und eine deutlich höhere Diversität zu beobachten sind als bei Schweinen (Abb. 1N, O; p < 0,01, ANOVA). Die Beschränkung dieser Analyse auf die Einbeziehung nur Tiere, die eine hohe Dosis Inokulum erhielten, bestätigte diese Trends (p < 0,005, ANOVA).

Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die oberen Atemwege von Säugetieren eine Umgebung mit hohem Potenzial für die Erzeugung viraler Diversität durch Reassortierung darstellen, wobei moderate Dosiseffekte beobachtet werden und Schweine eine geringere virale Diversität aufweisen als Meerschweinchen oder Frettchen.

Bei Säugetierwirten kann die IAV-Replikation über den gesamten Atemtrakt verteilt sein. Mithilfe des Frettchenmodells verglichen wir das Ausmaß der viralen Diversität, die durch Reassortierung in den oberen und unteren Atemwegen entsteht. Nasenmuscheln und Lungengewebe wurden an den Tagen 1, 2, 3 oder 4 von Frettchen gesammelt, die mit 1 × 102 oder 1 × 105 Frettchen-ID50 geimpft wurden. Die Virustiter in diesen Proben sind in der ergänzenden Abbildung 2 angegeben. Die Genotypisierung viraler Isolate ergab, dass die Anzahl der nachgewiesenen eindeutigen Genotypen in beiden Dosen routinemäßig in den Nasenmuscheln höher war als in der Lunge (Abb. 2A–C). Ebenso war die Shannon-Weiner-Diversität in den Nasenmuscheln typischerweise höher als in der Lunge (Abb. 2D). Diese Unterschiede sowohl im Reichtum als auch in der Diversität waren signifikant (Abb. 2E, F) (p = 8,6 × 10−5 bzw. p = 0,0014; gepaarter t-Test).

Kreisdiagramme zeigen die Häufigkeit einzigartiger Genotypen, die in den Nasenmuscheln (NT) und der Lunge von Frettchen nachgewiesen wurden, die mit 1 × 102 FID50 (A) oder 1 × 105 FID50 (B) geimpft wurden. Die gezeigten Frettchen wurden zu den folgenden Zeitpunkten nach der Infektion analysiert: Tag 1 (F11, 12, 19, 20), Tag 2 (F13, 14, 21, 22), Tag 3 (F15, 16, 23) und Tag 4 ( F17, 18, 24). Blaue und orangefarbene Abschnitte der Kreisdiagramme repräsentieren die Elterngenotypen VAR bzw. WT. Reichtum (C) und Diversität (D) werden dargestellt, wobei die beobachteten Ergebnisse (farbige Punkte) der Verteilung der simulierten Daten (graue Geigen) überlagert werden (n = 1000 Simulationen pro Frettchen). Horizontale Linien bezeichnen das 95. und 5. Perzentil. Die Verteilung von Reichtum (E) und Diversität (F) in NT und Lunge aller Individuen wird mit Violindiagrammen dargestellt (Lunge n = 14; Nasenmuscheln n = 14). Die Daten werden als Violinplots mit Boxplot dargestellt. Die Daten werden als Violinplots mit Boxplot dargestellt. Die Grenzen der Box zeigen den Interquartilbereich und die Mitte der Box zeigt das 50. Perzentil. Der Median wird durch den weißen Punkt angezeigt. Whisker geben das 1,5-fache des Interquartilbereichs an und enthalten \(\sim 99\%\) der Daten für eine Normalverteilung. Die Grenzen der Violindiagramme geben die Minima und Maxima des gesamten Datensatzes an. Die Unterschiede zwischen NT und Lunge waren bei beiden Messungen signifikant (p < 0,01, zweiseitiger gepaarter t-Test).

Wir stellten die Hypothese auf, dass die unterschiedlichen Ergebnisse einer Koinfektion in den oberen und unteren Atemwegen auf eine geringe Virusverbreitung zwischen den beiden Stellen hindeuten. Um diese Hypothese zu testen, haben wir die freie Vermischung zwischen Lunge und Nase modelliert, indem wir intakte Genotypen rechnerisch zwischen den beiden Geweben gemischt haben. Anschließend verglichen wir unsere beobachteten Daten mit dem resultierenden simulierten Datensatz (Abb. 2C, D). Dieser Ansatz ergab, dass der in der Lunge beobachtete Reichtum und die Diversität im Vergleich zu dem, was für die freie Vermischung erwartet wird, gering sind, wobei die beobachteten Werte typischerweise unter dem 5. Perzentil der simulierten Ergebnisse liegen. Im Gegensatz dazu liegen die in den Nasenmuscheln beobachteten Reichhaltigkeit und Diversität typischerweise über dem Mittelwert. Diese Analyse legt nahe, dass die Ausbreitung des Virus zwischen den oberen und unteren Atemwegsregionen relativ selten erfolgt, so dass eine große Diversität, die durch die Neusortierung im Nasentrakt entsteht, nicht zu einer ähnlich vielfältigen Population in der Lunge führt.

Die Untersuchung der spezifischen Genotypen, die in den Nasenmuscheln und der Lunge eines bestimmten Frettchens identifiziert wurden, ergab nahezu keine Überlappung (Abb. 2A, B). Um diese offensichtliche Unähnlichkeit der Viruspopulationen genauer beurteilen zu können, haben wir die normalisierte Beta-Diversität (βn) zwischen Probenpaaren berechnet33. Diese Unähnlichkeitsmetrik hat einen Bereich zwischen 0 und 1, wobei ein Beta-Wert von 0 angibt, dass zwei Proben in ihrer Genotypzusammensetzung identisch sind, und ein Beta-Wert von 1 angibt, dass es keine genotypische Überschneidung gibt. Bei allen Frettchen sind hohe Beta-Diversitäten von >0,5 zwischen Nasenmuschel- und Lungenproben desselben Tieres zu beobachten (Abb. 3A). Tatsächlich deuten Beta-Diversitätswerte, die zwischen Probenpaaren innerhalb und zwischen Frettchen berechnet wurden, darauf hin, dass die nasalen und Lungenvirenpopulationen innerhalb eines Individuums typischerweise genauso unterschiedlich sind wie Populationen, die sich in verschiedenen Tieren replizieren (Abb. 3A). Um zu testen, ob eine mangelnde Virusverteilung zwischen anatomischen Stellen für diese Beobachtung verantwortlich sein könnte, verglichen wir die beobachtete Beta-Diversität mit der Verteilung der Beta-Diversitätswerte, die aus der oben beschriebenen rechnerischen Simulation der freien Mischung erhalten wurden. Bei den meisten Frettchen liegt die beobachtete Beta-Diversität über dem 95. Perzentil der Verteilung (Abb. 3B). Daher sind die sehr unterschiedlichen Viruspopulationen, die im Nasen- und Lungengewebe beobachtet werden, nicht mit einer freien Vermischung zwischen diesen Stellen vereinbar. Diese Daten stützen weiterhin die Annahme, dass die Virusreplikation in den oberen und unteren Atemwegen von Frettchen unterschiedliche Kompartimente bildet, wobei die Neusortierung an beiden Stellen unabhängig voneinander erfolgt.

Wärmekarte, die die normalisierte Beta-Diversität der Viruspopulationen in der Lunge und den Nasenmuscheln (NT) von Frettchen zeigt (A). Der Einschub zeigt einen repräsentativen Vergleich zwischen den Geweben der Frettchen F23 und F21, um die Position von NT und Lunge innerhalb der Matrix anzuzeigen. Die normalisierte Beta-Diversität ist in B dargestellt, wobei die beobachteten Ergebnisse (farbige Punkte) der Verteilung der simulierten Daten (graue Geigen) überlagert sind (n = 1000 Simulationen pro Frettchen). Die Daten werden als Violinplots mit Boxplot dargestellt. Die Daten werden als Violinplots mit Boxplot dargestellt. Die Grenzen der Box zeigen den Interquartilbereich und die Mitte der Box zeigt das 50. Perzentil. Whisker geben das 1,5-fache des Interquartilbereichs an und enthalten \(\sim 99\%\) der Daten für eine Normalverteilung. Die Grenzen der Violindiagramme geben die Minima und Maxima des gesamten Datensatzes an. Ein Stern zeigt an, dass die beobachteten Daten über dem 95. Perzentil der Verteilung liegen; Zwei Sterne zeigen an, dass die beobachteten Daten über dem 99. Perzentil liegen. C Immunhistochemische Bilder von Frettchen-F23-NT- und Lungenschnitten, gefärbt auf WT- (grün) und VAR-Viren (rot), am Tag 3 nach der Inokulation. Graue Färbung markiert die Grenzen der Epithelzellen. Die gelbe Färbung in zusammengeführten Bildern weist auf das Vorhandensein von WT- und VAR-HA-Antigenen in derselben Zelle hin. Vergrößerte Ausschnitte sowohl der NT- als auch der Lungenabschnitte werden mit weißen Pfeilen angezeigt, die koinfizierte Zellen anzeigen, und gelben Pfeilen, die einfach infizierte Zellen anzeigen. Maßstabsbalken sind 20 µm. Für jeden Gewebeschnitt wurden vier Felder analysiert und repräsentative Bilder sind hier dargestellt. D Immunhistochemische Bilder von F24-Lungenschnitten von Frettchen, gefärbt auf Nukleoprotein (rot) und gegengefärbt mit Hämatoxylin. Maßstabsbalken sind 20 µm. Für jeden Gewebeschnitt wurden vier Felder analysiert und repräsentative Bilder sind hier dargestellt.

Um die räumliche Verteilung koinfizierender Viren im Frettchengewebe sichtbar zu machen, wurden die markierten HA-Proteine ​​WT- und VAR-Ursprungs in Lungen- und Nasengewebeschnitten angefärbt (Abb. 3C). Diese Analyse ergab, dass mikroskopische Felder, die positiv auf virale Antigene reagieren, tendenziell eine hohe Dichte infizierter Zellen an beiden Gewebestellen aufweisen. Bemerkenswerterweise sind die meisten infizierten Zellen sowohl für WT- als auch für VAR-Antigene positiv, was auf ein hohes Maß an viraler Koinfektion innerhalb des Wirts hinweist, was mit der beobachteten robusten Reassortierung übereinstimmt. Die Zelltypen, die das virale Antigen im infizierten Lungengewebe beherbergen, wurden anhand ihrer Morphologie definiert und umfassten Flimmerepithel der Bronchien und Bronchiolen, Becherzellen, Zellen der peribronchialen/iolaren Submukosadrüsen und Typ-II-Pneumozyten in den Alveolen ( Abb. 3D und ergänzende Daten 2). Aufgrund der Erschöpfung der Proben konnte diese Analyse leider nicht für die Nasenmuschel durchgeführt werden.

Die Analyse von Nasenabstrichen zeigte eine begrenzte genotypische Diversität im Nasentrakt von Schweinen. Wir haben diese Untersuchung des Reassortments bei Schweinen erweitert, indem wir am 3. oder 5. Tag nach der Inokulation Proben aus dem Nasentrakt und jedem der sieben Lungenlappen von Gruppen zu je drei Schweinen entnommen haben. Die Virustiter in diesen Proben sind in der ergänzenden Abbildung 2 dargestellt. Die Titer im Nasentrakt am Tag 3 reichten nicht aus, um die Analyse der Neusortierung zu unterstützen. Die an den verbleibenden Standorten beobachteten Genotyphäufigkeiten wurden aufgezeichnet und auf einem Schema einer Schweinelunge überlagert (Abb. 4A – F). Obwohl in allen bis auf drei der 45 Proben eine oder mehrere Reassortanten nachgewiesen werden, neigen die Viruspopulationen dazu, hohe Anteile des Elternvirus zu tragen. An einer Minderheit der Standorte ist eine bestimmte Reassortante vorherrschend. Der Reichtum liegt bei den meisten Proben unter 10 (Abb. 4G), und Shannon-Weiner-Diversitäten unter 1,0 sind häufig (Abb. 4H). Somit ist die Diversität, die durch die Neusortierung im gesamten Atemtrakt von Schweinen entsteht, insgesamt moderat. Um zu beurteilen, inwieweit eine mangelnde Virusvermischung an den untersuchten Standorten den Reichtum und die Vielfalt einschränkt, verglichen wir die beobachteten Ergebnisse mit denen, die erwartet werden, wenn sich Viren frei im gesamten Atemtrakt vermischen (Abb. 4G, H). Um das freie Mischen zu simulieren, haben wir zufällig intakte virale Genotypen von allen in einem bestimmten Schwein nachgewiesenen Viren entnommen. Die resultierenden Reichtums- und Shannon-Weiner-Diversitätswerte weisen weite Verteilungen auf. Ein Großteil der beobachteten Daten liegt jedoch unterhalb des 5. Perzentils dieser Verteilungen, was darauf hindeutet, dass lokal Bereiche mit geringem Reichtum und geringer Diversität bestehen bleiben, weil es an anatomischen Standorten keine Durchmischung gibt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die durch Reassortierung erzeugte lokale genotypische Vielfalt im gesamten Atemtrakt von Schweinen bescheiden ist.

Kreisdiagramme, die die Häufigkeit einzigartiger Genotypen zeigen, die in jedem Lungenlappen eines bestimmten Schweins am 3. Tag (A–C) und im Nasentrakt und jedem Lungenlappen eines bestimmten Schweins am 5. Tag (D–F) vorhanden sind, wobei blaue und orangefarbene Abschnitte dies darstellen WT- bzw. VAR-Elterngenotypen. Die Gewebestellen werden als NA-Nasal abgekürzt; LA-Links apikal; RA-rechts apikal; LC-Linkes Herz; RC-Rechtsherz; LD-Linksmembran; RD-Rechtsmembran; IN-Intermediate (Zubehör). Der simulierte Reichtum (G) und die Diversität (H) werden grafisch dargestellt, wobei die beobachteten Ergebnisse (farbige Punkte) der Verteilung der simulierten Daten (graue Geigen) überlagert werden (n = 1000 Simulationen pro Schwein). Die Daten werden als Violinplots mit Boxplot dargestellt. Die Grenzen der Box zeigen den Interquartilbereich und die Mitte der Box zeigt das 50. Perzentil. Der Median wird durch den weißen Punkt angezeigt. Whisker geben das 1,5-fache des Interquartilbereichs an und enthalten \(\sim 99\%\) der Daten für eine Normalverteilung. Die Grenzen der Violindiagramme geben die Minima und Maxima des gesamten Datensatzes an. Horizontale Linien bezeichnen das 95. und 5. Perzentil.

Die Untersuchung der in Schweinegeweben identifizierten reassortanten viralen Genotypen zeigt kaum oder gar keine Überlappung zwischen den Standorten innerhalb eines einzelnen Tieres (Abb. 4A–F). Wir verwendeten erneut die Beta-Diversität, um die Ähnlichkeit von Viruspopulationen paarweise und quantitativ zu bewerten. Wie bei Frettchen zu sehen war, waren die Betawerte bei Schweinen typischerweise hoch (Abb. 5A und ergänzende Abb. 5). Tatsächlich unterschieden sich die bei einem Schwein entnommenen Viruspopulationen ebenso stark voneinander wie die bei verschiedenen Schweinen entnommenen Viruspopulationen (Abb. 5A). Um zu testen, ob ein Mangel an viraler Ausbreitung zwischen anatomischen Stellen für diese Beobachtung verantwortlich sein könnte, verglichen wir die für zwei Stellen innerhalb eines Schweins beobachtete Beta-Diversität mit der Verteilung der Beta-Diversitätswerte, die aus einer Simulation der freien Vermischung zwischen diesen Stellen ermittelt wurden (Abb . 5B und ergänzende Abb. 6). Bei den meisten Gewebepaaren liegen die beobachteten Daten am oberen Ende dieser Verteilung und liegen im 95. Perzentil der simulierten Ergebnisse. Daher ist die räumliche Kompartimentierung innerhalb des Atemtrakts von Schweinen groß.

Wärmekarte, die die normalisierte Beta-Diversität der Viruspopulationen in der Lunge und im Nasentrakt von Schweinen zeigt (A). Der Einschub zeigt einen repräsentativen Vergleich zwischen den Geweben der Schweine P3 und P6, um die Position jedes Gewebes innerhalb der Matrix anzuzeigen. Die Gewebestellen werden als NA-Nasal abgekürzt; LA – Links apikal; RA – rechts apikal; LC-Linkes Herz; RC-Rechtsherz; LD-Linksmembran; RD-Rechtsmembran; IN-Intermediate (Zubehör). Die normalisierte Beta-Diversität zwischen dem linken apikalen und dem linken Herzlappen wird aufgetragen (B), wobei die beobachteten Ergebnisse (farbige Punkte) der Verteilung der simulierten Daten (graue Violinen) überlagert sind (n = 1000 Simulationen pro Schwein). Die Daten werden als Violinplots mit Boxplot dargestellt. Die Daten werden als Violinplots mit Boxplot dargestellt. Die Grenzen der Box zeigen den Interquartilbereich und die Mitte der Box zeigt das 50. Perzentil. Whisker geben das 1,5-fache des Interquartilbereichs an und enthalten \(\sim 99\%\) der Daten für eine Normalverteilung. Die Grenzen der Violindiagramme geben die Minima und Maxima des gesamten Datensatzes an. Ein Stern zeigt an, dass die beobachteten Daten über dem 95. Perzentil der Verteilung liegen; Zwei Sterne zeigen an, dass die beobachteten Daten über dem 99. Perzentil liegen. C Repräsentative immunhistochemische Bilder des linken apikalen Lungenabschnitts von Schweinen (P76), gefärbt auf WT- (grün) und VAR-Viren (rot), am Tag 3 nach der Inokulation. Graue Färbung markiert die Grenzen der Epithelzellen. Die gelbe Färbung in zusammengeführten Bildern weist auf das Vorhandensein von WT- und VAR-HA-Antigenen in derselben Zelle hin. Vergrößerte Ausschnitte der Lunge werden mit weißen Pfeilen angezeigt, die koinfizierte Zellen anzeigen, und gelben Pfeilen, die einfach infizierte Zellen anzeigen. Maßstabsbalken sind 20 µm. Für jeden Gewebeschnitt wurden vier Felder analysiert und repräsentative Bilder sind hier dargestellt. D Immunhistochemische Bilder von linken apikalen Lungenabschnitten von Schweinen (P76), gefärbt auf Nukleoprotein (rot) und gegengefärbt mit Hämatoxylin. Maßstabsbalken sind 20 µm. Für jeden Gewebeschnitt wurden vier Felder analysiert und repräsentative Bilder sind hier dargestellt.

Um die räumliche Verteilung koinfizierender Viren im Schweinegewebe sichtbar zu machen, wurden die markierten HA-Proteine ​​​​mit WT- und VAR-Ursprung gefärbt (Abb. 5C und ergänzende Abb. 7). Wie bei Frettchen ist eine hohe Dichte infizierter Zellen in Regionen sichtbar, die für virales Antigen positiv sind, und die meisten infizierten Zellen sind sowohl für WT- als auch für VAR-Viren positiv. Somit erstreckt sich die bei Frettchen beobachtete hohe Viruskoinfektion auch auf Schweine. Mithilfe eines morphologischen Ansatzes zur Identifizierung von Zelltypen stellten wir fest, dass Typ-II-Pneumozyten in den Alveolen und Flimmerepithelzellen der Bronchiolen und Bronchien die vorherrschenden Zelltypen sind, die virale Antigene in der Lunge beherbergen (Abb. 5D, ergänzende Abb. 8 und ergänzende Daten). 2). In Nasenmuscheln wurde eine Virusantigenpositivität in den Atemwegs- und Übergangsepithelien beobachtet (Ergänzende Abbildung 8 und Ergänzende Daten 2).

Unsere Experimente zeigen, inwieweit eine Koinfektion auf der Ebene des gesamten Wirts Möglichkeiten für eine Neuordnung innerhalb des Wirts schafft. Im Nasentrakt von Meerschweinchen und Frettchen gibt es reichlich Gelegenheit dazu. Allerdings ist die durch Reassortierung erzeugte Virusvielfalt in der Lunge von Frettchen und allen von Schweinen untersuchten Geweben begrenzter. Zusätzlich zu den relativ geringen Möglichkeiten zur Neusortierung in diesen Geweben führen räumliche Einschränkungen bei der Vermischung innerhalb der Atemwege zu lokalisierten Subpopulationen mit verminderter genotypischer Diversität. Trotz der umfassenden Neuordnung, die bei Schweine-IAV auf Populationsebene beobachtet wurde, zeigen unsere Ergebnisse daher nur eine mäßige Virusvielfalt, die durch die Neuordnung bei Schweinen entsteht. Ergebnisse von Meerschweinchen und Frettchen legen nahe, dass die Möglichkeit für einen IAV-Genaustausch innerhalb des Wirts bei anderen natürlichen Säugetierwirten größer sein könnte.

Bei Vergleichen zwischen den untersuchten Arten ist es wichtig, Unterschiede in den angewandten Protokollen zu berücksichtigen. Schweine wurden sowohl intranasal als auch intratracheal infiziert, im Vergleich zu nur intranasalen Infektionen sowohl bei Frettchen als auch bei Meerschweinchen. Es ist zu erwarten, dass die direkte Verabreichung des Inokulums an die unteren Atemwege bei Schweinen das Potenzial für eine WT-VAR-Koinfektion in der Lunge erhöht. Darüber hinaus wurden Schweine mit einer einzelnen hohen Dosis infiziert, deren Zusammenhang mit den mittleren Infektionsdosen dieser Art unbekannt war, während Frettchen und Meerschweinchen jeweils mit Dosen von 1 × 102 und 1 × 105 ID50 infiziert wurden. Gemessen mittels Plaque-Assay ist die bei Schweinen verabreichte Dosis mit der bei Meerschweinchen verwendeten hohen Dosis vergleichbar und etwa zehnmal niedriger als die bei Frettchen verwendete hohe Dosis. Während zu erwarten ist, dass die Inokulumdosis das Potenzial für eine Koinfektion und die Vermehrung neuer Varianten beeinflusst, war der Effekt eines 103-fachen Dosisunterschieds bei Frettchen und Meerschweinchen gering. Wir vermuten daher, dass die geringere Diversifizierung durch Neusortierung bei Schweinen wahrscheinlich nicht auf Protokollunterschiede zurückzuführen ist.

Da wir gut aufeinander abgestimmte Elternviren verwenden, ist es unwahrscheinlich, dass die Unterschiede in der viralen genotypischen Diversität zwischen Arten und zwischen Geweben innerhalb einer Art durch Selektion bedingt sind. Stattdessen beeinflussen Merkmale der Virusdynamik in diesen unterschiedlichen Umgebungen wahrscheinlich die Häufigkeit der Reassortierung und das Ausmaß, in dem Reassortanten nach ihrer Bildung verstärkt werden. Da bei Schweinen und Frettchenlungen relativ wenige Reassortanten nachgewiesen wurden, deuten unsere Daten darauf hin, dass die Größe des Zielgewebes ein wichtiger Faktor sein könnte. Bei großen Tieren wie Schweinen oder Gewebe mit großer Oberfläche wie der Lunge kann die Wahrscheinlichkeit einer zellulären Koinfektion mit genetisch unterschiedlichen Varianten verringert sein. Darüber hinaus variieren wahrscheinlich die virale Fitness, die räumliche Anordnung der Zielzellen, das Ausmaß, in dem permissive Zellen mit nicht permissiven Zellen durchsetzt sind, physische Barrieren für die Virusausbreitung und die Wirksamkeit angeborener Reaktionen auf Infektionen je nach Spezies und zwischen verschiedenen Arten Gewebe innerhalb einer Art34,35,36.

Obwohl Unterschiede in der Diversität, die durch die Neusortierung erzeugt wird, offensichtlich sind, deutete die Visualisierung viraler Antigene in infizierten Geweben darauf hin, dass es an allen untersuchten Stellen häufig zu zellulären Koinfektionen kommt. Es wurde bereits berichtet, dass eine zelluläre Koinfektion in vivo häufig vorkommt37 und wird aufgrund des hohen Potenzials einzelner Genome, zu einer abortiven Infektion zu führen38,39 und der Möglichkeit einer direkten Ausbreitung von viralem genetischem Material40 von Zelle zu Zelle erwartet. Dennoch ist die Gegenüberstellung dieses Ergebnisses mit der Dominanz von Viren vom Elterntyp in vielen Proben kontraintuitiv. Während die Bilder von fixiertem Gewebe eine Momentaufnahme der viralen HA-Proteinexpression in definierten Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt zeigen, stammen Virusproben aus der Viruspopulation, die sich im Verlauf der Infektion an einer bestimmten Stelle angesammelt hat. Daher spiegelt die Prävalenz der Elterngenotypen möglicherweise deren Produktion früh nach der Inokulation wider, wenn eine zelluläre Koinfektion weniger wahrscheinlich ist22,37. Darüber hinaus gibt die HA-Färbung weder Aufschluss über die relative Dosierung von WT- und VAR-Genomen in einer Zelle noch über den/die Genotyp(en) der sieben Nicht-HA-Segmente. Beide Faktoren würden den Anteil der Nachkommengenome einer koinfizierten Zelle, die reassortiert ist, stark modulieren.

Die räumliche Trennung viraler Subpopulationen innerhalb eines Individuums hat wichtige evolutionäre Auswirkungen. Erstens ist es weniger wahrscheinlich, dass es zu einer Neuordnung genetisch unterschiedlicher Viren kommt, wenn die Virusausbreitung lokalisiert ist, da alle Viren, die von einer einfach infizierten Vorläuferzelle produziert werden, genetisch ähnlich sind23. Umgekehrt ist es wahrscheinlicher, dass gut gemischte Viruspopulationen Reassortanten produzieren, die sich in biologisch bedeutsamer Weise von ihren Eltern unterscheiden. Die Kompartimentierung von Varianten kann ein Faktor sein, der zu der fehlenden Neuzusammenstellung bei experimentell infizierten Menschen beiträgt41. Zweitens beeinflusst die räumliche Struktur das Ausmaß, in dem eine Viruspopulation innerhalb eines Wirts durch Selektion im Vergleich zu stochastischen Prozessen geformt wird25,42. Durch räumliche Barrieren entstehen Subpopulationen, die jeweils eine kleine Populationsgröße aufweisen können. Daher dominiert innerhalb jeder Subpopulation die genetische Drift, wobei sich die Variantenhäufigkeit im Laufe der Zeit größtenteils aufgrund von Zufall ändert. Dies bedeutet, dass sowohl Varianten mit niedrigerer als auch höherer Fitness das Potenzial haben, innerhalb von Subpopulationen hohe Häufigkeiten zu erreichen. Infolgedessen hat die räumliche Unterteilung von Populationen den unmittelbaren Effekt, dass die Effizienz der Selektion verringert wird. Während die Stärke der Selektion zur Beseitigung von Varianten mit geringer Eignung auf der Ebene einzelner Subpopulationen geschwächt ist, ermöglicht die Vermehrung leicht schädlicher Mutanten eine umfassendere Erforschung des Sequenzraums über die gesamte Viruspopulation, die innerhalb des Wirts verteilt ist. Dies kann in seltenen Fällen zur Entdeckung von Varianten mit höherer Fitness führen, die sich in weniger strukturierten Populationen innerhalb des Wirts möglicherweise nicht so leicht entwickeln.

Es wird erwartet, dass die Kompartimentierung der Virusreplikation auch die Evolution zwischen Wirten beeinflusst. Wie bei Frettchen beobachtet wurde, umfasst das übertragene Virus wahrscheinlich eine Teilprobe einer bestimmten anatomischen Stelle23,27,43. Im Zusammenhang mit der räumlichen Heterogenität ist diese Teilprobe nicht repräsentativ für die im gesamten Wirt vorhandene Viruspopulation. Daher wird erwartet, dass die räumliche Struktur innerhalb des Wirts zu stochastischen Effekten beiträgt, die zwischen Wirten wirken: Das übertragene Virus ist das Virus, das sich zur richtigen Zeit am richtigen Ort befand, und möglicherweise nicht der am besten geeignete Genotyp, der in einem Wirt vorhanden ist23,27 ,44,45.

Es ist wichtig, bestimmte Einschränkungen in unserem experimentellen Design zu berücksichtigen. Unser Ansatz der Co-Inokulation mit gut passenden Elternstämmen ist darauf ausgelegt, das Potenzial zur Erkennung von Reassortierungen zu maximieren. Darüber hinaus hat die in dieser Studie verwendete Genkonstellation des pandemischen H1N1-Virus von 2009 eine deutliche Veranlagung für eine Neuordnung gezeigt46,47,48. Natürliche Koinfektionen umfassen jedoch ein breites Spektrum an Szenarien hinsichtlich des relativen Zeitpunkts, des Infektionswegs und der Infektionsdosis sowie der Phänotypen der koinfizierenden Stämme. Jeder dieser Faktoren beeinflusst die Häufigkeit der Umsortierung21,22,23,49. Bei der Bewertung des Ausmaßes der Überlappung zwischen viralen Genotypen an verschiedenen anatomischen Stellen ist es wichtig zu beachten, dass Elternviren bei der Inokulation wahrscheinlich im gesamten Atemtrakt ausgesät werden; Daher sind nur reassortante Genotypen aussagekräftig für die Beurteilung des Ausmaßes der Vermischung zwischen Standorten. Wenn Varianten außerdem selten sind (<5 %), würden sie unter die Nachweisgrenze unseres Tests fallen, was starke Auswirkungen auf die gemessene Beta-Diversität haben kann. Insbesondere wenn ein an einem Ort nachgewiesener Genotyp an einem zweiten Ort unterhalb der Nachweisgrenze vorhanden ist, würde die gemessene Beta-Diversität diese Gemeinsamkeit nicht widerspiegeln und wäre daher fälschlicherweise hoch.

Die IAV-Reassortierung innerhalb von Zellen ist effizient, sodass in einer einzigen koinfizierten Zelle leicht 256 verschiedene Genotypen gebildet werden50. Allerdings unterliegt das hohe Potenzial einer Reassortierung zur Generierung von Diversität innerhalb eines Wirts einer komplexen Dynamik, die die Wahrscheinlichkeit einer zellulären Koinfektion und das Ausmaß der Vermehrung neuer Reassortanten bestimmt. Während unsere Daten eine umfassende Koinfektion in vivo und eine konsistente Bildung von Reassortanten aufzeigen, sind Arten- und Gewebeunterschiede im Ausmaß der Reassortierung offensichtlich. Räumliche Einschränkungen bei der Verbreitung neuer Genotypen tragen zu dieser Komplexität bei und dürften ein wesentlicher Faktor für die virale Evolutionsdynamik innerhalb des Wirts sein.

Alle Tierversuche wurden gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Die Studien wurden unter Tierschutzstufe 2 durchgeführt und vom IACUC der Emory University (DAR-2002738-ELMNTS-A) für Meerschweinchen (Cavia porcellus) und dem IACUC der University of Georgia (AUP A2015 06-026-Y3) genehmigt -A5) für Frettchen (Mustela putorius furo) und dem IACUC der Kansas State University (Protokoll Nr. 4120) für Schweine (Sus scrofa). Die Tiere wurden gemäß den von der American Veterinary Medical Association genehmigten Richtlinien auf humane Weise eingeschläfert.

Für alle Experimente wurden Madin-Darby-Hundenierenzellen (MDCK) verwendet, ein Geschenk von Dr. Robert Webster, St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, TN, an DRP. Anschließend wurde ein Samenstamm von MDCK-Zellen bei Passage 23 amplifiziert und in Minimal Essential Medium (Gibco), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS; Atlanta Biologicals) und Normocin (Invivogen), gehalten. 293 T-Zellen (ATCC, CRL-3216) wurden in Dulbecco's Minimal Essential Medium (Gibco), ergänzt mit 10 % FBS und PS, gehalten. Alle Zellen wurden bei 37 °C und 5 % CO2 in einem befeuchteten Inkubator kultiviert. Die Zelllinien wurden nicht authentifiziert. Alle Zelllinien wurden während des Gebrauchs monatlich auf Mykoplasmenkontamination getestet. Das Medium für die Kultur von IAV in MDCK-Zellen (Virusmedium) wurde durch Ergänzung des Basalmediums für den jeweiligen Zelltyp mit 4,3 % BSA und Normocin hergestellt.

Die in dieser Studie verwendeten Viren stammten vom Influenza-A/Niederlande/602/2009 (H1N1)-Virus (NL09) und wurden durch umgekehrte Genetik erzeugt51,52,53. Kurz gesagt, 293 T-Zellen, die 16–24 Stunden zuvor mit Reverse-Genetik-Plasmiden transfiziert worden waren, wurden 40–48 Stunden lang bei 37 °C mit MDCK-Zellen kokultiviert. Das wiederhergestellte Virus wurde in MDCK-Zellen mit einer geringen Infektionsmultiplizität vermehrt, um Arbeitsvorräte zu erzeugen. Die Titration der Vorräte und Versuchsproben erfolgte mittels Plaque-Assay in MDCK-Zellen. Durch ortsgerichtete Mutagenese von Reverse-Genetik-Plasmiden wurden stille Mutationen in jedes Segment des VAR-Virus eingeführt. Über die spezifischen Veränderungen des VAR-Virus wurde bereits früher berichtet24,31. Das NL09-VAR-Virus wurde so konstruiert, dass es einen 6XHIS-Epitop-Tag plus einen GGGS-Linker am Amino-(N)-Terminus des HA-Proteins nach dem Signalpeptid enthält. Das NL09-WT-Virus trägt einen HA-Epitop-Tag sowie einen GGGS-Linker, der am N-Terminus des HA-Proteins eingefügt ist31. Für Tierversuche wurde eine 1:1-Mischung aus NL09-WT- und VAR-Viren unter Verwendung der zuvor beschriebenen Methoden hergestellt24. Diese Mischung wurde in der Zellkultur validiert, indem nach der Infektion von MDCK-Zellen positive Zellen für HIS- und HA-Tags quantifiziert wurden, was ein empirisch ermitteltes Verhältnis von 0,95:1 (WT:VAR) ergab. Für alle hier beschriebenen Experimente wurde die gleiche Mischung verwendet.

Die Replikation der Viren NL09, NL09 WT und NL09 VAR wurde in dreifachen Kulturvertiefungen bestimmt. MDCK-Zellen in 6-Well-Schalen wurden mit einer MOI von 0,05 PFU/Zelle in PBS inokuliert. Nach einstündiger Inkubation bei 37 °C wurde das Inokulum entfernt, die Zellen dreimal mit PBS gewaschen, 2 ml Virusmedium zu den Zellen gegeben und die Schalen wieder auf 37 °C gebracht. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Proben von 120 μl Kulturmedium entnommen und bei –80 °C gelagert. Die Virustiter wurden durch Plaque-Assay auf MDCK-Zellen bestimmt.

Weibliche Meerschweinchen vom Stamm Hartley mit einem Gewicht von 250–350 g wurden von den Charles River Laboratories bezogen und im Department of Animal Resources der Emory University gehalten. Vor der intranasalen Inokulation und Nasenspülung wurden die Meerschweinchen mit 30 mg kg-1 Ketamin und 4 mg kg-1 Xylazin durch intramuskuläre Injektion anästhesiert. Der GPID50 des NL09-Virus wurde zuvor mit 1 × 101 PFU32 bestimmt. Um die Reassortment-Kinetik bei Meerschweinchen zu bewerten, wurden Gruppen von sechs Tieren mit 1 × 103 PFU (1 × 102 ID50) oder 1 × 106 PFU (1 × 105 ID50) der NL09 WT/VAR-Virusmischungen infiziert. Das Virusinokulum wurde intranasal in einem 300 μl-Volumen PBS verabreicht. An den Tagen 1–6 nach der Inokulation wurden Nasenspülungen durchgeführt und der Titer mittels Plaque-Assay bestimmt. Die virale Genotypisierung wurde an Proben durchgeführt, die an den Tagen 1, 2 und 3 oder 4 für jedes Meerschweinchen entnommen wurden. Tag 3 wurde für Tiere verwendet, die die höhere Dosis erhielten, da das Virus in diesem System schnell beseitigt wird und die Ausscheidung am Tag 4 aufgehört hat.

Es wurden 20 Wochen alte weibliche Frettchen von Triple F Farms (Gillett, PA) verwendet. Alle Frettchen waren vor der Infektion im Anti-Nukleoprotein-(Anti-NP)-Influenzavirus-Enzym-Immunosorbens-Assay, Swine Influenza Virus Ab Test, (IDEXX, Westbrook, ME) seronegativ. Fünf Tage vor dem Experiment wurden die Frettchen sediert und ein subkutaner Transponder (Bio Medic Data Systems, Seaford, Delaware) implantiert, um jedes Tier zu identifizieren und Temperaturwerte zu liefern. Anästhetika wurden durch intramuskuläre Injektion mit Ketamin (20 mg kg−1) und Xylazin (1 mg kg−1) verabreicht. Infektionen wurden durch intranasale Inokulation von 1 ml in PBS verdünntem Virus durchgeführt. Die Nasenspülungen bei Frettchen wurden wie folgt durchgeführt. Frettchen wurden anästhesiert und 1 ml PBS wurde in die Nase verabreicht, um das Niesen auszulösen. Die ausgestoßene Flüssigkeit wurde in Petrischalen gesammelt und die Proben wurden in einem zusätzlichen Volumen von 1 ml PBS gesammelt. Infizierte Frettchen wurden täglich auf klinische Symptome, Temperatur und Gewichtsverlust überwacht. Frettchen wurden durch intravenöse Injektion von 1 ml Beuthanasia-D, 1:1 mit entionisiertem Wasser verdünnt (Merck, Madison, NJ), eingeschläfert.

Zur Bestimmung der Frettchen-ID50 wurden sechs Gruppen zu je vier Frettchen mit steigenden Dosen der NL09 WT/VAR-Virusmischung (1 × 100,1 PFU, 1 × 100 PFU, 1 × 101 PFU, 1 × 102 PFU, 1 × 103 PFU) inokuliert und 1 × 104 PFU). Nasenspülungen wurden bis zu 6 Tage lang täglich gesammelt und mittels Plaque-Assay auf Virusausscheidung titriert. Der Frettchen-ID50 wurde auf der Grundlage der am Tag 2 erhaltenen Ergebnisse bestimmt und entsprach 3,2 × 102 PFU.

Zur Analyse der Reassortierungshäufigkeit und zum Nachweis viraler Antigene in Geweben wurden Frettchen mit 3,2 × 104 PFU (1 × 102 ID50) oder 3,2 × 107 PFU (1 × 105 ID50) inokuliert. Nach Infektionen wurden bis zu 6 Tage lang täglich Nasenspülungen gesammelt und mittels Plaque-Assay titriert. Die virale Genotypisierung wurde an Proben durchgeführt, die an den Tagen 1, 3 und 5 für jedes Frettchen gesammelt wurden. An den Tagen 1–4 wurden Autopsien zur Entnahme von Nasenmuschel- und Lungengewebe durchgeführt. Von jedem Frettchen wurde ein einzelner Lungenlappen (der linke Schwanzlappen) entnommen. Für die Virologie gesammelte Gewebeschnitte wurden in 1 ml sterilem PBS unter Verwendung des TissueLyser LT (Qiagen, Germantown, MD) bei 30 Hz zweimal für 5 Minuten in Mikrozentrifugenröhrchen mit 3-mm-Wolframkarbidperlen (Qiagen, St. Louis, MO) aufgeschlossen. . Die Überstände wurden durch Zentrifugation geklärt und bis zur Virustitration bei –80 ° C eingefroren. Für die Histologie wurden die Gewebe in 10 % gepuffertes Formalin (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) getaucht und bis zur Auswertung bei Raumtemperatur gelagert.

Die Schweinestudie wurde am Large Animal Research Center (einer Einrichtung der Biosicherheitsstufe 2+) an der Kansas State University gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung landwirtschaftlicher Tiere in Forschung und Lehre des US-Landwirtschaftsministeriums durchgeführt. Um die Reassortierung des Virus und das virale Antigen in Geweben zu bestimmen, wurden 18 4 Wochen alte gekreuzte Schweine vom Typ Influenza H1 und H3 sowie seronegative geschlechtsgemischte Schweine des Reproduktions- und Atemwegssyndroms zufällig in Gruppen eingeteilt. Jedes Schwein wurde mit 2 × 106 PFU der NL09 WT/VAR-Mischung sowohl intranasal als auch intratracheal geimpft (106 PFU wurden in einem 1-ml-Volumen auf jedem dieser beiden Wege verabreicht) unter Anästhesie, wie zuvor beschrieben54. Die klinischen Symptome aller Versuchsschweine wurden während des gesamten Experiments täglich überwacht. Bei jedem Schwein wurden 1, 3, 5 und 7 Tage nach der Infektion Nasenabstriche entnommen. Drei infizierte Schweine wurden 3, 5 und 7 Tage nach der Infektion eingeschläfert. Während der Autopsie wurden Nasenmuschel-, Luftröhren- und Lungengewebe aus sieben Lappen jedes Schweins zur Virusisolierung bei –80 °C eingefroren und zur IHC-Untersuchung in 10 % gepuffertem Formalin fixiert.

Die Reassortierungshäufigkeiten wurden durch Genotypisierung von 21 klonalen Virusisolaten pro Probe wie zuvor beschrieben50 bewertet. Diese Analyse wurde auf Nasenspülungen von Meerschweinchen, Nasenspülungen von Frettchen, Nasenabstrichen von Schweinen, Gewebehomogenaten von Frettchen und Gewebehomogenaten von Schweinen angewendet. Die zu untersuchenden Zeitpunkte wurden basierend auf der Positivität aller Tiere in einer Behandlungsgruppe ausgewählt. Daher wurden Nasenspülproben vom 1., 2., 3. oder 4. Tag von Meerschweinchen ausgewertet, während die Proben vom 1., 3. und 5. Tag von Schweinen und Frettchen ausgewertet wurden. An den Tagen 1, 2, 3 und 4 gesammeltes Frettchengewebe und an den Tagen 3 und 5 gesammeltes Schweinegewebe wurden analysiert.

Kurz gesagt wurden Plaque-Assays an MDCK-Zellen in 10-cm-Schalen durchgeführt, um Virusklone zu isolieren. Serologische Pipetten (1 ml) wurden verwendet, um Agarpfropfen in 160 μl PBS zu sammeln. Unter Verwendung eines ZR-96-Virus-RNA-Kits (Zymo) wurde RNA aus den Agarpfropfen extrahiert und in 40 μl nukleasefreiem Wasser (Invitrogen) eluiert. Die reverse Transkription wurde mit Maxima Reverse Transkriptase (RT; ThermoFisher) gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Die resultierende cDNA wurde 1:4 in nukleasefreiem Wasser verdünnt und jede cDNA wurde mit segmentspezifischen Primern (Supplementary Data 3)24,31 kombiniert, die zur Amplifikation einer Region von etwa 100 Basenpaaren entwickelt wurden. Das Amplikon für jedes Segment enthält die Stelle der einzelnen Nukleotidveränderung im VAR-Virus. Die quantitative PCR wurde mit Precision Melt Supermix (Bio-Rad) unter Verwendung eines CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) durchgeführt. Quantitative PCR-Daten wurden mit CFX Manager Software v2.1 (Bio-Rad) gesammelt. Auf die Template-Amplifikation folgte eine hochauflösende Schmelzanalyse, um die WT- und VAR-Amplifikate zu unterscheiden55. Die Precision Melt Analysis-Software v1.2 (Bio-Rad) wurde verwendet, um den elterlichen Ursprung jedes Gensegments basierend auf den Schmelzeigenschaften der cDNA-Amplifikate im Vergleich zu WT- und VAR-Kontrollen zu bestimmen. Jeder Plaque wurde ein Genotyp zugewiesen, der auf der Kombination von WT- und VAR-Genomsegmenten basierte, wobei zwei Varianten auf jedem der acht Segmente 256 potenzielle Genotypen ermöglichten.

Gewebeproben aus den Nasenmuscheln von Frettchen, dem rechten kaudalen Lungenlappen von Frettchen und allen sieben Lungenlappen von Schweinen wurden mindestens 24 Stunden lang in 10 % neutral gepuffertem Formalin fixiert, bevor sie in Paraffin eingebettet wurden. Die Nasenmuscheln wurden vor der Einbettung in Paraffin entkalkt. Von allen Geweben wurden Schnitte geschnitten und Objektträger hergestellt. Die Gewebe wurden entparaffiniert, indem die Objektträger 45 Minuten lang auf einem Objektträgerwärmer auf 60 °C erwärmt und anschließend 25 Minuten lang in Xylol (Sigma) getaucht wurden. Anschließend wurden die Objektträger 10 Minuten lang in 100 %iges Ethanol, 10 Minuten lang in 95 %iges Ethanol und 5 Minuten lang in 70 %iges Ethanol getaucht. Anschließend wurden die Objektträger gewaschen, indem sie eine Stunde lang in entionisiertes Wasser gelegt wurden. Die Antigengewinnung erfolgte durch 45-minütiges Dämpfen der Objektträger in 10 mM Zitronensäure, pH 6,0, gefolgt von 5-minütigem Waschen in Leitungswasser und 1 × PBS (Corning). Die WT- und VAR-Viren wurden in den Geweben mit einem Maus-Anti-HA-Alexa-Fluor-488-Gerät (Invitrogen-Katalognummer A-21287; Klon 16B12; 1:50-Verdünnung) und einem Maus-Anti-Hi-Alexa-Fluor-555-Gerät (Invitrogen-Katalognummer MA1-135) nachgewiesen. A555; Klon 4E3D10H2/E3; 1:50-Verdünnung), während Epithelzellränder mit Kaninchen-Anti-Na+K+-ATPase Alexa Fluor 647 (Abcam-Katalognummer 198367; Klon EP1845Y; 1:100-Verdünnung) bei 4 °C über Nacht gefärbt wurden. Die Objektträger wurden dreimal in 1× PBS (Corning) und einmal in entionisiertem Wasser gewaschen, um überschüssigen Antikörper zu entfernen. Die Objektträger wurden mit dem Eindeckmedium ProLong Diamond Anti Fade (ThermoFisher) auf Glasdeckgläser montiert. Die Bilder wurden mit einem Konfokalmikroskop Olympus FV1000 bei 60-facher Vergrößerung unter einem Ölimmersionsobjektiv aufgenommen. Die Spezifität der Antikörper wurde durch 24-stündige Infektion von MDCK-Zellen mit entweder NL09 WT, NL09 VAR oder beiden Viren bestätigt. Die Zellen wurden mit 4% Paraformaldehyd (Alfa Aesar) fixiert und mit den oben beschriebenen Antikörpern auf HA- und His-Tags gefärbt (ergänzende Abbildung 9).

Für die morphologische Analyse mittels IHC wurden die Objektträger 15 Minuten lang in Puffer mit pH 9,0 bei 110 °C vorbehandelt. Die Blockierung erfolgte mit Wasserstoffperoxid für 20 Minuten, gefolgt von PowerBlock (BioGenex) für 5 Minuten. Die Objektträger wurden dreimal mit PBS gewaschen und das NP-Antigen wurde unter Verwendung eines polyklonalen Ziegen-Anti-Influenza-NP-Antikörpers (Abcam-Katalognummer ab155877; 1:1000-Verdünnung) 1 Stunde lang nachgewiesen. Die Objektträger wurden dreimal mit PBS gewaschen, um überschüssige Antikörper zu entfernen, und mit einem biotinylierten Kaninchen-Anti-Ziegen-IgG (Vector Laboratories-Katalognummer BA-5000; 1:5000-Verdünnung) 10 Minuten lang inkubiert. Nach dem Waschen wurde 10 Minuten lang 4Plus Alkaline Phosphatase Label (BioCare Medical) hinzugefügt. Das Antigensignal wurde durch 10-minütige Inkubation der Objektträger in Chromogen IP Warp Red-Färbung (BioCare Medical) nachgewiesen. Nach der Antigenfärbung wurde eine Hämatoxylin-Gegenfärbung durchgeführt.

Die Zahlen wurden mit Python 3 v3.1056 und den Paketen matplotlib v3.6.057, NumPy v1.23.358, pandas v1.5.059 und seaborn v0.12.060 generiert. Simulationen wurden in Python 3 v3.10 durchgeführt.

Hier wird ein viraler Genotyp als eine einzigartige Kombination der acht IAV-Segmente definiert, wobei jedes Segment entweder von der Variante oder dem Wildtyp-Elternvirus abgeleitet ist; Daher gibt es 28 mögliche einzigartige Genotypen mit zwei Elterngenotypen und 254 reassortierten Genotypen. Für jede gegebene Probe kann die Häufigkeit jedes einzelnen Genotyps berechnet werden, indem die Anzahl des Auftretens jedes einzelnen Genotyps in der Probe durch die Gesamtzahl der für diese Probe erhaltenen klonalen Isolate dividiert wird.

Um die Verteilung einzigartiger Genotypen zu verstehen, müssen sowohl ungewichtete als auch gewichtete Genotyp-Häufigkeitsstatistiken verwendet werden. Der Genotypreichtum (\(S\)) berücksichtigt nicht die Genotyphäufigkeit und wird durch die Anzahl der eindeutigen Genotypen in einer Probe angegeben. Angesichts unserer Probengröße von 21 Plaque-Isolaten kann der Genotypreichtum bzw. die Anzahl der in einer Probe nachgewiesenen unterschiedlichen Genotypen von mindestens 1 (ein einzelner Genotyp wird 21 Mal nachgewiesen) bis maximal 21 (21 einzigartige Genotypen nachgewiesen) reichen. .

Die Diversität wurde mithilfe des Shannon-Weiner-Index (H) gemessen, der sowohl die Häufigkeit als auch die Gleichmäßigkeit der Erkennung von Genotypen berücksichtigt. In unserem Datensatz kann die Diversität zwischen 0 und 3,04 liegen. Die Shannon-Wiener-Diversität wurde wie folgt berechnet:

Dabei ist \(S\) der Genotypreichtum und \({p}_{i}\) die Häufigkeit des eindeutigen Genotyps \(i\) in der Probe (6).

Um herauszufinden, ob die Auswertung von 21 Plaques pro Probe für diese Analyse ausreichte, um belastbare Ergebnisse zur Genotyp-Diversität zu liefern, verwendeten wir eine Computersimulation, um die Empfindlichkeit der gemessenen Diversitätswerte gegenüber der Anzahl der untersuchten Plaques zu testen. In diesen Simulationen haben wir die Diversität in Proben berechnet, die durch zufällige Auswahl von n (aus den möglichen 21) Plaques ohne Ersatz erzeugt wurden. Bei jedem Probenahmeaufwand n simulierten wir 1000 Proben mit Plaque-Ersatz zwischen den Proben. Die Ergebnisse zeigen typischerweise, dass die Diversitätswerte mit zunehmendem n zunehmen, wobei die Werte asymptotieren, wenn sich n 21 nähert, was darauf hindeutet, dass weitere Erhöhungen von n die Ergebnisse nicht wesentlich verändern würden und die Verwendung von 21 Plaques bestätigen (ergänzende Abbildung 10).

Um zu beurteilen, inwieweit die räumliche Dynamik der viralen Reassortierung und Ausbreitung den Gesamtreichtum und die Diversität in einem Wirt beeinflusst, haben wir versucht, den beobachteten Reichtum und die Diversität an jedem anatomischen Ort mit dem zu vergleichen, der zu erwarten wäre, wenn sich das Virus frei zwischen anatomischen Orten bewegen würde . Um eine freie Vermischung innerhalb des Wirts zu simulieren, haben wir die beobachteten viralen Genotypen zufällig an allen Stellen in einem bestimmten Tier gemischt. Anschließend wurden der durchschnittliche Reichtum und der Shannon-Wiener-Index der simulierten Viruspopulationen an jedem Standort berechnet. Das 5. und 95. Perzentil für die simulierte Verteilung jedes Tieres wurden berechnet und mit der beobachteten Vielfalt und Vielfalt für jede der anatomischen Stellen verglichen. Wenn der beobachtete Reichtum und die Vielfalt eines Standorts unter das 5. Perzentil oder über das 95. Perzentil fallen, wird ein Hindernis für den Zu- oder Abfluss reassortierter Genotypen von oder zu den anderen Standorten vermutet.

Die Unähnlichkeit zwischen Populationen kann anhand der Beta-Diversität gemessen werden. Für diese Studie haben wir die Beta-Diversität aus der Perspektive des Reichtums bewertet, wobei wir uns auf die Unähnlichkeit der einzigartigen erkannten Genotypen konzentrierten und die Berücksichtigung ihrer Häufigkeit ausschlossen. Dieser Ansatz wurde verwendet, um die Auswirkungen der elterlichen WT- und VAR-Genotypen, die zum Zeitpunkt der Inokulation wahrscheinlich an allen anatomischen Stellen ausgesät waren, abzuschwächen. Wir berechnen die Beta-Diversität, indem wir die viralen Genotypen in zwei Lappen als zwei unterschiedliche Populationen behandeln:

wobei \({S}_{1+2}\) der Reichtum einer hypothetischen Population ist, die aus der Zusammenfassung der viralen Genotypen der beiden Lappen besteht, während \(\frac{1}{2}({S}_{1} +{S}_{2})\) repräsentiert den mittleren Reichtum der Lappen (7). Die Beta-Diversität eines einzelnen Vergleichs kann so normalisiert werden, dass sie von null bis eins reicht:

Dabei ist \({{BD}}_{{\max }}\) die Beta-Diversität, die unter der Annahme berechnet wird, dass es keine viralen Genotypen gibt, die beide Lappen gemeinsam haben (7). Ein \({{BD}}^{{\prime} }{\beta }_{n}\) näher an eins weist darauf hin, dass die Viruspopulationen der Lappen unterschiedlicher sind, während ein \({{BD}}^{{ \prime} }{\beta }_{n}\) näher bei Null deutet darauf hin, dass die Lappen ähnliche einzigartige virale Genotypen und einen ähnlichen viralen Gesamtreichtum aufweisen. Ein \({{BD}}^{{\prime} }\) \({\beta }_{n}\)von Null tritt auf, wenn alle einzigartigen Genotypen, die in einem Lappen vorhanden sind, auch im anderen vorhanden sind.

Um zu klären, ob die Auswertung von 21 Plaques pro Probe für diese Analyse ausreichte, um belastbare Ergebnisse zur Beta-Diversität zu liefern, verwendeten wir erneut Computersimulationen. Diese Simulationen wurden entwickelt, um die Empfindlichkeit der Beta-Diversitätswerte gegenüber der Anzahl der entnommenen Plaques zu testen. In diesen Simulationen haben wir erneut Plaque-Datenteilsätze generiert, indem wir zufällig n (aus den möglichen 21) Plaques ohne Ersatz ausgewählt haben. Bei jedem Probenahmeaufwand n simulierten wir 1000 Proben mit Plaque-Ersatz zwischen den Proben. Basierend auf diesen Teildatensätzen wurden dann Beta-Diversitätswerte bei einem bestimmten n berechnet. Die Ergebnisse zeigen typischerweise, dass sich die \({\beta }_{n}\)-Werte tendenziell stabilisieren, wenn n sich 21 nähert, was darauf hindeutet, dass weitere Erhöhungen von n die Ergebnisse nicht wesentlich verändern würden und die Verwendung von 21 Plaques bestätigen (ergänzende Abbildung 10). . In einer Untergruppe von Fällen, die die Nasenprobe von Schwein 5 betreffen, ist die Beziehung zwischen \({\beta }_{n}\) und n jedoch weniger stabil. Im scharfen Gegensatz zu den meisten anderen Proben von Schwein 5 waren an der Nasenstelle 20 WT-Elternisolate und ein VAR-Elternisolat zu finden. Im Lungengewebe wurden keine WT-Elterngenotypen festgestellt. Infolgedessen erhöht jede weitere Plaque-Entnahme aus der Nasenprobe die Wahrscheinlichkeit, das VAR-Virus nachzuweisen und somit eine Gemeinsamkeit zwischen dem Nasentrakt und einem der Lungenlappen festzustellen. In Situationen, in denen zwei Gewebestellen einen einzigen, relativ seltenen Genotyp gemeinsam haben, hat die Anzahl der entnommenen Plaques daher einen starken Einfluss auf die \({\beta }_{n}\)-Ergebnisse.

Um die freie Vermischung zwischen zwei Lappen zu simulieren, haben wir die Genotypen zwischen jeder der 28 paarweisen Kombinationen zwischen Schweinegeweben und der einzelnen Frettchenlunge-NT-Kombination zufällig gemischt und die \({{BD}}^{{\prime} }{\ beta }_{n}\) für jeden Vergleich. Das freie Mischen aller Kombinationen wurde 1000 Mal simuliert. Wir gingen davon aus, dass die Unähnlichkeitswerte am oberen Ende der simulierten Verteilung (>95. Perzentil) liegen würden, wenn im beobachteten Datensatz eine Kompartimentierung vorhanden wäre.

Perzentile wurden mit der Percentileofscore-Methode aus dem SciPy-Paket v1.9.159 berechnet. Gepaarte t-Tests und ANOVA-Tests wurden mit der Methode ttest_rel bzw. der Methode f_oneway aus dem SciPy-Paket v1.9.159 durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Für die Erstellung der Abbildungen verwendete Rohdaten. 1–5 und die ergänzenden Abbildungen 1–10 sind als Quelldaten und in den ergänzenden Daten 1–3 enthalten. Quelldaten werden in diesem Dokument bereitgestellt.

Der für Datenanalysen und Simulationen verwendete Code ist verfügbar unter: https://github.com/maxbagga/Influenza-A-virus-reassortment-in-mammals-gives-rise-to-spatially-distinct-sub-populations (https:/ /doi.org/10.5281/zenodo.7150566)61.

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Wir danken Shamika Danzy für ihre technische Unterstützung. Wir möchten der Emory Division of Animal Resources für ihre Unterstützung bei den Meerschweinchenexperimenten danken. Wir danken Rusty Ransburgh, Baoliang Zheng, Dongchang He, Abaineh Endalew, Daniel Madden und Yuekun Lang für ihre Unterstützung bei den Schweineversuchen. Wir danken David VanInsberghe für seine Unterstützung bei der Figurenerstellung. Dieses Projekt wurde vom Integrated Cellular Imaging Microscopy Core der Emory University unterstützt. Die Forschung wurde von NIH R01 AI127799 (ACL) und den NIH/NIAID Centers of Excellence in Influenza Research and Response (CEIRR) finanziert, Vertragsnummern 75N93021C00017 (ACL, KK), 75N93021C00014 (DRP) und 75N93021C00016 (JAR, WM) und der AMP Core des Center of Emerging and Zoonotic Infectious Diseases (CEZID) von NIGMS unter der Auszeichnungsnummer P20GM130448 (JAR).

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Anish Bagga

Abteilung für Bevölkerungsgesundheit, College of Veterinary Medicine, University of Georgia, Athens, GA, USA

Silvia Carnaccini, Lucas M. Ferreri, Ginger Geiger, C. Joaquin Caceres, Brittany Seibert und Daniel R. Perez

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Abteilung für Veterinärpathobiologie und Abteilung für Molekulare Mikrobiologie und Immunologie, University of Missouri, Columbia, MO, USA

Liping Wang & Wenjun Ma

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Wenjun Ma & Jürgen A. Dir

Das Zentrum für Forschung zur Influenza-Pathogenese und -Übertragung (CRIPT CEIRR), New York, NY, USA

Daniel R. Perez

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Katia Kölle

Emory Center of Excellence for Influenza Research and Response (Emory-CEIRR), Atlanta, GA, USA

Katia Koelle & Anice C. Lowen

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KG trug zur Konzeption der Arbeit, zum experimentellen Design, zur Datenerfassung und -analyse sowie zur Interpretation von Daten bei; AB trug zur Datenanalyse, Modellentwicklung und Interpretation von Daten bei; SC trug zur experimentellen Gestaltung, Datenerfassung und Dateninterpretation bei; LMF, GG, CJC, BS, YL, LW, TK, YL und IM trugen zur Datenerfassung bei; WM, JAR und DRP trugen zur Konzeption der Arbeit, zum experimentellen Design, zur Datenanalyse und zur Interpretation bei; KK war an der Konzeption der Arbeit, Datenanalyse und Interpretation beteiligt; ACL trug zur Konzeption der Arbeit, zum experimentellen Design sowie zur Datenanalyse und -interpretation bei. Alle Autoren haben zum Verfassen des Manuskripts beigetragen.

Korrespondenz mit Anice C. Lowen.

Das JAR-Labor erhielt außerhalb der gemeldeten Arbeiten Unterstützung von Tonix Pharmaceuticals, Xing Technologies und Zoetis. JAR ist Erfinder von Patenten und Patentanmeldungen zur Verwendung von Virostatika und Impfstoffen zur Behandlung und Vorbeugung von Virusinfektionen und gehört der Kansas State University, Kansas. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Communications dankt Richard Webby und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Ganti, K., Bagga, A., Carnaccini, S. et al. Die Reassortierung des Influenza-A-Virus bei Säugetieren führt zu genetisch unterschiedlichen Subpopulationen innerhalb des Wirts. Nat Commun 13, 6846 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34611-z

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Eingegangen: 18. Februar 2022

Angenommen: 31. Oktober 2022

Veröffentlicht: 11. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-34611-z

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